李明蔓， 鄧祥勝， 楊 梅， 劉世男， 程 飛

(廣西大學(xué)林學(xué)院， 南寧 530004)

西蒙得木(SimmondsiachinensisLink)是雙子葉植物綱西蒙得木科西蒙得木屬的常綠沙漠灌木，種子富含45%～50%的液態(tài)蠟脂，蠟脂具有天然、純凈、性能穩(wěn)定、燃點高、沸點低、抗氧化等特性，是化妝品工業(yè)不可取代的基本原料，是航空航天及精密儀器專用高級潤滑油；醫(yī)藥上，有防治癌癥、高血壓、冠心病、胃外傷等病的作用，故其開發(fā)和經(jīng)濟價值很高，被譽為“液體黃金”[1]。西蒙得木原產(chǎn)于美國和墨西哥的“索諾拉荒漠”地區(qū)，現(xiàn)已被廣泛引種到以色列、阿根廷等國家，創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟價值，產(chǎn)生了良好的生態(tài)效益。

西蒙得木原產(chǎn)地“索諾拉荒漠”地區(qū)，地屬亞熱帶，氣候干旱少雨，年平均氣溫21.4～23 ℃，年降雨量210～634 mm。諸遠章[1]通過對西蒙得木試種點與原產(chǎn)地生態(tài)因子和植被進行對比分析認為，影響西蒙得木生長發(fā)育的主要生態(tài)因子是氣溫、雨量和土壤，在年平均氣溫19.4～23.9 ℃、年降雨量500～800 mm、沖積沙壤土上西蒙得木生長良好。朱大業(yè)等[2]根據(jù)西蒙得木生態(tài)學(xué)特性和氣候相似引種理論、模糊識別原理，對西蒙得木原產(chǎn)地和引種地的氣候條件進行分析對比，劃分出國內(nèi)適宜引種區(qū)、較適宜引種區(qū)、可能引種區(qū)、不宜引種區(qū)，其中廣西南寧屬于適宜引種區(qū)。本課題組于2017年8月在南寧試種了一批西蒙得木，2019年11月首次開花，說明西蒙得木在南寧可由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長，有在南寧引種成功的可能(圖1)。

圖1 2021年2月西蒙得木雄花(廣西南寧)

已有引種研究表明，西蒙得木適宜栽植氣候條件為：極端低溫(>-5 ℃)，年平均氣溫>18 ℃，>10 ℃的有效積溫不少于5 500 ℃，光照時數(shù)不少于1 700 h[3]。廣西南寧各地年平均氣溫為20.9～21.9 ℃，氣溫年較差為15.2～16.6 ℃，≥10 ℃積溫約7 527 ℃，年日照時數(shù)可達1 705 h，可見廣西南寧具備西蒙得木適宜生長的氣候條件。然而，南寧各地年降水量為1 013～1 505 mm[4]，遠高于原產(chǎn)地，略高于四川會東(700～1 100 mm)。因此，作為旱生植物，西蒙得木在南寧能否引種成功，取決于其對水分的適應(yīng)能力、土壤質(zhì)地情況和人為土壤改良措施。

當(dāng)前，國內(nèi)西蒙得木繁育以種子繁殖為主，還未商業(yè)化無性繁殖苗木。盡管西蒙得木不似其他生活在沙漠地區(qū)的一年生植物，種子遇適宜降水便迅速完成生活史，但因其種皮薄，對水分具有較高敏感性，短時間浸種(如4 h)或放在濕潤的發(fā)芽紙上，于恒溫恒濕條件下種子也能萌發(fā)。短期水分處理下，種子吸水未達到飽和，部分種子種皮仍保持褶皺，不夠飽滿，但浸種24 h的種子會腐爛且出苗率較低[5]。因此，探究浸種時間對西蒙得木種子萌發(fā)的影響具有重要意義。

