段珊珊，王苑酈，楊建正，丁文軍?，賀軍輝

(1 中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所 功能納米材料實驗室 微納材料與技術(shù)研究中心， 北京 100190； 2 中國科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué) 學(xué)院環(huán)境與健康實驗室， 北京 100049； 3 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

中國是世界最大的農(nóng)藥生產(chǎn)國和消費(fèi)國之一，有機(jī)氯農(nóng)藥具有高毒性、親脂性、化學(xué)穩(wěn)定性和生物富集性，曾被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[1]。環(huán)境與健康研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)氯農(nóng)藥的使用對空氣、水、土壤造成了極大的污染，嚴(yán)重威脅生態(tài)環(huán)境和生物安全[2]，現(xiàn)已被列入持久性有機(jī)污染物。林丹作為最常見的有機(jī)氯農(nóng)藥，是具有殺蟲活性的六氯環(huán)己烷的γ異構(gòu)體[3]。盡管林丹現(xiàn)已被世界各國禁用，但在環(huán)境中殘留的林丹可以通過食物鏈富集到生物體內(nèi)[4]，對哺乳類動物的肝臟、生殖和發(fā)育等產(chǎn)生毒性效應(yīng)，嚴(yán)重危害人類健康[5]。肝臟是哺乳動物參與外來化合物代謝的重要器官，易受到有機(jī)氯農(nóng)藥等環(huán)境污染物的影響，損傷線粒體功能，導(dǎo)致肝功能損傷[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)高劑量的林丹暴露引起惡心、嘔吐、腹瀉和抽搐等中毒癥狀，并導(dǎo)致肝臟腫大、病理損傷等毒性效應(yīng)[8]。因此，闡明林丹對肝臟的毒性作用機(jī)制具有重要的生物學(xué)意義。

氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種生理狀態(tài)，也是導(dǎo)致疾病的一個重要因素[9]。氧化應(yīng)激在急性和慢性肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[6]。在氧化應(yīng)激條件下，生成的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)可作為功能性分子信號，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)各種應(yīng)激信號通路，與細(xì)胞功能受損密切相關(guān)，如誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞自噬等[10]。但是，有關(guān)林丹誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞自噬的研究報道甚少。本研究旨在檢測林丹誘導(dǎo)的肝臟HepG2細(xì)胞ROS生成、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞1β(IL-1β)和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步揭示林丹誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、2′,7′-二乙酸二氯熒光素(DCFH-DA)、二氫乙啶(DHE)、二甲基亞砜(DMSO)購于Sigma-Aldrich(美國)；青霉素-鏈霉素雙抗、高糖DMEM培養(yǎng)基購于Gibco(美國)；胎牛血清購于PAN(德國)；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑購于Bimake(美國)；蛋白提取液、二喹啉甲酸(BCA)法蛋白檢測試劑盒、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、4%多聚甲醛固定液、抗熒光淬滅封片液(含DAPI)購于碧云天(中國)；乳酸脫氫酶和過氧化氫酶試劑盒購買于百奧曼(中國)；Trizol試劑購于Invitrogen(美國)；Alexa Fluor?594標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)購于寶億如(中國)；實時定量PCR(RT-PCR)試劑盒購于TaKaRa(日本)；Triton試劑購于鼎國生物(中國)；純度為99.5%的γ-六六六購于賽普銳思(中國)；人肝上皮HepG2細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和暴露

HepG2細(xì)胞來源于人的肝臟組織，具有人肝細(xì)胞特有的酶活性[11]，以此作為本文的研究對象。HepG2細(xì)胞(2.5×105cell/mL)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo，MA，美國)中培養(yǎng)24 h；林丹溶解在DMSO中，實驗前用DMEM稀釋為1、2、5、10、20、50、100 mg/L，DMSO最終濃度低于0.25%。

1.3 細(xì)胞活力的測定

將不同濃度的林丹(1、2、5、10、20、50、100 mg/L)暴露處理HepG2細(xì)胞24 h后，每孔加入100 μL MTT(0.5 g/L)，37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中再孵育2 h，棄上清液后加入100 μL DMSO溶解藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，再搖床避光孵育5 min。使用多功能酶標(biāo)儀(Bio Tek，美國)在492 nm處檢測各孔的吸光度。

1.4 活性氧含量的測定

采用活性氧探針熒光染料DCFH-DA/超氧陰離子探針熒光染料DHE測定細(xì)胞內(nèi)活性氧/超氧陰離子的水平。HepG2細(xì)胞分別用DCFH-DA(25 μmol/L)、DHE(10 μmol/L)于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)30 min后，用PBS洗3次，各取100 μL細(xì)胞液于96孔板中，用多功能酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度(488/525 nm)。剩余樣品置-80 ℃冰箱裂解過夜，次日直接取20 μL，用BAC蛋白試劑盒檢測蛋白濃度。同樣的染色方法對細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，直接用熒光倒置顯微鏡(Olympus，日本)檢測細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.5 RNA的提取和實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測

