張文華,謝 文,侯建波,張雅琴,汪 鵬,胡曉莉,徐敦明

(1.杭州海關技術中心,杭州 310016;2.浙江省檢驗檢疫科學技術研究院,杭州 310016;3.廈門海關技術中心,廈門 361026)

肉堿化學名稱為β-羥基-γ-三甲胺基丁酸(結構見圖1),是一種類氨基酸化合物。哺乳動物體內的肉堿可以通過賴氨酸及蛋氨酸天然合成,參與體內脂肪代謝生成能量的過程。肉堿中有1個手性碳原子,存在一對對映體,即右旋肉堿(D-肉堿)與左旋肉堿(L-肉堿)。

圖1 肉堿的化學結構Fig.1 Chemical structure of carnitine

兩種肉堿對映體的生物活性差異較大,其中D-肉堿沒有功效,大劑量使用會對人體健康產生危害[1],L-肉堿具有功效,是哺乳動物體內能量代謝必需的天然物質,可以促使脂肪轉化為能量。嬰兒體內L-肉堿合成能力較弱,無法滿足其正常代謝,因此需要在嬰幼兒配方乳粉中添加L-肉堿。目前,國內L-肉堿的合成方法多為肉堿外消旋體拆分法[2-4],但當將拆分程度不完全的L-肉堿添加至嬰幼兒配方乳粉中時,可能導致乳粉質量不達標,因此有必要建立一種拆分肉堿外消旋體和測定嬰幼兒配方乳粉中肉堿對映體含量的方法。

肉堿對映體的測定方法主要有高效液相色譜-串聯質譜法[5-8]、高效液相色譜法[9-12]、分光光度法[13-15]等。但這些方法通常存在有機試劑消耗量大、分離度差、分離時間長等問題。而新興的超高效合相色譜法(UPC2)通常以超臨界二氧化碳和少量有機溶劑(無水乙醇、甲醇等)的混合物為流動相,調節(jié)系統背壓、色譜柱溫度及有機溶劑的比例使流動相的密度和極性發(fā)生改變,從而達到精密控制目標物分離的目的,在手性分離的應用中具有明顯優(yōu)勢,已被成功應用于雙酚類化合物[16]、三唑類農藥[17]、鄰苯二甲酸酯[18]、3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸酯[19]等結構類似物的分析,但在肉堿對映體的拆分和含量測定方面還未見報道。

本工作建立了一種基于UPC2拆分和測定兩種肉堿對映體的方法,并應用于嬰幼兒配方乳粉中肉堿的分離和含量的測定,以期為嬰幼兒配方乳粉中肉堿對映體含量測定提供技術支撐。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Acquity 型超高效合相色譜儀;ELGA CLXXXUVM2型超純水凈化系統;1-16K 型臺式離心機;MS2 型渦旋混勻器;R215 型旋轉蒸發(fā)儀;AE260型電子天平;N-EVAPTM 111 型氮吹儀;Oasis MCX 型混合型強陽離子交換固相萃取柱(3 mL,60 mg)。

肉堿外消旋體標準儲備溶液:1.0 g·L－1,稱取0.01 g(精確至0.1 mg)肉堿,用無水乙醇溶解并定容至10 mL容量瓶中。

肉堿外消旋體標準溶液:100 mg·L－1,取適量肉堿外消旋體標準儲備溶液,用無水乙醇稀釋配制成100 mg·L－1的肉堿外消旋體標準溶液。

兩種肉堿對映體的單標準儲備溶液:1.0 g·L－1,分別稱取0.01 g(精確至0.1 mg)D-肉堿和L-肉堿,用無水乙醇溶解并定容至10 mL容量瓶中。

兩種肉堿對映體的混合標準溶液系列:取一定量的兩種肉堿對映體的單標準儲備溶液,用無水乙醇逐級稀釋配制成0.50,1.00,2.00,5.00,20.00 mg·L－1的混合標準溶液系列。

