陳東亮， 鐘 楚， 簡(jiǎn)少芬， 韋坤華， 李萬(wàn)銀， 繆劍華

(廣西壯族自治區(qū)藥用植物園廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西壯族自治區(qū)藥用植物園/廣西壯族自治區(qū)中藥資源智慧創(chuàng)制工程研究中心， 南寧 530023)

菘藍(lán)(IsatisindigoticaFort.)為十字花科(Brassicaceae)菘藍(lán)屬藥用植物，又名茶藍(lán)、板藍(lán)根、大青葉等。菘藍(lán)莖直立，綠色，頂部多分枝，植株光滑無(wú)毛，帶白粉霜，根(板藍(lán)根)、葉(大青葉)均供藥用，有清熱解毒、涼血消斑、利咽止痛的功效。葉還可提取藍(lán)色染料；種子榨油，供工業(yè)用[1]。菘藍(lán)屬大宗中藥材，全國(guó)各地均有栽培[2]。近年來(lái)，菘藍(lán)的種植面積以及種子的需求量也有所提高。而高活力的種子是中藥材規(guī)?；N植的前提和有效保證。

藥用植物種子活力的高低直接反映了該植物在田間生產(chǎn)的出苗率和出苗時(shí)間，影響藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量，間接決定了中藥材生產(chǎn)效率和生產(chǎn)成本。然而，種子在貯藏過(guò)程中受種子本身含水量、貯藏溫度、貯藏空間相對(duì)濕度、生物因素及貯藏時(shí)間等諸多因素的影響，會(huì)發(fā)生不可逆的劣變衰老現(xiàn)象，導(dǎo)致活力降低[3-4]。種子劣變的外在表現(xiàn)為萌發(fā)率降低、出苗延遲、一致性降低、幼苗生長(zhǎng)異常，最終導(dǎo)致產(chǎn)量和生產(chǎn)效率降低[5]，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失。同時(shí)種子內(nèi)部還伴隨著一系列復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，如蛋白質(zhì)合成障礙、DNA損傷、基因表達(dá)紊亂、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解、細(xì)胞組織損傷、次生代謝物質(zhì)積累及抗氧化酶系統(tǒng)活性降低等[6-8]。由于種子自然老化需要較長(zhǎng)的時(shí)間，為了便于研究，Rajjou等[9]提出了人工加速老化的方法。種子引發(fā)技術(shù)是基于種子萌發(fā)的生物學(xué)機(jī)制提出的[10]。主要通過(guò)滲透調(diào)節(jié)、溫度調(diào)節(jié)、氣體調(diào)節(jié)和激素調(diào)節(jié)等方式促進(jìn)種子萌發(fā)，并且提高萌發(fā)時(shí)間的穩(wěn)定率和萌發(fā)整齊率，減小萌發(fā)時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)差，提高苗的抗性和素質(zhì)、改善營(yíng)養(yǎng)狀況，是一種提高老化種子萌發(fā)的有效途徑[11]?？箟难?AsA)[12-13]、水楊酸(SA)[14-15]、聚乙二醇(PEG-6000)[16-18]、赤霉素(GA3)[13,19-20]、雙氧水(H2O2)[21-22]等種子引發(fā)劑被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。然而，目前對(duì)菘藍(lán)種子的老化規(guī)律及種子活力修復(fù)的研究卻鮮有報(bào)道。

本研究利用人工加速老化的方法對(duì)菘藍(lán)種子進(jìn)行不同程度的老化處理，測(cè)定不同老化程度的菘藍(lán)種子發(fā)芽情況和抗氧化系統(tǒng)酶活性，并用不同引發(fā)劑對(duì)人工加速老化的種子進(jìn)行引發(fā)處理，分析其萌發(fā)特性，旨在探索人工老化和不同引發(fā)劑引發(fā)處理對(duì)菘藍(lán)種子萌發(fā)特性及生理特性的影響，以期為菘藍(lán)種子安全貯藏、高效率育苗和人工栽培提供科學(xué)指導(dǎo)，為菘藍(lán)種子老化機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

菘藍(lán)種子是2019年從河北保定收獲的地方品種。采集后經(jīng)陰干、篩選，獲得凈種子(百粒重0.270 4 g，含水量8%)。置于4 ℃冰箱中保存，2020年9月做人工老化處理及相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2 方 法