使用Trizol試劑提取HepG2細(xì)胞的RNA后，再用Nano-drop(Thermo Fisher Scientific，美國)檢測RNA的純度和濃度。逆轉(zhuǎn)錄體系為20 μL：16 μL RNA，4 μL逆轉(zhuǎn)錄酶。應(yīng)用PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf，德國)將RNA(4 μg)擴(kuò)增為cDNA。RT-PCR儀(Stratagene，美國)檢測細(xì)胞的IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α、NF-κB、Beclin1、ULK1mRNA表達(dá)量。RT-PCR體系為：TBGreen 10 μL，ROX 0.4 μL，上游和下游引物各0.8 μL，無核酸水6 μL，cDNA模板2 μL。PCR反應(yīng)條件為：變性95 ℃、35 min；退火55 ℃、30 min；延伸72 ℃、30 min；終延伸95 ℃、15 min；循環(huán)40次。從NCBI數(shù)據(jù)庫中在線搜索獲得IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α、NF-κB、Beclin1、ULK1的mRNA序列，設(shè)計RT-PCR引物，由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成。IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α、NF-κB、Beclin1、ULK1等引物見表1。

1.6 蛋白質(zhì)印跡分析(Western blot)

在蛋白提取液中加入100∶1的蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和苯甲基磺酰氟。BCA蛋白檢測試劑盒定量測定總蛋白濃度，調(diào)整樣品蛋白濃度為26 μg，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%的Skim milk脫脂牛奶(BD，NJ，美國)封閉PVDF膜1 h，4 ℃孵育一抗(1∶1 000稀釋)過夜，再用1% Tween-20，pH7.4的Tris-HCl(TBST)緩沖液反復(fù)沖洗PVDF膜3次，每次10 min。最后，用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)和山羊抗兔IgG(H+L)(用5%脫脂牛奶1∶2 000稀釋)室溫孵育1 h，再用TBST緩沖液沖洗3次，每次10 min。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測試劑盒檢測各蛋白條帶強(qiáng)弱，全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)拍攝照片后，用Image J灰度分析P-p65、IL-1β、P62、LC3蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參，檢測目的蛋白的表達(dá)情況。

表1 用于熒光實時定量PCR分析的引物序列Table 1 Sets of forward (F) and reverse (R) primers used in real time PCR

1.7 乳酸脫氫酶(LDH)和過氧化氫酶(CAT)的測定

按照乳酸脫氫酶和過氧化氫酶試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用紫外-可見分光光度計(Thermo，M A，美國)和多功能酶標(biāo)儀(MK3, Thermo，美國)分別檢測過氧化酶和乳酸脫氫酶的活性。

1.8 免疫熒光檢測NF-κB在細(xì)胞中的分布情況

林丹處理細(xì)胞24 h后，棄培養(yǎng)基，用0.1 mol/L，pH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次。4%預(yù)冷多聚甲醛固定液處理細(xì)胞，常溫孵育10 min，PBS清洗3次；0.1% Triton再常溫孵育10 min，PBS清洗3次；3% BSA常溫封閉1 h，PBS清洗3次；NF-κB抗體(1%牛血清蛋白稀釋50倍)4 ℃過夜孵育細(xì)胞，PBS清洗3次；Alexa Fluor? 594標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(3%牛血清蛋白稀釋100倍)常溫避光孵育1 h后，PBS清洗3次；DAPI室溫避光孵育10 min，PBS清洗3次。用激光共聚焦顯微鏡(Zeiss，Jena，Germany)進(jìn)行熒光觀察。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 林丹對HepG2細(xì)胞活力和LDH釋放水平的影響

HepG2細(xì)胞經(jīng)不同濃度的林丹暴露處理24 h后，使用MTT法檢測細(xì)胞的活力。如圖1(a)所示，林丹暴露質(zhì)量濃度為20、50和100 mg/L時，HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活力分別為96%、85%和49.7%，IC50值為84 mg/L。這些結(jié)果表明，隨著林丹暴露濃度增加，細(xì)胞活力逐漸降低，呈濃度依賴性關(guān)系。結(jié)合現(xiàn)有林丹的細(xì)胞毒性和相關(guān)文獻(xiàn)報道的實驗結(jié)果[12]，選擇林丹質(zhì)量濃度50 mg/L開展后續(xù)研究工作。此外，乳酸脫氫酶(LDH)的活性可以作為肝功能損傷的生物標(biāo)志物[13]，當(dāng)林丹暴露處理HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞的LDH活性增加，是對照組細(xì)胞的1.2倍，如圖1(b)所示。以上結(jié)果表明，林丹暴露可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞毒性。

