李珺銘， 劉富饒， 李 波， 吳 巍， 李 慧， 焦麗麗*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117)

人參PanaxginsengC.A.Meyer是一種名貴藥材，人參多糖作為其主要活性成分在人參中占比約為10%。人參多糖是一類無毒、無副作用的天然大分子，因其具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性而受備受關(guān)注。免疫活性是人參多糖最顯著的活性之一[1]。

多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，多糖的分子量[2]、連接鍵型[2]、支鏈[3]等都影響其生物學(xué)功能。其中，分子量是影響多糖生物學(xué)活性的重要因素之一，大量研究表明，分子量對(duì)多糖的抗氧化、免疫增強(qiáng)、抗腫瘤等生物學(xué)活性都有重要影響[4-6]?；诖?，本研究利用乙醇分級(jí)及凝膠色譜的方法獲得不同分子量的人參多糖，并對(duì)其理化性質(zhì)及體外免疫活性進(jìn)行比較，以期探究分子量對(duì)人參多糖免疫活性的影響，為進(jìn)一步探究人參多糖免疫活性構(gòu)效關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；Ultimate3000 型液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；Eppendorf Centrifuge 5810R離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)。

1.2 試劑與藥物D-Glc(批號(hào) 110833)、D-GalA(批號(hào) S11020)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、臺(tái)盼藍(lán)、MTT液、刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；D-Hanks平衡鹽、RPMI-1640培養(yǎng)液均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；牛血清白蛋白購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。乙腈(色譜純)購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；其余試劑均為分析純，購(gòu)自北京化工廠有限責(zé)任公司。5年生人參2017年購(gòu)于通化集安，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定為正品。樣品儲(chǔ)存于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院。

2 方法

2.1 人參粗多糖提取 準(zhǔn)確稱量粉碎后的人參500 g，沸水提取2 h，濾過，殘?jiān)貜?fù)提取2次，合并3次濾液，80 ℃水浴濃縮。

2.2 人參多糖乙醇醇沉分級(jí) 將上述人參提取液加入95%乙醇至乙醇終體積分?jǐn)?shù)為40%，4 ℃靜置24 h，離心(8 000 r/min，10 min)，沉淀物加入水復(fù)溶后，凍干得到凍干粉稱量待用。以此類推，將人參多糖提取液進(jìn)行60%、80%不同乙醇體積分?jǐn)?shù)醇沉，得到其不同乙醇沉淀級(jí)分，分別將其命名為WGP-40、WGP-60、WGP-80。

2.3 人參多糖分級(jí)純化 取0.5 g人參多糖樣品溶于10 mL去離子水中，離心(8 000 r/min，5 min)，取上清液上樣于Sepharose CL-6B制備柱(3.0 cm×100 cm)，以生理鹽水為流動(dòng)相，苯酚硫酸法跟蹤檢測(cè)洗脫液糖含量，收集相應(yīng)的多糖級(jí)分，透析，凍干，所得粉末即為純化的多糖樣品。

2.4 人參多糖理化性質(zhì) 采用苯酚硫酸法[7]進(jìn)行測(cè)定糖含量；采用間羥基聯(lián)苯法[8]進(jìn)行測(cè)定糖醛酸含量；采用Bradford法[9]進(jìn)行測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

2.5 人參多糖的單糖組成測(cè)定 單糖組成測(cè)定方法為稱取2.0 mg樣品多糖酸水解，經(jīng)過苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化，用HPLC檢測(cè)。采用Ultimate 3000型液相色譜系統(tǒng)，DIKMA Inertsil ODS-3 色譜柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；紫外檢測(cè)器；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；流動(dòng)相PBS-乙腈(83∶17)；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm[10]。

