張 珂，張開(kāi)炯，吳立春，陳 莉

四川省腫瘤醫(yī)院·研究所/四川省癌癥防治中心/電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院：1.輸血科；2.檢驗(yàn)科，四川成都 610041

乳腺癌是全球女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居第一[1]。世界衛(wèi)生組織2020年最新癌癥報(bào)告顯示，乳腺癌新增人數(shù)達(dá)226萬(wàn)，正式取代肺癌成為全球第一大癌癥。盡管近年來(lái)乳腺癌的治療方法已有很大改善，但由于個(gè)體差異，預(yù)后仍然不理想[2]。因此，有必要找到敏感而精確的生物標(biāo)志物，以更好地預(yù)測(cè)乳腺癌患者的生存和預(yù)后。微小RNA(miRNA)是一種由21～23個(gè)核苷酸組成的高度保守的內(nèi)源性短鏈非編碼RNA分子[3]?，F(xiàn)已證明miRNA可靶向超過(guò)60%的人類(lèi)基因[4]，幾乎參與了每個(gè)生物學(xué)過(guò)程，包括發(fā)育，血管生成，細(xì)胞分化、增殖、存活、侵襲、凋亡，傷口愈合和免疫細(xì)胞功能等[5]。既往研究證實(shí)，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和患者存活中起重要作用，其能夠作為腫瘤的潛在治療工具和診斷生物標(biāo)志物[6-7]。近年來(lái)，許多集中于乳腺癌miRNA表達(dá)譜的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在預(yù)測(cè)患者預(yù)后中已顯示出巨大希望[8]。然而，miRNA在乳腺癌中的生物學(xué)功能仍不為人所知，為提高乳腺癌預(yù)后的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，仍需要系統(tǒng)地研究多種miRNA的表達(dá)，利用整體的危險(xiǎn)評(píng)分進(jìn)行預(yù)后評(píng)價(jià)。因此，鑒定出更強(qiáng)大和實(shí)用的miRNA信號(hào)具有重要的臨床意義。本研究通過(guò)開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證基于癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)的miRNA預(yù)后模型，并進(jìn)一步系統(tǒng)地評(píng)估該模型對(duì)乳腺癌患者總體生存的預(yù)測(cè)價(jià)值，以明確miRNA作為乳腺癌預(yù)后生物標(biāo)志物的可靠性。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來(lái)源 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù) (https://portal.gdc.cancer.gov/)下載1 086例乳腺癌組織和804例正常組織的miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)和臨床信息。

1.2方法

1.2.1差異表達(dá)miRNA篩選 采用R語(yǔ)言edgeR程序包篩選腫瘤組織與正常組織之間差異表達(dá)的miRNA，以FDR<0.05和log2|fold change|>1作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2預(yù)后相關(guān)miRNA篩選 將1 086例乳腺癌患者表達(dá)矩陣和臨床信息進(jìn)行清洗，剔除連續(xù)表達(dá)量低的數(shù)據(jù)，將清洗后剩余的1 033例乳腺癌患者按照7∶3比例分為訓(xùn)練組(723例)與驗(yàn)證組(310例)，首先使用R程序包survival進(jìn)行單因素Cox回歸分析，其次采用glmnet程序包進(jìn)行LASSO回歸分析，再次使用survival包進(jìn)行逐步多因素Cox回歸分析，以赤池信息準(zhǔn)則(AIC)為準(zhǔn)，選取AIC信息統(tǒng)計(jì)量最小的模型為最終模型，以P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，P<0.05說(shuō)明該變量為獨(dú)立的預(yù)后影響因素。

1.2.3miRNA風(fēng)險(xiǎn)模型構(gòu)建與驗(yàn)證 將單因素Cox回歸分析與LASSO回歸分析篩選出的miRNA進(jìn)行逐步多因素Cox回歸分析，建立預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)得分中值將訓(xùn)練組的患者分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組，使用Kaplan-Meier計(jì)算高低風(fēng)險(xiǎn)組患者之間的生存差異。使用R軟件包survival 受試者工作特征(ROC)曲線(xiàn)計(jì)算模型1年、3年和5年的曲線(xiàn)下面積(AUC)。將訓(xùn)練組構(gòu)建的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型納入驗(yàn)證組進(jìn)行驗(yàn)證，并計(jì)算高低風(fēng)險(xiǎn)組患者之間生存差異和模型1年、3年和5年的AUC。