1.2.1人工老化處理

在玻璃干燥器底部裝入適量清水，蓋好蓋子后置于恒溫烘干箱內(nèi)，打開(kāi)烘箱，調(diào)至45 ℃，待容器內(nèi)溫度和相對(duì)濕度分別穩(wěn)定在45 ℃和100%時(shí)，將供試種子均勻的攤置于尼龍紗網(wǎng)袋內(nèi)，將網(wǎng)袋置于容器內(nèi)，蓋好容器蓋，關(guān)閉烘箱箱門，開(kāi)始計(jì)時(shí)。在該條件下進(jìn)行人工加速老化處理2 d(A 2 d)和4 d(A 4 d)，以不做老化處理的種子作對(duì)照(ck)。處理完成后立即進(jìn)行引發(fā)處理。

1.2.2引發(fā)處理

將ck和老化處理后的菘藍(lán)種子分別用抗壞血酸(0、200 mg·L-1、400 mg·L-1、600 mg·L-1)、PEG-6000(0、10%、20%、30%)和GA3(0、200 mg·L-1、400 mg·L-1、600 mg·L-1)溶液浸種24 h，ck組用蒸餾水浸種。浸種結(jié)束后，用去離子水將殘留在種子表面的引發(fā)劑充分漂洗干凈。

1.2.3種子發(fā)芽試驗(yàn)

在直徑為9 cm的一次性培養(yǎng)皿內(nèi)平鋪3層定性濾紙，用蒸餾水充分濕潤(rùn)濾紙作為發(fā)芽床。用70%酒精對(duì)種子進(jìn)行表面消毒2 min，在發(fā)芽床上等距離置床100粒種子，置于溫度為25 ℃，光強(qiáng)為5 000 lx，光照周期為12 h光/12 h暗的恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)。種子萌發(fā)期間始終保持發(fā)芽床濕潤(rùn)。置床后第2天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，第7天統(tǒng)計(jì)總發(fā)芽率、下胚軸長(zhǎng)(cm)及初生根長(zhǎng)(cm)。每個(gè)處理3次重復(fù)，每重復(fù)1皿。

1.2.4生理指標(biāo)測(cè)定

取0.2 g樣品置于預(yù)冷的研缽中，加入2 mL 50 mmol·L-1的磷酸緩沖液(pH=7.8)，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中，4 ℃ 12 000 g下離心20 min，上清液為待測(cè)酶液。超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性參照李合生[23]的方法進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.5數(shù)據(jù)分析方法

用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用IBM SPSS 20.0軟件的單因素方差分析法(LSD法)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和多重比較分析。

2 結(jié)果分析

2.1 老化對(duì)菘藍(lán)種子發(fā)芽特性的影響

菘藍(lán)種子經(jīng)老化處理后，隨著老化天數(shù)的增加，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、下胚軸長(zhǎng)和主根長(zhǎng)變化趨勢(shì)基本一致，即隨著老化程度的加深而逐漸降低(圖1)。其中，ck的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、下胚軸長(zhǎng)及主根長(zhǎng)分別為53.33%、73.33%、3.43 cm和1.39 cm。A 2 d的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和下胚軸長(zhǎng)分別減小至10.67%、58.00%和2.52 cm，且均達(dá)極顯著水平(p<0.01)；A 4 d與ck相比，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、下胚軸長(zhǎng)和主根長(zhǎng)分別減小至2.00%、19.33%、1.04 cm和0.42 cm，且差異均達(dá)極顯著水平(p<0.01)。

2.2 老化對(duì)菘藍(lán)種子生理特性的影響

從圖2可以看出，SOD、POD和CAT活性變化的趨勢(shì)基本一致，其活性均隨著老化程度的加深而逐漸降低。未經(jīng)老化處理的菘藍(lán)種子SOD活性為245.53 U·g-1，A 2 d和A 4 d的菘藍(lán)種子SOD活性分別降低至198.46 U·g-1和173.35 U·g-1，差異達(dá)顯著水平(p<0.05)。未經(jīng)老化處理的菘藍(lán)種子POD活性為2 022.95 U·(g·min)-1，A 2 d和A 4 d的菘藍(lán)種子POD活性分別降低至1 260.53 U·(g·min)-1和396.43 U·(g·min)-1，差異達(dá)極顯著水平(p<0.01)。未經(jīng)老化處理的菘藍(lán)種子CAT活性為3 626.21 U·(g·min)-1，A 2 d和A 4 d的菘藍(lán)種子CAT活性分別降低至2 959.01 U·(g·min)-1和1 375.60 U·(g·min)-1，差異達(dá)極顯著水平(p<0.01)。