林丹暴露對細(xì)胞活力(a)和細(xì)胞內(nèi)LDH活性(b)的影響。*表示P<0.05，**表示P<0.01。圖1 林丹對HepG2細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of lindane on the HepG2 cell viability

2.2 林丹誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的生成

ROS與細(xì)胞生長、免疫應(yīng)答及信號傳遞密切相關(guān)[9]。正常生理條件下，體內(nèi)的ROS生成和清除處于動態(tài)平衡[14]。為評價林丹暴露是否誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS生成，分別使用活性氧熒光探針DCFH-DA和超氧陰離子熒光探針DHE進(jìn)行檢測。當(dāng)DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞后，其被非特異性脂酶胞內(nèi)裂解成二氯熒光素(DCFH)，細(xì)胞內(nèi)的ROS可以快速氧化DCFH為高度綠色熒光的2，7-二氯熒光素(DCF)[15]，其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS水平呈正比。因此，可以將其作為反映ROS生成水平的指標(biāo)。超氧陰離子作為活性氧的一種，我們也檢測了其含量，紅色熒光強(qiáng)度正比于超氧陰離子的含量。圖2(a)和2(b)分別顯示林丹處理顯著增加HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS和超氧陰離子含量，其生成水平分別是對照組的4.7倍和1.4倍，如圖2(c)、2(d)所示。該結(jié)果提示，林丹暴露誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)生成大量ROS。

2.3 林丹降低HepG2細(xì)胞的抗氧化酶活性

當(dāng)機(jī)體受到外界環(huán)境刺激時，體內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，為維持生物體的正常功能，體內(nèi)的氧化與抗氧化系統(tǒng)便會發(fā)揮作用[16]。機(jī)體依賴2類抗氧化系統(tǒng)清除體內(nèi)過多的ROS：一類為抗氧化分子，包括維生素C、維生素E、谷胱甘肽等；另一類為抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等[17]。其中CAT是最主要的H2O2清除酶，在活性氧清除過程中具有重要的作用[18]。我們檢測了林丹處理后細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶的活性，結(jié)果表明，與對照組相比，林丹暴露組細(xì)胞的CAT活性下降27%(圖3),表明HepG2細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，機(jī)體的防御機(jī)制受損。過氧化氫酶活性的變化進(jìn)一步證明林丹誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。以上實驗提示HepG2細(xì)胞暴露于林丹后，產(chǎn)生大量活性氧物種，引起氧化應(yīng)激。

(a)DCFH-DA和(b)DHE染色HepG2細(xì)胞對照組和林丹暴露組的明場像(上)和熒光像(下)；統(tǒng)計分析結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)活性 氧水平(c)和超氧陰離子水平(d)。**表示P<0.01。圖2 林丹誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)Fig.2 Lindane triggers intracellular ROS generation in HepG2 cells

*表示P<0.05。圖3 林丹對HepG2細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶活性的影響Fig.3 Effect of lindane on the activity of catalase in HepG2 cells

2.4 林丹對HepG2細(xì)胞促炎細(xì)胞因子表達(dá)的影響

研究表明，氧化應(yīng)激造成蛋白、DNA、細(xì)胞器等氧化損傷，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[19]。因此，為進(jìn)一步確定林丹對HepG2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，我們檢測了相關(guān)促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8的表達(dá)。RT-PCR實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，林丹暴露24 h后均明顯增加各促炎細(xì)胞因子表達(dá)量，其中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8的mRNA表達(dá)水平分別為對照組的1.9、1.7、5.5和3.9倍(圖4)。其中TNF-α作為平衡細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、存活、凋亡和壞死的調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)量上調(diào)表明細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、存活等過程失調(diào)[20]。而IL-6作為促炎細(xì)胞因子之一，在慢性炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其表達(dá)量增加為慢性炎癥的發(fā)展提供有利環(huán)境[21]。而這些促炎細(xì)胞因子的大量分泌，可能會導(dǎo)致炎癥性疾病的患病風(fēng)險。核因子κB(NF-κB)是一組二聚體轉(zhuǎn)錄因子，具有多向調(diào)節(jié)作用，在多個基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)中發(fā)揮重要作用[22]。如圖4所示，NF-κBmRNA表達(dá)量為對照組的1.5倍。表明林丹暴露后激活HepG2細(xì)胞的NF-κB，顯著上調(diào)促炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β等的表達(dá)，改變細(xì)胞的促炎微環(huán)境，并誘發(fā)炎癥反應(yīng)[23]。

蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果進(jìn)一步驗證了IL-1β蛋白的過表達(dá)，與對照組相比，林丹暴露上調(diào)IL-1β的蛋白表達(dá)量為對照組的1.9倍，如圖5所示。