2 結(jié) 果

2.1乳腺癌差異表達(dá)miRNA篩選 共發(fā)現(xiàn)269個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中204個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，65個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。

2.2乳腺癌總體生存相關(guān)miRNA篩選 單因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，35個(gè)miRNA與乳腺癌總體生存相關(guān)。進(jìn)一步通過(guò)LASSO回歸分析發(fā)現(xiàn)，以最小λ值作為篩選準(zhǔn)則，篩選出18個(gè)miRNA與乳腺癌患者總體生存相關(guān)。逐步多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，8個(gè)miRNA(hsa-miR-3923、hsa-miR-105-2、hsa-miR-3927、hsa-miR-449c、hsa-miR-106a、hsa-miR-1262、hsa-miR-605和hsa-miR-3929)與乳腺癌患者總體生存情況相關(guān)。

2.3乳腺癌miRNA預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的構(gòu)建 基于逐步多因素Cox回歸分析篩選出的8個(gè)miRNA，將每個(gè)miRNA的多因素Cox回歸系數(shù)和每個(gè)miRNA的表達(dá)值構(gòu)建了1個(gè)由8個(gè)miRNA組成的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型：風(fēng)險(xiǎn)得分=0.361×hsa-miR-3923+0.097×hsa-miR-105-2+0.724×hsa-miR-3927-0.333×hsa-miR-449c-0.232×hsa-miR-106a-0.366×hsa-miR-1262+0.288×hsa-miR-605+0.979×hsa-miR-3929，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)得分中位值將訓(xùn)練組患者分為高低風(fēng)險(xiǎn)兩組(圖1A)，結(jié)果顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組患者的總體生存率明顯低于低風(fēng)險(xiǎn)組患者(P<0.001)；ROC曲線(xiàn)分析顯示，風(fēng)險(xiǎn)模型1年、3年和5年的AUC分別為0.779、0.688和0.728(圖1B)。

注：A為訓(xùn)練組高低風(fēng)險(xiǎn)組Kaplan-Meier生存曲線(xiàn);B為訓(xùn)練組采用ROC曲線(xiàn)評(píng)估預(yù)測(cè)模型1年、3年和5年的預(yù)測(cè)效能。

2.4乳腺癌miRNA預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的驗(yàn)證 在驗(yàn)證組中低風(fēng)險(xiǎn)組患者的總體生存率顯著高于高風(fēng)險(xiǎn)組(P<0.05,圖2A)，風(fēng)險(xiǎn)模型1年、3年和5年的AUC分別為0.777、0.768和0.806(圖2B)。

注：A為驗(yàn)證組高低風(fēng)險(xiǎn)組Kaplan-Meier生存曲線(xiàn);B為驗(yàn)證組采用ROC曲線(xiàn)評(píng)估預(yù)測(cè)模型1年、3年和5年的預(yù)測(cè)效能。

3 討 論

目前，越來(lái)越多的研究表明，差異表達(dá)的miRNA與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其可作為乳腺癌診斷、預(yù)后判斷和治療的潛在生物標(biāo)志物[9-10]。與單個(gè)生物標(biāo)志物相比，多個(gè)生物標(biāo)志物的綜合判別可以提高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。本研究先后通過(guò)單因素Cox、LASSO回歸和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸，確定了8個(gè)miRNA(hsa-miR-3923、hsa-miR-105-2、hsa-miR-3927、hsa-miR-449c、hsa-miR-106a、hsa-miR-1262、hsa-miR-605和hsa-miR-3929)可作為乳腺癌獨(dú)立的預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)。然后，根據(jù)它們的表達(dá)譜和回歸系數(shù)構(gòu)建了一個(gè)由8個(gè)miRNA組成的風(fēng)險(xiǎn)模型，并用于預(yù)測(cè)乳腺癌患者的總體生存率。為了明確所構(gòu)建模型預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值的可靠性，本研究設(shè)置了訓(xùn)練組和驗(yàn)證組兩個(gè)獨(dú)立的研究隊(duì)列。在訓(xùn)練組中，根據(jù)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)表明兩組患者的總體生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，高風(fēng)險(xiǎn)組患者的總體生存率明顯低于低風(fēng)險(xiǎn)組患者。ROC曲線(xiàn)分析顯示，miRNA模型在預(yù)測(cè)乳腺癌患者存活風(fēng)險(xiǎn)方面具有較高的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，可作為預(yù)測(cè)乳腺癌患者預(yù)后的可靠生物標(biāo)志物。