衍生試劑溶液:4.5 g·L－1,稱取0.45 gL-丙氨酸-β-萘胺,用乙腈溶解并定容至100 mL。

催化劑Ⅰ:稱取0.50 g三乙胺,用三氯甲烷溶解并定容至100 mL。

催化劑Ⅱ:稱取0.50 g氯甲酸丁酯,用三氯甲烷溶解并定容至100 mL。

反應終止液:50 mmol·L－1,稱取0.42 g碳酸氫鈉,用水溶解并定容至100 mL。

L-丙氨酸-β-萘胺、肉堿外消旋體的純度不小于98.0%;D-肉堿和L-肉堿的純度分別為99.8%和99.0%。

乙腈、甲醇、無水乙醇均為色譜純;氨水、鹽酸、氫氧化鉀、碳酸氫鈉、三氯甲烷、三乙胺、氯甲酸丁酯均為優(yōu)級純;其他所用試劑均為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

Acquity Trefoil CEL1手性色譜柱(150 mm×3.0 mm,2.5μm),填料為纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯),柱溫40 ℃;系統背壓13.8 MPa;進樣量5μL;檢測波長244 nm;流動相A 為超臨界二氧化碳,B 為含1%(體積分數)氨水的甲醇溶液。梯度洗脫程序:0～7 min 時,B 為10%;7～9 min時,B 由10%升至28%,保持3 min;12～13 min時,B 由28%降至10%,保持1 min;流量1.0 mL·min－1。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的提取

稱取5.0 g(精確至0.01 g)嬰幼兒配方乳粉樣品于50 mL容量瓶中,加入0.1 mol·L－1鹽酸溶液20 mL,渦旋1 min混勻,超聲5 min充分溶解樣品。加入1 mol·L－1氫氧化鉀溶液5 mL,渦旋3 min混勻,60 ℃水浴皂化30 min,冷卻至室溫,加入1 mol·L－1鹽酸溶液5 mL,渦旋1 min 混勻,以0.1 mol·L－1鹽酸溶液定容至50 mL。取1 mL 提取液于15 mL 離心管中,加入9 mL 乙腈,渦旋1 min混勻后,移取1.5 mL 于2 mL 離心管中,在15 000 r·min－1轉速下離心5 min,取上清液備用。

1.3.2 樣品的凈化

依次用3 mL 甲醇、3 mL 水和10 mmol·L－1鹽酸溶液3 mL活化固相萃取柱。取1 mL 上清液注入活化好的固相萃取柱中,用10 mmol·L－1鹽酸溶液3 mL 淋洗,棄去全部淋洗液,真空抽柱1 min,用含4%(體積分數)氨水的甲醇溶液2 mL洗脫,洗脫液收集在15 mL離心管中,在40 ℃下氮吹至近干,取殘渣備用。

1.3.3 樣品的衍生

在殘渣中加入0.5 mL 衍生試劑溶液,超聲1 min,再依次加入0.5 mL催化劑Ⅰ和0.5 mL催化劑Ⅱ,渦旋3 min混勻,在20 ℃靜置60 min。加入2.0 mL反應終止液,渦旋3 min混勻,以5 000 r·min－1轉速離心5 min,移取上層水相于100 mL 濃縮瓶中,于40 ℃濃縮至近干,加入1 mL無水乙醇,渦旋3 min充分溶解殘渣,過0.22μm 有機濾膜,濾液供UPC2分析。

2 結果與討論

2.1 方法的可行性

取100 mg·L－1肉堿外消旋體標準溶液0.2 mL,按照試驗方法衍生并測定,并與D-肉堿和L-肉堿的色譜圖進行比對,結果見圖2。

圖2 肉堿外消旋體、D-肉堿和L-肉堿的色譜圖Fig.2 Chromatograms of carnitine racemate,D-carnitine and L-carnitine

由圖2可知:兩種肉堿對映體在11.0 min內實現了有效分離,經與D-肉堿和L-肉堿的色譜圖的比對,確定10.5～11.0 min內出峰的兩種物質分別為D-肉堿、L-肉堿。以二者各自峰面積占總峰面積的比值計算各自含量,其中D-肉堿所占比例為51.2%,L-肉堿所占比例為48.8%。

