趙 權(quán)， 張 優(yōu)， 陳 影， 歐陽冰琛， 戴國梁， 居文政

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

枳實梔子豉湯源自東漢張仲景《傷寒論》393條，為醫(yī)治“發(fā)汗吐下后, 虛煩不得眠”并“勞復(fù)發(fā)熱”之良方[1]。全方由枳實、梔子、淡豆豉三味中藥所組成。其中枳實為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種或甜橙CitrussinensisOsbeck的干燥未成熟果實[2]；歸脾、胃經(jīng)；理氣寬中、行滯消脹；梔子為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果實；歸心、肺、三焦經(jīng)；瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒[3]。豆豉為豆科植物大豆Glycinemax(L.)Merr.的成熟種子的發(fā)酵加工品[4]；歸肺、胃經(jīng)；解表，除煩，宣發(fā)郁熱。三藥合用，具有清熱除煩、解郁安神、改善失眠的功效，臨床上常用于治療熱擾胸嗝、氣機(jī)不暢、郁熱虛煩等癥狀[5-6]。

對中藥復(fù)方進(jìn)行定性及定量分析，是保證其質(zhì)量可控和療效穩(wěn)定的重要手段。目前，已有對枳實梔子豉湯進(jìn)行定性分析的文獻(xiàn)報道，但其定性結(jié)果未檢測到淡豆豉中的化學(xué)成分[7]。僅對枳實、梔子兩味藥材進(jìn)行定性分析，分析結(jié)果具有一定的片面性，對后續(xù)可能的體內(nèi)實驗不能全面指示枳實梔子豉湯發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。本實驗采用超高效液相-四級桿-飛行時間質(zhì)譜儀(HPLC-Q-TOF-MS/MS)定性分析枳實梔子豉湯中的化學(xué)成分，以期為研究枳實梔子豉湯發(fā)揮藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的溯源提供參考。中藥復(fù)方化學(xué)成分復(fù)雜，種類龐雜，使用不當(dāng)可能會引起毒性作用，所以中藥材相關(guān)化學(xué)成分的含量是否合格極為重要。檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫，尚未有對主成分進(jìn)行同時定量分析的文獻(xiàn)報道，本實驗參考劉昌孝院士提出的中藥質(zhì)量標(biāo)志物確定原則[8]，采用HPLC法同時測定枳實梔子豉湯方中6種成分的含量，以期為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支撐和數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 儀器 LC(美國 Agilent公司)-Triple TOF TM 5600液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國 AB Sciex公司)，配有 PeakView(version1.2)數(shù)據(jù)處理軟件和質(zhì)譜自動校準(zhǔn)調(diào)諧系統(tǒng)(CDS)；Waters 2695高效液相色譜儀(配置Waters 2487 紫外檢測器)(美國Waters公司)；CPA 225D 電子天平(德國Sartorius公司)；Milli-Q Advantage A10超純水機(jī)(美國Millipore公司)；Legend Micro 17R 冷凍離心機(jī)(美國Thermo公司)；KH5200E 超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；WH2 微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)。

1.2 試劑與藥物 京尼平龍膽雙糖苷(批號MUST-19102801)、梔子苷(批號MUST-17020401)、柚皮苷(批號MUST-17040102)、橙皮苷(批號MUST-16041806)、新橙皮苷(批號MUST-17040707)對照品(純度≥98.00%)均購自成都曼斯特生物科技有限公司；大豆苷(批號111738-201603)對照品(純度93.3%)購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇和乙腈(色譜純，德國 Merck公司)；甲酸(色譜純，瑞士 Fluka-Sigma-Aldrich公司)；磷酸(色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；TOF-MS 正離子調(diào)諧液(批號 4460131)、TOF-MS 負(fù)離子調(diào)諧液(批號 4460134)(美國 AB Sciex公司)。枳實(產(chǎn)地江西，批號171027007)、梔子(產(chǎn)地江西，批號180622016)、淡豆豉(產(chǎn)地河北，批號170531001)，均購自北京同仁堂南京分店，經(jīng)江蘇省中醫(yī)院藥學(xué)部副主任藥師張倩鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 Agilent Poroshell 120 SB-C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)；流動相0.1% 甲酸水(A)-甲醇-乙腈(1∶1)(B)，梯度洗脫(0～1.0 min，20%～25% B；1～3.5 min，25%～30% B；3.5～4.5 min，30%～48% B；4.5～6.5 min，48%～52% B；6.5～6.8 min，52%～60% B；6.8～9.5 min，60%～65% B；9.5～10.0 min，65%～90% B；10.0～11.5 min，90% B；11.5～12.0 min，90%～20% B；12.0～15.0 min，20% B)；體積流量450 μL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；進(jìn)樣室溫度4 ℃。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源以正負(fù)離子模式采集數(shù)據(jù), TOF-MS 掃描模式參數(shù)設(shè)置為分子量掃描范圍m/z60～1 500；累積時間 0.249 996 s; 離子化溫度(TEM)550 ℃；霧化氣(GS1)50 psi(1 psi=6.895 kPa); 輔助加熱氣(GS2)50 psi; 氣簾氣(CUR)35 psi; 去簇電壓(DP)80 V；碰撞能量(CE)10 eV；正負(fù)離子模式下噴霧電壓(ISVF)分別為5 500 V、4 500 V。采用信息關(guān)聯(lián)采集(Information dependent acquisition, IDA)、智能化的動態(tài)背景扣除(Dynamic background subtraction, DBS)和高靈敏度的模式采集數(shù)據(jù)。子離子掃描模式的參數(shù)設(shè)置為分子量掃描范圍m/z40～1 000；碰撞能量(35±15)eV, 其他主要參數(shù)同TOF-MS掃描模式。采用AB 公司的調(diào)諧液傳遞系統(tǒng)(CDS)對分子量準(zhǔn)確度進(jìn)行自動校準(zhǔn)。通過AB公司的分析控制軟件Analyst? TF 1.6 software控制儀器操作和數(shù)據(jù)采集。