2.6 人參多糖分子量測(cè)定 將樣品溶于超純水，制備成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的糖溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，采用高效凝膠滲透色譜法檢測(cè)其分子量。色譜條件為TSK-G3000 PWXL色譜柱(7.8 mm×30.0 cm, 5 μm)色譜柱；RID-10A視差折射檢測(cè)器；體積流量0.5 mL/min；柱溫40 ℃；流動(dòng)相超純水。利用已知分子量標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖(180、2 700、5 250、9 750、13 050、36 800、135 350、300 600 Da)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線用于計(jì)算相應(yīng)樣品的分子量[10]。

2.7 免疫活性檢測(cè)

2.7.1 脾淋巴細(xì)胞懸液制備 取正常小鼠并脫頸處死，放于75%乙醇中浸泡后，無菌條件下解剖并取出脾臟，研磨后制備成細(xì)胞懸液。用臺(tái)盼藍(lán)染色法對(duì)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算細(xì)胞存活率，需保證活細(xì)胞數(shù)占95%以上，并用培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋至1×106/mL，制成單細(xì)胞懸液[11]。

2.7.2 活性檢測(cè) 取“2.6.1”項(xiàng)下制備好的脾淋巴細(xì)胞懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL。加糖樣、ConA、LPS，并設(shè)置對(duì)應(yīng)的空白對(duì)照組，每劑量重復(fù)3孔，每孔加培養(yǎng)液補(bǔ)至200 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)68 h后，每孔加20 μL MTT，再放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸取上清100 mL，孔中加入150 μL DMSO，用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定吸光度(A)值[11]。

3 結(jié)果

3.1 人參多糖提取及分級(jí) 人參水提液經(jīng)40%、60%、80%乙醇醇沉后，獲得了WGP-40、WGP-60、WGP-80 3個(gè)不同的級(jí)分，收率分別為11.09%、2.84%、5.41%。利用分子篩凝膠色譜對(duì)上述多糖分進(jìn)一步純化，其中WGP-40經(jīng)純化后得到2個(gè)級(jí)分WGP-40-F1和WGP-40-F2，見圖1，收率分別為49%、37%；而WGP-60和WGP-80進(jìn)一步純化后各得到1個(gè)級(jí)分，分別是WGP-60-F(圖2)和WGP-80-F(圖3)，收率分別為85.5%、88.8%。

圖1 人參多糖WGP-40的Sepharose CL-6B制備層析圖

圖2 人參多糖WGP-60的Sepharose CL-6B制備層析圖

圖3 人參多糖WGP-80的Sepharose CL-6B制備層析圖

3.2 人參多糖分子量分析 本研究利用高效凝膠滲透色譜法檢測(cè)多糖級(jí)分的分子量，以不同分子量的葡聚糖進(jìn)行回歸，得方程Y=-0.353 5X+9.352 6。根據(jù)樣品的洗脫時(shí)間計(jì)算其分子量可知，WGP-40、WGP-60、WGP-80的分子量分布范圍分別為1 408～146 042、1 364～140 621、1 357～964 31 Da，表明隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，所得的多糖的分子量分布呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。對(duì)上述3種多糖進(jìn)行進(jìn)一步純化后獲得了分子量均一的4個(gè)多糖級(jí)分，分別是WGP-40-F1、WGP-40-F2、WGP-60-F、WGP-80-F，根據(jù)每個(gè)級(jí)分的洗脫時(shí)間可知其分子量分別為131 441、109 177、12 007、3 160 Da(表1)。該結(jié)果進(jìn)一步表明了乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高所獲的多糖的分子量是降低的。

表1 人參多糖各樣品的分子量及理化性質(zhì)結(jié)果

3.3 人參多糖單糖組成 采用PMP衍生及HPLC分析方法測(cè)定各人參多糖樣品的單糖組成，結(jié)果見表2，WGP-40、WGP-40-F1、WGP-40-F2均由Glc組成，為葡聚糖。WGP-60和WGP-80為雜多糖，均是以Glc為主，含量分別為85%、82.86%；同時(shí)含有少量的Gal和Ara；WGP-80-F中還有少量的Rha(3.55%)。經(jīng)Sepharose CL-6B純化后，所得的分子量均一的多糖級(jí)分WGP-60-F和WGP-80-F仍是以Glc為主的雜多糖，但是，純化后WGP-60-F和WGP-80-F中Ara的含量有所提高。