*表示P<0.05，**表示P<0.01。圖4 林丹上調(diào)HepG2細(xì)胞的促炎細(xì)胞因子表達(dá)Fig.4 Effects of lindane on the expressions of related pro-inflammatory factors genes in HepG2 cells

*表示P<0.05。圖5 林丹上調(diào)HepG2細(xì)胞炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.5 Effects of lindane on the expressions of proteins related to inflammation in HepG2 cells

另外，實驗結(jié)果表明，林丹上調(diào)了磷酸化p65(P-p65)的表達(dá)，顯示林丹激活NF-κB信號通路。

2.5 林丹對HepG2細(xì)胞內(nèi)NF-κB表達(dá)的影響

NF-κB被稱為氧化應(yīng)激敏感型轉(zhuǎn)錄因子，其入核后上調(diào)促炎介質(zhì)表達(dá)，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，在維持肝臟穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用[24]。NF-κB是P65和P50的二聚體，與IκB以三聚體非活化的狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到外來刺激處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，IκB蛋白磷酸化，NF-κB被激活并進(jìn)入細(xì)胞核中，調(diào)控其下游蛋白的表達(dá)[22]。為探究NF-κB的表達(dá)情況，分別用紅色和藍(lán)色熒光標(biāo)記NF-κB和細(xì)胞核，使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。如圖6結(jié)果所示，林丹暴露處理HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞核內(nèi)的紅色熒光強(qiáng)度顯著增加，表明林丹誘導(dǎo)的NF-κB入核表達(dá)與其調(diào)控的下游促炎細(xì)胞因子表達(dá)相關(guān)，參與HepG2細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

圖6 林丹誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的NF-κB表達(dá)Fig.6 Lindane triggers the expression of NF-κB in HepG2 cells

2.6 林丹誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的自噬反應(yīng)

ROS作為一種胞內(nèi)信號分子參與細(xì)胞內(nèi)的各種生化反應(yīng)[25]。研究表明，氧化應(yīng)激除誘導(dǎo)ROS生成外，還引起自噬反應(yīng)，ROS作為信號分子介導(dǎo)細(xì)胞的自噬性死亡[26]。自噬是在各種代謝壓力和外在因素刺激下的一種應(yīng)激性反應(yīng)，被認(rèn)為是細(xì)胞自穩(wěn)的保護(hù)機(jī)制。自噬發(fā)生過程中，磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)可以包裹細(xì)胞內(nèi)待降解的壞死細(xì)胞器等，形成自噬小體，隨后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，進(jìn)一步降解包裹物用于細(xì)胞自身的代謝[27]。Beclin1、ULK1作為正向調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)水平可作為自噬水平的指標(biāo)[28]。如圖7(a)所示，檢測其mRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明，與對照組相比，林丹顯著上調(diào)Beclin1與ULK1的mRNA水平，分別為對照組的1.7和1.6倍。LC3蛋白作為自噬發(fā)生的特異性標(biāo)志物，LC3前體蛋白在細(xì)胞內(nèi)加工為可溶性LC3 Ⅰ蛋白，其被活化后，與自噬囊膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，轉(zhuǎn)化為LC3 Ⅱ，定位于前自噬體和自噬體上，因此LC3 Ⅱ的水平可以反映出自噬小體的數(shù)量[29]。圖7(b)結(jié)果表明LC3 Ⅱ的表達(dá)量增加，為對照組的2.3倍。這表明林丹誘導(dǎo)細(xì)胞自噬小體數(shù)量增多，細(xì)胞發(fā)生自噬反應(yīng)。P62作為反映自噬在溶酶體中降解活性的標(biāo)志性蛋白[30]。但是，本實驗的結(jié)果發(fā)現(xiàn)林丹升高P62的表達(dá)水平，如圖7(a)和7(b)所示，提示自噬小體在溶酶體中的降解過程受到抑制。由此推測，在林丹暴露誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的自噬小體生成，但其沒有與溶酶體結(jié)合。已有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬與炎癥反應(yīng)二者之間存在雙向的調(diào)節(jié)作用[31]。以上實驗結(jié)果提示，林丹暴露誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和自噬生成。由此推測，在林丹暴露下自噬可以通過其細(xì)胞保護(hù)作用抑制炎癥因子的釋放和降低炎癥反應(yīng)，但其作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步的研究。

*表示P<0.05。圖7 林丹上調(diào)HepG2細(xì)胞自噬相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)Fig.7 Effects of lindane on the expressions of genes and proteins related to autophagy in HepG2 cells

3 結(jié)論

在本研究中，高濃度林丹暴露顯著降低HepG2的細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和自噬，損傷肝細(xì)胞功能，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。綜上所述，林丹暴露誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激，增加細(xì)胞自噬水平，并激活NF-κB信號通路引起細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。該結(jié)果提示林丹誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激在其細(xì)胞毒性中發(fā)揮著重要作用。