2.1.3 定量分析色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.1% H3PO4(B)，梯度洗脫(0～5 min, 2%～8% A; 5～15 min, 8%～15% A; 15～25 min, 15%～15% A; 25～35 min, 15%～20% A; 35～45 min, 20%～30% A); 檢測波長254 nm;進(jìn)樣量10 μL; 柱溫35 ℃; 體積流量1.0 mL/min。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、大豆苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對照品適量，分別加甲醇制成含相應(yīng)成分2.94、3.00、1.00、1.00、1.00、1.00 mg/mL的對照品貯備液，再分別吸取上述對照品適量，加甲醇配制成含相應(yīng)成分30.39、79.51、6.677、173.1、44.27、139.6 μg/mL的混合對照品溶液，即得。

二是成立行動領(lǐng)導(dǎo)工作組。為提高工作認(rèn)識，落實責(zé)任主體，成立由局長任組長，班子成員為副組長，各業(yè)務(wù)股室負(fù)責(zé)人為成員的工作組。同時，領(lǐng)導(dǎo)工作組下設(shè)業(yè)務(wù)小組，由分管領(lǐng)導(dǎo)為小組長，采購辦、財檢辦、行政政法股、科教文股、農(nóng)財股、經(jīng)建股、鄉(xiāng)財股、社保股、綜合股各派一名人員組成。

2.3 供試品溶液制備 將枳實15 g、梔子12 g、淡豆豉10 g放入1 L圓底燒瓶中，第一次加入10倍量的75%乙醇回流提取2 h，濾過，第2次加入8倍量的75%乙醇回流提取1 h。合并2次濾液，濃縮為1.332 g/mL的質(zhì)量濃度，待用。精密吸取1 mL濃縮液于25 mL錐形瓶中，加入50%甲醇定容，搖勻，即得。

2.4 質(zhì)譜分析 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)和相關(guān)文獻(xiàn)檢索各中藥材所含的化合物，根據(jù)PubChem Compound、ChemSpider獲得化合物分子式、分子量，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，收集各化合物在正、負(fù)離子模式下的分子離子峰與二級碎片離子峰。PeakView軟件分析其總離子流圖，正、負(fù)離子總離子流圖見圖1。鑒定結(jié)果見表1。標(biāo)準(zhǔn)品二級質(zhì)譜裂解圖見圖2。有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物，則通過標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對。共鑒定出38個化合物。包括枳實15個化合物、梔子14個化合物，淡豆豉10個化合物，1個化合物為梔子和淡豆豉共有。主要包含環(huán)烯醚萜類、黃酮苷類、異黃酮苷類、有機(jī)酸類、黃酮類和異黃酮類。同一類型化合物具有相似的斷裂方式。

