韓忠耀,文朝旭,李 燕,蒙慧彤,鄧先擴(kuò),胡志平,盧 洋,田 浩,王萬樂

(1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)系,都勻 558000;2.遵義醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院,遵義 563006)

水冬瓜葉為山茱萸科植物有齒鞘柄木[Toricellia Angulata Oliv.var.intermedia(Harms)Hu]的干燥葉[1],具有較高的藥用價(jià)值[2-3],為貴州省少數(shù)民族用藥。水冬瓜葉主要含有紫丁香苷、金絲桃苷、異槲皮苷、熊果酸、7-羥基-6-甲氧基香豆素等化學(xué)成分[4-9],具有抗炎鎮(zhèn)痛[10-11]、免疫調(diào)節(jié)[12-13]等生物活性。其中,金絲桃苷、異槲皮苷等為水冬瓜葉中主要指標(biāo)性的化學(xué)成分,對評價(jià)苗藥水冬瓜葉品質(zhì)具有重要參考價(jià)值。

金絲桃苷和異槲皮苷的測定方法主要為高效液相色譜法,該方法檢測較耗時(shí)、費(fèi)力。因此,建立快速檢測水冬瓜葉中金絲桃苷和異槲皮苷含量的方法意義重大。近紅外光譜法(NIR)是近年來發(fā)展迅速、應(yīng)用較為廣泛的一種檢測新技術(shù),該方法具有分析快速、操作簡便、無損、綠色等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于食品[14-15]、林產(chǎn)工業(yè)[16-18]、煙草[19-20]、醫(yī)藥[21-23]等領(lǐng)域。NIR 不僅可用于離線建模以實(shí)現(xiàn)快速檢測,還可在醫(yī)藥、食品、煙草等工業(yè)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)在線實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)快速監(jiān)測,有利于產(chǎn)品質(zhì)量的快速評價(jià)。

目前水冬瓜葉的相關(guān)研究主要集中在質(zhì)量控制[4]、生藥學(xué)鑒定及真?zhèn)舞b別[16]等方面,采用NIR研究水冬瓜葉的報(bào)道較少,尚未發(fā)現(xiàn)其在測定水冬瓜葉中金絲桃苷和異槲皮苷含量方面的應(yīng)用。因此,本工作采用NIR 建立了穩(wěn)定性高、預(yù)測精度較高的苗藥水冬瓜葉中金絲桃苷和異槲皮苷含量快速分析模型,并應(yīng)用于實(shí)際樣品中金絲桃苷和異槲皮苷含量的預(yù)測,以期為貴州特色民族藥水冬瓜葉的質(zhì)量控制及快速檢測提供方法參考,也為該藥材品質(zhì)的快速評價(jià)提供新思路。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Luminar 5030型聲光可調(diào)濾光器近紅外光譜儀,主要部件包括光學(xué)部分、控制部分、電源適配器,軟件包括SNAP 光譜處理軟件;The Unscrambler化學(xué)計(jì)量學(xué)分析軟件;Agilent 1260型高效液相色譜(HPLC)儀,配二極管陣列檢測器;PX125DZH 型電子天平;KQ3200型超聲儀;WK-1000A 型高速粉碎機(jī)。

混合對照品溶液:分別取適量金絲桃苷、異槲皮苷對照品,用甲醇溶解并定容至50 mL,配制成金絲桃苷、異槲皮苷質(zhì)量濃度分別為0.041 0,0.052 0 g·L－1的混合對照品溶液。

金絲桃苷對照品批號為111521-201809,純度為94.9%;異槲皮苷對照品批號為CHB180628,純度不小于98%。

乙腈為色譜純;其他所用試劑均為分析純;試驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

水冬瓜葉藥材(S1～S106),均采自于貴州省都勻市經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)大坪鎮(zhèn),經(jīng)度為107°38′33″E,緯度為26°13′46″N,海拔為675 m,其中S1～S90為校正集樣品,S91～S106為驗(yàn)證集樣品。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 NIR 條件

開機(jī)預(yù)熱時(shí)間0.5 h;掃描次數(shù)300次;波長范圍1 100～2 300 nm;波長增量2 nm;測量方式為透射;增益調(diào)節(jié)×1;樣品類型為int.Ref.;數(shù)據(jù)格式為透過率;掃描方式為比率模式。

1.2.2 HPLC條件

Agela Promosil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱溫35℃;流動(dòng)相A 為0.2%(體積分?jǐn)?shù))磷酸溶液,B為乙腈;流量1.0 mL·min－1。梯度洗脫程序:0～10.0 min時(shí),A 由87%降至81%;10.0～20.0 min時(shí),A 由81%降至55%;20.0～22.0 min時(shí),A 由55%降 至30%,保 持3.0 min;25.0～25.1 min時(shí),A 由30%跳轉(zhuǎn)至87%;25.1～30.0 min時(shí),A 為87%。

1.3 試驗(yàn)方法

將水冬瓜葉粉碎后過4 號篩(250 μm±9.9μm),取約1.0 g樣品于具塞錐形瓶中,加甲醇100 mL,稱取質(zhì)量。在90 ℃水浴中回流提取1 h,冷卻后再次稱取質(zhì)量,并用甲醇補(bǔ)足減失量。過濾,濾液按照NIR 儀器工作條件測定。另取適量濾液過0.45μm 濾膜,濾液按HPLC 儀器工作條件測定,所得測定值即為參考值。

1.4 建模和模型評價(jià)