2.3 引發(fā)處理對(duì)老化菘藍(lán)種子萌發(fā)特性的影響

2.3.1AsA引發(fā)對(duì)老化菘藍(lán)種子發(fā)芽特性的影響

由圖3可以看出，與ck相比，200 mg·L-1、400 mg·L-1和600 mg·L-1的AsA溶液引發(fā)均能使未經(jīng)老化(ck)的菘藍(lán)種子發(fā)芽勢(shì)從53.33%分別提高到64.67%、79.33%和66.67%，且差異均達(dá)極顯著水平(p<0.01)。400 mg·L-1和600 mg·L-1的AsA溶液引發(fā)均能使ck的菘藍(lán)種子發(fā)芽率從73.33%分別提高92.67%和90.00%，且差異均達(dá)極顯著水平(p<0.01)。

由圖3可知，與ck相比，200 mg·L-1、400 mg·L-1和600 mg·L-1的AsA溶液引發(fā)均能使人工加速老化2 d(A 2 d)的菘藍(lán)種子發(fā)芽勢(shì)從10.67%分別提高到30.00%、52.67%和58.67%，且差異均達(dá)極顯著水平(p<0.01)。400 mg·L-1和600 mg·L-1的AsA溶液引發(fā)均能使人工加速老化2 d(A 2 d)的菘藍(lán)種子發(fā)芽率從58.00%分別提高到70.67%和76.67%，且差異均達(dá)極顯著水平(p<0.01)。

由圖3可知，與ck相比，200 mg·L-1、400 mg·L-1和600 mg·L-1的AsA溶液引發(fā)均能使人工加速老化4 d(A 4 d)的菘藍(lán)種子發(fā)芽勢(shì)從2.00%分別提高到9.33%、21.33%和31.33%，且差異均達(dá)極顯著水平(p<0.01)。400 mg·L-1和600 mg·L-1的AsA溶液引發(fā)均能使人工加速老化4 d(A 4 d)的菘藍(lán)種子發(fā)芽率從19.33%分別提高到37.33%和44.67%，且差異均達(dá)極顯著水平(p<0.01)。

綜上，200 mg·L-1、400 mg·L-1和600 mg·L-1的AsA溶液引發(fā)均能顯著提高ck和經(jīng)人工加速老化處理2 d(A 2 d)、4 d(A 4 d)的菘藍(lán)種子的發(fā)芽勢(shì)。而400 mg·L-1和600 mg·L-1的AsA溶液引發(fā)則可極顯著提高ck和經(jīng)人工加速老化處理2 d(A 2 d)、4 d(A 4 d)的菘藍(lán)種子的發(fā)芽率。

2.3.2PEG-6000引發(fā)對(duì)老化菘藍(lán)種子發(fā)芽特性的影響

從圖4可以看出，用濃度分別為10%和30%的PEG-6000溶液引發(fā)后，菘藍(lán)種子發(fā)芽率分別為70.66%和74.67%，與ck處理的菘藍(lán)種子發(fā)芽率73.33%相比無(wú)顯著差異。而當(dāng)被濃度為20%的PEG-6000溶液引發(fā)后，發(fā)芽率極顯著高于ck(p<0.01)，為86.33%。從發(fā)芽勢(shì)分析，用濃度為20%的PEG-6000溶液引發(fā)后，發(fā)芽勢(shì)上升至70%，高于ck處理的菘藍(lán)種子53.33%，差異達(dá)極顯著水平(p<0.01)。10%的PEG-6000溶液引發(fā)處理后，發(fā)芽勢(shì)與ck無(wú)顯著差異，30%的PEG-6000溶液引發(fā)處理后，發(fā)芽勢(shì)顯著低于ck。結(jié)果表明，20%濃度的PEG-6000溶液引發(fā)可提高菘藍(lán)種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)。