在既往的研究中，研究者主要通過(guò)單個(gè)基因和通路的分析探究miRNA作為乳腺癌或其他腫瘤的生物標(biāo)志物的價(jià)值[11-12]。例如，LI等[11]發(fā)現(xiàn)，miR-106b-5p和miR-93-5p在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平增高，其高表達(dá)可抑制抑癌基因PTEN的表達(dá)水平，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖，同時(shí)增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)途徑的活性；ZHAO等[12]通過(guò)多變量分析發(fā)現(xiàn)，miR-106a是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)患者總體生存的獨(dú)立預(yù)后生物標(biāo)志物，可用于預(yù)測(cè)單個(gè)GBM患者的預(yù)后和治療反應(yīng)。BERTOLI等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與單個(gè)miRNA相比，循環(huán)體液中多個(gè)miRNA圖譜顯示出更好的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)性能以及更高的靈敏度。因此，多基因多模型綜合分析在腫瘤診斷和治療中顯得尤為重要。

近年來(lái)，亦有研究者將多基因綜合分析用于腫瘤診斷和預(yù)后分析。WANG等[14]通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了由4個(gè)miRNA(hsa-miR-126，hsa-miR-3613，hsa-miR-424和hsa-miR-4772)組成的用于預(yù)測(cè)胰腺腺癌(PAAD)總體生存率的模型，該模型2年生存率AUC為0.789，其可作為預(yù)測(cè)PAAD患者生存的有效獨(dú)立預(yù)后生物標(biāo)志物。SIRIWARDHANA等[15]采用單因素Cox和逐步多因素Cox回歸篩選出5個(gè)miRNA(miR-375，miR-582-3p，miR-326，miR-181c-5p和miR-99a-5p)用于肺腺癌預(yù)后模型的構(gòu)建，其模型可作為預(yù)測(cè)肺腺癌預(yù)后的可靠工具。最近，LUO等[16]采用LASSO Cox的方法篩選出包括miR130b，miR-18a和miR-223在內(nèi)的3個(gè)miRNA。根據(jù)3個(gè)miRNA特征性危險(xiǎn)評(píng)分的最佳臨界值，將所有患者分為高危組和低危組。兩組患者的生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)，并且3個(gè)miRNA標(biāo)志物具有良好的預(yù)后預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，可作為腎透明細(xì)胞癌獨(dú)立的預(yù)后預(yù)測(cè)因素。這些結(jié)果表明，多基因模型的構(gòu)建在腫瘤預(yù)后的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性方面具有重要意義。

盡管本研究構(gòu)建了由8個(gè)miRNA組合的預(yù)后分子標(biāo)志物，其在乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)中具有良好的準(zhǔn)確性和可靠性，顯示了其可作為乳腺癌預(yù)后生物標(biāo)志物的巨大潛能，但也存在一些局限性。首先，雖然本研究設(shè)置了驗(yàn)證組以驗(yàn)證所構(gòu)建模型的可靠性，但沒(méi)有進(jìn)行臨床試驗(yàn)；第二，本研究所構(gòu)建的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型雖然能夠明顯區(qū)分高低風(fēng)險(xiǎn)組，但1年、3年和5年風(fēng)險(xiǎn)得分的AUC僅能達(dá)到75%左右，其預(yù)測(cè)效能欠佳。后續(xù)研究將進(jìn)一步納入該8個(gè)miRNA進(jìn)行臨床驗(yàn)證，同時(shí)納入其他數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能分析和探究。

綜上所述，本研究構(gòu)建了1個(gè)由8個(gè)miRNA組成的與乳腺癌患者總體生存顯著相關(guān)的預(yù)測(cè)模型，可以從高預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)的患者中準(zhǔn)確識(shí)別出低預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)的患者，并在驗(yàn)證組中評(píng)估了該模型的準(zhǔn)確性和可靠性。這些結(jié)果表明，整合的8個(gè)miRNA組合可以作為預(yù)測(cè)乳腺癌患者預(yù)后的潛在標(biāo)志物。