將1.3 節(jié)得到的金絲桃苷和異槲皮苷的NIR原始光譜圖分別用SNAP 光譜處理軟件中的S-G first derivative(一階微分法)和SNV-Smoothing(標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量交換法-平滑法)進(jìn)行預(yù)處理。用偏最小二乘法(PLS)在1 100～2 300 nm 和1 100～1 400 nm 波段內(nèi)建模,并采用三維空間分布值(Influence)和線性相關(guān)性(Correlation)統(tǒng)計(jì)量對照檢驗(yàn),剔除模型中的異常值(Outlier)。所建模型性能用相關(guān)系數(shù)(R)、校正均方根誤差(RMSEC)、預(yù)測均方根誤差(RMSEP)、預(yù)測相對偏差(RSEP)評價(jià)。

2 結(jié)果與討論

2.1 預(yù)處理方法的選擇

受光的散射、雜散光及儀器響應(yīng)等影響,原始光譜中冗余信息和噪聲信號干擾較大,在定量分析前,需要選擇合適的方法對原始光譜進(jìn)行預(yù)處理。以苗藥水冬瓜葉中金絲桃苷和異槲皮苷含量為待測對象,試驗(yàn)考察了預(yù)處理方法分別為SNV(標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量交換法)、SNV-Smoothing、Add constant(加常法)、Add constant-Smoothing(加常-平滑法)、S-G first derivative時(shí)對所建模型性能的影響,結(jié)果見表1。

表1 預(yù)處理前后模型評價(jià)結(jié)果Tab.1 Evaluation results for model before and after pretreatment

表1(續(xù))

由表1可知:原始光譜圖經(jīng)預(yù)處理后,R增大,RMSEC、RMSEP、RSEP均減小,模型性能變好;當(dāng)預(yù)處理方法分別為SNV-Smoothing 和S-G first derivative時(shí),金絲桃苷模型的R較高,RMSEC、RMSEP、RSEP較小或與其他方法的接近。綜合考慮,試驗(yàn)分別采用SNV-Smoothing 和S-G first derivative對金絲桃苷和異槲皮苷的原始光譜圖進(jìn)行預(yù)處理。

2.2 建模波段的選擇

為進(jìn)一步降低冗余信息及噪聲干擾,克服近紅外光譜吸收帶重疊造成的影響,并提取有效信息,需要對建模波段進(jìn)行篩選。試驗(yàn)比較了以不同波段建模時(shí)模型的性能,所得RMSEC、RMSEP、RSEP 等結(jié)果見表2。

表2 以不同波段建模時(shí)模型的評價(jià)結(jié)果Tab.2 Evaluation results for models when modeling in different wavelength zones

由表2可知:金絲桃苷模型在1 100～2 300 nm波段、異槲皮苷模型在1 100～1 400 nm 波段時(shí),所得R較高,RMSEC、RMSEP 和RSEP 較小 或和其他波段的接近。綜合考慮,試驗(yàn)分別選擇在1 100～2 300 nm 和1 100～1 400 nm 波段建立金絲桃苷和異槲皮苷模型。

2.3 模型的建立和評價(jià)

在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下,以校正集樣品的紅外光譜數(shù)據(jù)和參考值建立金絲桃苷和異槲皮苷的模型,結(jié)果顯示:金絲桃苷模型的R為0.913 6,RMSEC為0.241 4,RMSEP為0.270 5,RSEP為0.177 5;異槲皮苷模型的R為0.907 7,RMSEC 為0.079 1,RMSEP為0.020 8,RSEP為0.033 9。

為評價(jià)建模效果,按照試驗(yàn)方法分析16批驗(yàn)證集樣品,所得NIR 原始光譜圖經(jīng)預(yù)處理分別導(dǎo)入金絲桃苷、異槲皮苷模型以對金絲桃苷和異槲皮苷含量進(jìn)行預(yù)測,所得結(jié)果見表3。

由表3可知:金絲桃苷和異槲皮苷的預(yù)測值與參考值的相對誤差分別為－2.8%～2.9%、－5.1%～5.9%,表明所建模型預(yù)測效果較好。

表3 金絲桃苷和異槲皮苷預(yù)測結(jié)果Tab.3 Prediction results of hyperin and isoquercitrin

采用The Unscrambler化學(xué)計(jì)量學(xué)分析軟件分別繪制金絲桃苷和異槲皮苷的參考值與預(yù)測值的相關(guān)圖,結(jié)果見圖1。

由圖1可知,2種目標(biāo)物預(yù)測值和參考值基本一致,相關(guān)系數(shù)大于0.988 0。

圖1 金絲桃苷和異槲皮苷預(yù)測值與參考值的相關(guān)圖Fig.1 Correlation diagrams between predicted values and reference values of hyperin and isoquercitrin

2.4 精密度試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法重復(fù)分析S1樣品6次,所得光譜圖經(jīng)預(yù)處理后代入2種目標(biāo)物的NIR模型,計(jì)算金絲桃苷和異槲皮苷預(yù)測值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果分別為2.7%,3.3%,表明方法精密度較好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法處理S1 樣品,所得濾液分別放置0,1,2,3,6,12 h,再用近紅外光譜儀分析,所得光譜圖經(jīng)預(yù)處理后代入金絲桃苷和異槲皮苷NIR模型,計(jì)算金絲桃苷和異槲皮苷預(yù)測值的RSD,結(jié)果分別為2.9%,3.4%,表明水冬瓜葉藥材樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

本工作基于金絲桃苷和異槲皮苷的NIR 光譜圖建立的模型來預(yù)測水冬瓜葉中這兩種物質(zhì)的含量,實(shí)現(xiàn)了對苗藥水冬瓜葉藥材的快速質(zhì)量評價(jià),可為苗藥水冬瓜葉藥材中金絲桃苷和異槲皮苷快速定量分析提供新方法與新思路。