由圖4可見(jiàn)，老化處理2 d的菘藍(lán)種子發(fā)芽率為58%，經(jīng)濃度為10%的PEG-6000溶液引發(fā)后，發(fā)芽率與未經(jīng)引發(fā)劑處理的A 2 d的菘藍(lán)種子相比無(wú)顯著差異，為64.67%，當(dāng)用濃度為30%的PEG-6000溶液引發(fā)處理后，發(fā)芽率為66%，顯著高于未經(jīng)引發(fā)劑處理的A 2 d的菘藍(lán)種子(p<0.05)。當(dāng)用濃度為20%的PEG-6000溶液引發(fā)后，發(fā)芽率極顯著高于未經(jīng)引發(fā)劑處理的A 2 d的菘藍(lán)種子(p<0.01)，為71.67%，從發(fā)芽勢(shì)上分析，A 2 d的菘藍(lán)種子發(fā)芽勢(shì)為10.67%，當(dāng)用濃度為20%的PEG-6000溶液引發(fā)后，發(fā)芽勢(shì)極顯著高于未經(jīng)引發(fā)劑處理的A 2 d的菘藍(lán)種子(p<0.01)，上升至22.67%。結(jié)果表明，20%濃度的PEG-6000溶液引發(fā)可提高經(jīng)45 ℃高溫、100%高濕老化處理2 d的菘藍(lán)種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)。

由圖4可見(jiàn)，A 4 d的菘藍(lán)種子發(fā)芽率僅為19.33%，當(dāng)用濃度為10%和30%的PEG-6000溶液引發(fā)后，發(fā)芽率均與ck無(wú)顯著差異，分別為14.66%和22%，當(dāng)用濃度為20%的PEG-6000溶液引發(fā)后，發(fā)芽率極顯著高于ck(p<0.01)，上升至29.33%。從發(fā)芽勢(shì)上分析，老化處理2 d的菘藍(lán)種子發(fā)芽勢(shì)僅為2%，當(dāng)用濃度為20%的PEG-6000溶液引發(fā)后，發(fā)芽勢(shì)極顯著高于ck(p<0.01)，上升至9.3%。而用濃度為10%和30%的PEG-6000溶液引發(fā)后，發(fā)芽勢(shì)均與ck無(wú)顯著差異，分別為3.66%和3%。結(jié)果表明，20%濃度的PEG-6000溶液引發(fā)可提高經(jīng)45 ℃高溫、100%高濕A 4 d的菘藍(lán)種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)。

綜上，20%的PEG-6000溶液引發(fā)可顯著提高未經(jīng)老化處理(ck)和經(jīng)45 ℃高溫、100%高濕老化處理2 d(A 2 d)、4 d(A 4 d)的菘藍(lán)種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)。

2.3.3GA3引發(fā)對(duì)老化菘藍(lán)種子發(fā)芽特性的影響

由圖5可見(jiàn)，200 mg·L-1、400 mg·L-1的GA3溶液引發(fā)均能使菘藍(lán)種子發(fā)芽勢(shì)從未經(jīng)老化(ck)的53.33%分別提高到62.00%和76.00%，且差異分別達(dá)顯著(p<0.05)和極顯著水平(p<0.01)。200 mg·L-1和400 mg·L-1的GA3溶液引發(fā)均能使未經(jīng)老化(ck)的菘藍(lán)種子發(fā)芽率從73.33%分別提高到88.67%和94.67%，且差異均達(dá)極顯著水平(p<0.01)。

由圖5可知，與ck相比，200 mg·L-1和400 mg·L-1的GA3溶液引發(fā)均能使經(jīng)人工老化2 d(A 2 d)的菘藍(lán)種子發(fā)芽勢(shì)從10.67%分別提高到40.00%和40.62%，且差異均達(dá)極顯著水平(p<0.01)。200 mg·L-1和400 mg·L-1的GA3溶液引發(fā)均能使經(jīng)人工老化2 d(A 2 d)的菘藍(lán)種子發(fā)芽率從58.00%分別提高到71.33%和80.00%，且差異均達(dá)極顯著水平(p<0.01)。

圖5可知，與ck相比，400 mg·L-1的GA3溶液引發(fā)能使經(jīng)人工加速老化4 d(A 4 d)的菘藍(lán)種子發(fā)芽勢(shì)從2.00%提高到10.67%，且差異達(dá)極顯著水平(p<0.01)。200 mg·L-1和400 mg·L-1的GA3溶液引發(fā)均能使經(jīng)人工加速老化4 d(A 4 d)的菘藍(lán)種子發(fā)芽率從19.33%分別提高到36.00%和42.00%，且差異均達(dá)極顯著水平(p<0.01)。