圖1 枳實梔子豉湯總離子流圖

表1 枳實梔子豉湯各化學(xué)成分鑒定分析結(jié)果

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品二級質(zhì)譜圖

2.4.1 環(huán)烯醚萜類 鑒定出的環(huán)烯醚萜類化合物均來源于梔子。以梔子苷(11)為例，通過PubChem Compound查詢其分子式C17H24O10，分子量388，在負(fù)離子模式下，碎片離子峰中有較強(qiáng)的m/z433的碎片離子峰，根據(jù)其碎片峰的質(zhì)荷比，推測m/z433的碎片離子峰為[M+HCOO]-，可能是梔子苷。二級碎片離子m/z225[M-H-glc]-是由準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-脫去一分子中性碎片葡萄糖(162 Da)產(chǎn)生的，m/z225進(jìn)一步發(fā)生RDA裂解，產(chǎn)生m/z123[M-H-Glc-C4H6O3]-的碎片離子峰。見圖3。

圖3 梔子苷質(zhì)譜裂解過程

2.4.2 黃酮苷類 以柚皮苷(16)為例，柚皮苷為二糖苷類化合物，所含配糖基由鼠李糖與葡萄糖組成。正離子模式下，在一級質(zhì)譜中顯示分子離子峰為[M+H]+m/z581，二級質(zhì)譜中出現(xiàn)m/z435和m/z273的碎片離子峰。根據(jù)其化合物結(jié)構(gòu)，m/z435為柚皮苷末端丟失中性碎片鼠李糖(146 Da)的碎片離子峰；m/z273為柚皮苷丟失整個糖基所得的碎片離子峰。其過程見圖4。柚皮蕓香苷等其他黃酮苷有著相似的斷裂方式。具體碎片信息見表1。

圖4 柚皮苷質(zhì)譜裂解過程

2.4.3 異黃酮苷類 以大豆苷(12)為例，大豆苷化合物名稱為大豆苷元-7-O-葡萄糖苷，其結(jié)構(gòu)是大豆苷元色原酮結(jié)構(gòu)7號位通過氧苷鍵連接了葡萄糖形成的異黃酮苷類化合物。在負(fù)離子模式下，一級質(zhì)譜中分子離子峰為[M-H]-m/z415。二級質(zhì)譜可觀察到豐度較高的m/z252[M-H-Glc]-的碎片離子峰。鑒定出的異黃酮苷類大部分來源于淡豆豉，對染料木苷、黃豆黃苷等異黃酮苷類化合物也進(jìn)行相應(yīng)的鑒定。裂解過程見圖5。

圖5 大豆苷質(zhì)譜裂解過程

2.4.4 有機(jī)酸類 以綠原酸(10)為例，在PubChem查詢其分子量后，推測其[M+H]+和[M-H]-分別為m/z355和m/z353。分別在正、負(fù)離子總離子流圖中找到相對應(yīng)的分子離子峰，并核對其保留時間是否一致。在負(fù)離子模式下找到分子離子峰m/z353[M-H]-。其二級質(zhì)譜中包含文獻(xiàn)中報道的m/z191[M-H-C9H6O3]-和m/z173[M-H-C9H6O3-H2O]-的碎片離子峰。在正離子模式下找到分子離子峰m/z355[M+H]-。對應(yīng)的二級質(zhì)譜中找到m/z163[M+H-C7H11O6]+的碎片離子峰，推測是由準(zhǔn)分子離子峰脫去一分子奎尼酸所得，繼續(xù)脫掉一個CO得到m/z135[M+H-C7H11O6-CO]+的碎片離子峰。其具體裂解過程見圖6。

圖6 綠原酸在正、負(fù)離子模式的質(zhì)譜裂解過程

2.4.5 黃酮類 以橘皮素(38)為例，在正離子模式下，根據(jù)橘皮素分子量推測m/z373是其分子離子峰。在二級質(zhì)譜中找到m/z343[M+H-2CH3]+，m/z211[M+H-C10H10O2]+的碎片離子峰。與文獻(xiàn)[10]報道一致，因此確證橘皮素的存在。

2.4.6 異黃酮類 以大豆苷元(25)為例，負(fù)離子模式下，根據(jù)其分子量，推測m/z253應(yīng)為其分子離子峰[M-H]-。二級質(zhì)譜峰分別為224[M-H-CHO]-，208[M-H-CHO-CO2]-，133[M-H-C7H6O2]-。結(jié)合其參考文獻(xiàn)[11]，推測可能是大豆苷元。

2.5.1 專屬性試驗 在“2.1”項色譜條件下，取適量對照品、供試品溶液，精密吸取10 μL進(jìn)樣分析。結(jié)果見圖2。由此可知，各物質(zhì)分離度良好，京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、大豆苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷保留時間分別為12.37、14.55、17.94、33.78、35.65、37.92 min，分離度良好，色譜峰附近無其他成分的干擾，專屬性強(qiáng)，色譜圖見圖7。