2.2 凈化小柱的選擇

按照試驗方法考察了容量相同的Oasis WCX型混合型弱陽離子交換固相萃取柱(記為WCX 凈化小柱)、Oasis HLB型聚合物固相萃取小柱(記為HLB凈化小柱)、Oasis MCX 型混合型強陽離子交換固相萃取柱(記為MCX 凈化小柱)對空白加標樣品(加標量200 mg·kg－1)的凈化效果,結果見圖3。

圖3 凈化小柱對兩種肉堿對映體凈化效果的影響Fig.3 Effect of purification cartridge on the purification effect of two carnitine enantiomers

由圖3可知:經過WCX 和HLB凈化小柱凈化后,樣品溶液的色譜圖中未見肉堿對映體的色譜峰,而以MCX 凈化小柱凈化的樣品溶液的色譜圖中兩種肉堿對映體色譜峰的分離度較好,因此試驗選擇MCX 凈化小柱凈化樣品。

2.3 衍生反應條件的選擇

氯甲酸乙酯[13]、氯甲酸丁酯[20]均可用作衍生反應的催化劑,由于氯甲酸乙酯毒性強、沸點低,且不易購買,試驗選擇氯甲酸丁酯作衍生反應的催化劑。

試驗還考察了衍生試劑溶液的用量對衍生效果的影響。取3份20.00 mg·L－1兩種肉堿對映體的混合標準溶液0.5 mL于3個離心管中,吹氮至近干后,分別加入0.5 mL 不同質量濃度(4.5,9.0,13.5 g·L－1)的衍生試劑溶液,按照試驗方法衍生并測定。結果顯示:測定值隨著衍生試劑溶液質量濃度的增加并沒有明顯增加,因此試驗選擇的衍生試劑溶液的質量濃度為4.5 g·L－1。

試驗還考察了衍生溫度分別為4,20,40,60℃,衍生時間分別為10,30,60,90 min時對兩種肉堿對映體測定值的影響,結果見圖4。

圖4 衍生溫度和衍生時間對兩種肉堿對映體質量濃度的影響Fig.4 Effect of derivatization temperature and time on mass concentration of two carnitine enantiomers

由圖4可知:兩種肉堿對映體的質量濃度先隨衍生溫度的升高而迅速增加;當衍生溫度為20 ℃時,質量濃度較大;衍生溫度繼續(xù)增加,質量濃度急劇減少。因此,試驗選擇的衍生溫度為20℃。兩種肉堿對映體的質量濃度先隨衍生時間的延長而增加;當衍生時間不小于60 min時,質量濃度趨于穩(wěn)定。因此,試驗選擇的衍生時間為60 min。

2.4 色譜柱的選擇

兩種肉堿對映體結構相似,很難進行拆分和色譜分離,因此試驗分別考察了相同規(guī)格的Acquity Trefoil AMY1色譜柱、Acquity Trefoil CEL1色譜柱和Acquity Trefoil CEL2色譜柱等3種手性色譜柱對兩種肉堿對映體分離效果的影響。取3 份20.00 mg·L－1兩種肉堿對映體的混合標準溶液0.5 mL于3個離心管中,氮吹至近干后,按照試驗方法衍生并測定,結果見圖5。

圖5 3種手性色譜柱對兩種肉堿對映體分離效果的影響Fig.5 Effect of 3 chiral chromatographic columns on the separation effect of two carnitine enantiomers

由圖5 可知:以Acquity Trefoil AMY1 色譜柱、Acquity Trefoil CEL2色譜柱分離時,兩種肉堿對映體不能實現完全分離,且色譜峰峰形差;以Acquity Trefoil CEL1色譜柱分離時,分離度較好,且色譜峰峰形尖銳。因此,試驗選擇Acquity Trefoil CEL1色譜柱分離兩種肉堿對映體。