綜上，200 mg·L-1和400 mg·L-1的GA3溶液引發(fā)可顯著提高未經(jīng)老化(ck)和經(jīng)人工加速老化2 d(A 2 d)的菘藍(lán)種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率，同時(shí)可顯著提高經(jīng)人工加速老化4 d(A 4 d)的菘藍(lán)種子發(fā)芽率，而400 mg·L-1的GA3溶液引發(fā)可顯著提高經(jīng)人工加速老化4 d(A 4 d)的菘藍(lán)種子發(fā)芽勢(shì)。

3 討 論

一般自然條件下種子衰老時(shí)間長(zhǎng)達(dá)數(shù)年甚至數(shù)十年，研究種子老化特征及種子耐貯性較為困難。通過(guò)人工加速老化的方法可快速預(yù)測(cè)種子的耐貯性[24]。種子處在高溫、高濕的密閉環(huán)境下，一方面無(wú)氧呼吸作用會(huì)加快，產(chǎn)生酒精和CO2，酒精積累過(guò)多對(duì)種胚有毒害作用[9,25]；另一方面，種子內(nèi)貯藏物質(zhì)和能量消耗的加劇[26]，導(dǎo)致種子現(xiàn)有的物質(zhì)代謝和能量代謝供應(yīng)減少，難以滿足種子正常萌發(fā)所需的物質(zhì)代謝和能量代謝需求，抑制了種胚正常發(fā)育以及幼苗正常生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、種子活力、發(fā)芽指數(shù)等萌發(fā)指標(biāo)下降，幼苗矮小。在人工加速老化過(guò)程中，一般老化處理時(shí)間越長(zhǎng)、溫度越高、濕度越大，種子劣變速度越快，萌發(fā)指標(biāo)下降也就越快。吳漢花等[27]在高溫(42 ℃)高濕(相對(duì)濕度100%)條件下，分別人工老化處理十字花科植物不結(jié)球白菜種子2 d和4 d后，其發(fā)芽率比ck分別降98.63%和89.04%。而本研究將菘藍(lán)種子置于45 ℃和100%相對(duì)濕度的密閉條件下，分別老化處理2 d和4 d后，發(fā)芽率分別降低至ck的79.1%和26.36%。老化4 d的菘藍(lán)種子發(fā)芽率僅為19.3%。而Jiang F L等[25]的研究表明，在42 ℃高溫和100%高濕條件下，分別老化處理十字花科植物大白菜種子2 d和4 d后發(fā)芽率分別降低至對(duì)照的81.88%和18.12%，與本研究結(jié)果較為一致。

種子老化過(guò)程往往伴隨著膜脂過(guò)氧化，保護(hù)酶活性下降，蛋白質(zhì)降解，相關(guān)基因調(diào)控通路紊亂以及遺傳物質(zhì)降解等生理生化反應(yīng)[28]。種子抗氧化系統(tǒng)酶活性降低是導(dǎo)致種子劣變的主要原因之一[16]。研究表明，水稻[31]、玉米[32]、小麥[33]、大豆[34]、棉花[35]、油菜[36]等農(nóng)作物種子貯藏過(guò)程中SOD、POD和CAT等酶活性逐漸降低。本研究結(jié)果表明，隨著老化進(jìn)程的不斷加深，菘藍(lán)種子SOD、POD和CAT活性顯著降低。因此，對(duì)菘藍(lán)種子SOD、POD和CAT活性檢測(cè)可間接預(yù)測(cè)菘藍(lán)種子老化程度，對(duì)菘藍(lán)種子質(zhì)量評(píng)價(jià)具有重要意義。

種子在貯藏過(guò)程中伴隨著的衰老劣變現(xiàn)象雖不可避免，但可通過(guò)種子引發(fā)技術(shù)進(jìn)行活力修復(fù)。已有大量研究認(rèn)為，老化的野菊花[16]、白菜[17]、遠(yuǎn)志[18]、燕麥[37]、紫蘇[38]、大麥[39]、玉米[40]等種子經(jīng)PEG引發(fā)后活力提高[41]。本研究表明，未經(jīng)老化處理的菘藍(lán)種子經(jīng)20%的PEG引發(fā)后發(fā)芽率提高了17.80%，與孟靜靜等[42]研究結(jié)果相符。研究認(rèn)為，AsA引發(fā)和GA3[13,19-20]引發(fā)可提高某些植物老化種子的活力，與本研究結(jié)果也不盡相同。本研究發(fā)現(xiàn)的菘藍(lán)種子老化規(guī)律及老化種子活力修復(fù)方法可為菘藍(lán)種子的安全貯藏提供一定的理論參考，為提高菘藍(lán)種子活力提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。