表2 人參多糖各級(jí)分單糖組成的摩爾百分比

3.4 人參多糖免疫活性 采用MTT法對(duì)WGP-40-F1、WGP-40-F2、WGP-60-F、WGP-80-F(50、100、200、400 μg/mL)的免疫活性進(jìn)行了研究，結(jié)果見圖4～6。當(dāng)多糖單獨(dú)作用時(shí)，在同等質(zhì)量濃度作用下，WGP-40-F1對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用最強(qiáng)，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，并且，4種多糖對(duì)淋巴細(xì)胞增殖能力的影響由強(qiáng)到弱依次是WGP-40-F1、WGP-40-F2、WGP-60-F、WGP-80-F。同時(shí)，WGP-40-F1對(duì)ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞和LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞的增殖能力也優(yōu)于WGP-40-F2、WGP-60-F、WGP-80-F，并且，WGP-60-F和WGP-80-F在低質(zhì)量濃度時(shí)(50、100、200 μg/mL)對(duì)淋巴細(xì)胞增殖作用不明顯，僅在高濃度(400 μg/mL)時(shí)能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：與ConA組比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：與LPS組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

多糖是一類結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜的生物大分子，多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)包括構(gòu)型、分子量、單糖組成、糖苷鍵型，分支度、分支位點(diǎn)及支鏈長(zhǎng)度等都影響其生物學(xué)活性。其中，植物多糖的分子量是影響其生物活性的重要因素，與多糖的多種生物學(xué)活性有密切關(guān)系。Su等[12]對(duì)4種木耳屬多糖的抗氧化研究發(fā)現(xiàn)，4種木耳多糖的分子量與體外抗氧化活性成正相關(guān)。Li等[13]分別采用對(duì)蟲草多糖進(jìn)行提取、分級(jí)獲得多個(gè)多糖級(jí)分，在此基礎(chǔ)上對(duì)其理化性質(zhì)及抗腫瘤活性進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)，蟲草多糖的活性與其分子量密切相關(guān)，分子量分布于3 000～10 000 kDa的多糖的抗腫瘤效果最好。Yan等[14]利用乙醇醇沉的方式獲得了不同分子量的生大蒜鱗莖多糖，并發(fā)現(xiàn)分子量與該多糖的抗氧化、免疫增強(qiáng)作用有密切關(guān)系。免疫活性是多糖的一個(gè)重要的生物學(xué)活性，很多多糖已經(jīng)在臨床上作為增強(qiáng)免疫力的藥物而廣泛使用，如香菇多糖、褶裂菌多糖、云芝多糖等。多項(xiàng)研究也表明，多糖的分子量是影響其免疫調(diào)節(jié)活性及抗腫瘤的重要因素。

在本研究中，課題組利用乙醇分級(jí)聯(lián)合分子篩層析獲得了分子量不同的4種多糖，研究發(fā)現(xiàn)不同分子量的人參多糖在理化性質(zhì)、初步結(jié)構(gòu)以及體外免疫活性上有顯著差別，分子量的大小與所用乙醇體積分?jǐn)?shù)大小呈反比；其中用40%乙醇醇沉后得到的純化的樣品分子量最大，其在收率、糖含量、紅外分析以及免疫活性方面都優(yōu)于其他組分，分子量為131 441 Da的級(jí)分(WGP-40-F1)具有較高的免疫增強(qiáng)活性。多糖的生物學(xué)活性不僅與其一級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)，其高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)其活性也有重要的影響，但是由于多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，其構(gòu)效關(guān)系研究還很薄弱，對(duì)于人參多糖發(fā)揮免疫活性的構(gòu)效關(guān)系也需要進(jìn)行更深入的研究。