1.京尼平龍膽雙糖苷 2.梔子苷 3.大豆苷 4.柚皮苷 5.橙皮苷 6.新橙皮苷

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2”項下對照品儲備液適量，倍比稀釋成6個不同質(zhì)量濃度，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣10 μL測定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系

2.5.3 精密度試驗 吸取“2.2”項下對照品溶液10 μL，在“2.1”項色譜條件下測定，連續(xù)進(jìn)樣6次。測得京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、大豆苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面積RSD分別為0.70%、0.55%、0.35%、0.46%、0.92%、0.26%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 按“2.3”項下方法制備供試品溶液，室溫下于0、1、2、4、8、12、24 h，在“2.1”項色譜條件下測定，測得京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、大豆苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面積RSD分別為1.76%、0.80%、1.72%、0.99%、1.53%、0.88%，表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗 按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，在2.1”項色譜條件下進(jìn)樣，測得京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、大豆苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量RSD分別為0.91%、0.97%、1.06%、0.93%、1.01%、0.88%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗 按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，測定其含量，加入適量對照品貯備液，在2.1”項色譜條件下進(jìn)樣，計算回收率，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.5.7 樣品含量測定 按“2.3”項下方法平行制備供試品溶液，平行3份，在“2.1”項色譜條件下測定含量，結(jié)果見表4。

表4 各成分含量測定結(jié)果(mg/g，n=3)

3 討論

3.1 HPLC-Q-TOF-MS/MS定性分析 在流動相中，添加0.1%甲酸有利于黃酮類成分的峰形改善，也有利于某些成分如梔子苷產(chǎn)生響應(yīng)更好的[M+HCOO]-分子離子峰。TOF-MS定性過程中發(fā)現(xiàn)，文中涉及到3組同分異構(gòu)體(橙皮苷與新橙皮苷、橙黃酮與異橙黃酮、去乙?；嚾~草苷酸甲酯、雞屎藤次苷甲酯與羥異梔子苷)。有些同分異構(gòu)體如橙皮苷與新橙皮苷，其分子離子峰一致，但其色譜行為不一致，因此在建立方法時，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間，調(diào)整梯度使其在不同時間出峰，并比對標(biāo)準(zhǔn)品的二級碎片離子峰來進(jìn)行鑒定。橙黃酮與異橙黃酮分子離子峰一致，可以根據(jù)出峰時間順序進(jìn)行鑒定和區(qū)別[18]。文中還有一些同分異構(gòu)體如去乙?；嚾~草苷酸甲酯、雞屎藤次苷甲酯與羥異梔子苷沒有標(biāo)準(zhǔn)品，因此，需要根據(jù)其出峰時間結(jié)合二級碎片離子峰加以判斷[16, 19-20]。

3.2 定量分析

3.2.1 成分選擇 枳實中的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷；梔子中的梔子苷；淡豆豉中的大豆苷等異黃酮類成分均具有抗抑郁的作用[21-23]。與方劑中解郁安神的功效基本一致。梔子中除2015年版《中國藥典》所規(guī)定的梔子苷作為指標(biāo)性成分外，再增加一個藥材專屬性強(qiáng)且性質(zhì)穩(wěn)定的京尼平龍膽雙糖苷作為梔子的指標(biāo)性成分。

3.2.2 色譜條件優(yōu)化 比較Waters Xterra MS C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Waters Symmetry C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)3種色譜柱，最終選擇Agilent ZORBAX SB-C18柱。通過比較乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水和甲醇-乙腈-0.1%磷酸水4種流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸水作為流動相時峰形最優(yōu)。實驗初期分別在238、246、254、270、283 nm進(jìn)行檢測波長的比較。發(fā)現(xiàn)在254 nm條件下，分析物附近的雜峰較少，對于分析物的分離更有利。

3.2.3 進(jìn)樣溶劑選擇 考察了純甲醇、75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇、純水作為進(jìn)樣溶劑，發(fā)現(xiàn)50%甲醇作為進(jìn)樣溶劑時各分析物分離良好，峰形最優(yōu)。

本實驗應(yīng)用HPLC-Q-TOF-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，通過高分辨率質(zhì)譜獲得化合物精確分子量、保留時間、碎片離子峰等信息，共鑒定出38個化合物。應(yīng)用HPLC-VWD高效液相色譜法，建立了枳實梔子豉湯中6種成分同時測定的定量方法。對中藥復(fù)方進(jìn)行定性及定量分析，以期為綜合評價枳實梔子豉湯的質(zhì)量提供參考，為闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。