2.5 系統背壓和柱溫的選擇

試驗采用的流動相A 為超臨界二氧化碳,可通過調整系統背壓和柱溫改變二氧化碳的密度,進而改變其對目標物的溶解能力、洗脫能力和選擇性。

首先考察了系統背壓分別為10.3,13.8,17.2,20.7 MPa時對兩種肉堿對映體分離效果的影響。結果顯示:目標物的出峰時間隨著系統背壓的升高而縮短;當系統背壓為10.3 MPa時,兩種肉堿對映體色譜峰的展寬比較明顯;當背壓升高至13.8 MPa時,兩種肉堿對映體的分離度較好,色譜峰峰形比較對稱;當背壓升高至17.2 MPa時,兩種肉堿對映體的分離度降低;當背壓升高至20.7 MPa時,系統出現超壓報警。綜合考慮色譜峰峰形及分離度,試驗選擇的系統背壓為13.8 MPa。

Acquity Trefoil CEL1手性色譜柱的最高推薦運行溫度為40 ℃,而二氧化碳在溫度超過31 ℃且壓力超過7.38 MPa時才會進入超臨界二氧化碳狀態(tài),因此試驗考察了柱溫分別為31,35,40℃時對兩種對映體分離效果的影響,結果見圖6。

由圖6可知:隨著柱溫升高,兩種肉堿異構體的分離度有所增大,出峰時間逐漸延長,這是由于隨著柱溫的升高,二氧化碳超臨界流體的黏度降低、密度減小、溶劑化能力降低,超臨界流體對目標物的溶解及交換能力減弱,目標物的出峰時間延長;當柱溫為31,35 ℃時,兩種肉堿對映體的分離度不佳;當柱溫為40 ℃時,兩種肉堿對映體的分離度較好,且在11.0 min內實現良好的基線分離。因此,試驗選擇的柱溫為40 ℃。

圖6 柱溫對兩種肉堿對映體分離效果的影響Fig.6 Effect of column temperature on the separation effect of two carnitine enantiomers

2.6 標準曲線和測定下限

按照儀器工作條件測定兩種肉堿對映體的混合標準溶液系列,以兩種肉堿對映體的質量濃度為橫坐標,其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果顯示:兩種肉堿對映體標準曲線的線性范圍均為0.25～10.00 mg·L－1(衍生后稀釋了1倍),線性回歸方程分別為y＝4.607×104x－2.723×103和y＝4.800×104x－5.499×103,相關系數均為0.999 3。

按照試驗方法分析空白加標樣品(加標量為25 mg·kg－1),以10 倍信噪比(S/N)計算測定下限(10S/N),L-肉堿和D-肉堿的測定下限均為25 mg·kg－1。

2.7 精密度和回收試驗

按照試驗方法對空白樣品進行3個濃度水平的加標回收試驗,每個濃度水平平行測定6次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表1。

表1 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表1 可知,兩種肉堿對映體的回收率為93.0%～110%,RSD 為3.9%～5.5%,符合相關標準[21]的要求。

2.8 方法比對

按照試驗方法分析實際樣品,并同國家標準GB 29989－2013《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿的測定》中分光光度法的結果進行了比對,在實際樣品中均未檢出D-肉堿,所檢出的L-肉堿的結果見表2。

表2 方法比對試驗結果Tab.2 Results of test for method comparison

由表2可知:本方法的測定值均符合食品安全國家標準GB 28050－2011《食品安全國家標準 預包裝食品營養(yǎng)標簽通則》[22]和GB 13432－2013《食品安全國家標準 預包裝特殊膳食用食品標簽》[23]規(guī)定的營養(yǎng)成分的實際含量不小于標示值80%的要求(未標識的除外);采用F檢驗法比較了兩種方法的顯著性差異,所得p值大于0.05,說明兩種方法無顯著性差異,測定結果基本一致。

本工作建立了UPC2拆分并測定嬰幼兒配方乳粉中D-肉堿和L-肉堿含量的方法。該方法精密度和準確度較好,可用于嬰幼兒配方乳粉中的D-肉堿和L-肉堿含量的監(jiān)控。