浸種可使種子加速吸水，充分膨脹，軟化種皮，提高水解酶活性，促進貯藏物質(zhì)水解，達到有利于種子萌發(fā)的狀態(tài)[6-7]，從而使播種后出苗快而整齊。但浸種時間太短時，種子吸水不足，種胚內(nèi)部酶類等大分子物質(zhì)和細胞器活化較慢，影響種子萌發(fā)[8]；浸種時間過長時，種子吸水過多，無氧呼吸嚴重，貯藏的可溶性養(yǎng)分外滲，易受病原菌感染，影響種子生活力[9]。實際上，不論浸種時間長短，總有部分西蒙得木種子萌發(fā)遲緩，導(dǎo)致發(fā)芽期延長，出苗不整齊，因此，種子萌發(fā)還依賴于其內(nèi)部的生理變化。具有活力的種子胚乳或子葉中貯藏著大量營養(yǎng)物質(zhì)，通過一定時間的休眠或解除休眠后給予適當(dāng)?shù)拿劝l(fā)條件，就能正常萌發(fā)成為植株，種子萌發(fā)所需要的養(yǎng)料與能量主要來自蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪等貯藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與利用[10]。在浸種處理下西蒙得木種子貯藏物質(zhì)的動員規(guī)律及其轉(zhuǎn)化程度對種子萌發(fā)可能起到了關(guān)鍵作用，還需要更加深入的探討。

傅里葉變換紅外光譜具有鑒別物質(zhì)可靠性強、分析快速、樣品用量少等優(yōu)點。從樣品的紅外光譜可知樣品分子結(jié)構(gòu)信息，從樣品紅外光譜中吸收峰的位置和強度，可知樣品分子中可能含有的基團和基團數(shù)量，從而對樣品組分進行定性和定量分析[11]。目前已應(yīng)用于快速檢測種子老化過程中或農(nóng)作物種子發(fā)芽時水分、蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)的變化[12-14]，本試驗利用傅里葉變換紅外光譜揭示不同浸種時間不同發(fā)芽階段的西蒙得木種子貯藏物質(zhì)動員情況，可為今后西蒙得木的引種繁育提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗所用西蒙得木(SimmondsiachinensisLink)種子購自四川會東，為2019上半年所采種子，種子在試驗前一直密封干燥低溫保存。挑選完整飽滿、大小均勻、健康的種子作為試驗材料。

1.2 方 法

1.2.1西蒙得木種子吸水規(guī)律測定

隨機抽取40粒西蒙得木種子，稱其干重后，置于塑料盆(上口直徑19 cm，高6.5 cm)中加蒸餾水1 L進行浸種，每隔2 h取出，用濾紙吸干表面水分，準確稱量，連續(xù)測定36 h，設(shè)置3個重復(fù)。采用質(zhì)量法測定種子吸水進程，計算種子的吸水率[15]，并繪制種子吸水率曲線。

吸水率(%)=[(B-A)/A]×100%，式中：A為吸水前重量，B為吸水后重量。

1.2.2西蒙得木種子紅外光譜測定

1) 浸種處理

挑選完整飽滿、大小均勻、健康的種子360粒浸泡于0.5%(W∶V)KMnO4溶液30 min，取出用蒸餾水沖洗3次。取30粒消毒后的種子于塑料盆(上口直徑19 cm，高6.5 cm)中，加蒸餾水1 L進行浸種。設(shè)置4個浸種時間，分別為4 h、10 h、16 h和24 h，每個處理3次重復(fù)。采用紙上發(fā)芽床法，將浸種后的種子均勻散放在墊有一張濕潤發(fā)芽紙的發(fā)芽盆(32 cm×25 cm×11 cm)上，置于通風(fēng)、無光照的30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)芽，以種子著床當(dāng)天為第1天，保持紙床水分充足3～7 d，每天更換發(fā)芽紙床，記錄種子發(fā)芽情況。據(jù)前期預(yù)實驗觀察結(jié)果可知，相比短時間浸種，浸種10 h的種子發(fā)芽率更高，而浸種時間過長則容易污染，因此以浸種10 h的處理為標(biāo)準，當(dāng)其發(fā)芽率達到50%時終止所有發(fā)芽實驗。種子萌發(fā)過程可分為吸脹、萌動、發(fā)芽3個階段[16]。本研究從每個發(fā)芽盆中挑選出吸脹、萌動和萌發(fā)3個階段的種子用于后續(xù)紅外光譜測定，種子的吸脹程度與浸種時間有關(guān)；萌動種子表現(xiàn)為種皮開裂，露出胚根，即露白；萌發(fā)種子表現(xiàn)為胚根長度達到與種子長軸等長[17]。

2) 紅外光譜分析

將每個浸種處理中吸脹、萌動、萌發(fā)的種子和未浸泡種子(ck)子葉取出，于鼓風(fēng)干燥箱中60 ℃下烘干后粉碎，從每粒種子子葉碎屑中分別稱取0.1 g樣品按不同發(fā)芽階段分別混勻，將混合樣品于60 ℃下烘干至恒重，在紅外燈下取少量樣品與溴化鉀(KBr)按1∶100的比例混合，于瑪瑙研缽中充分研磨混勻，用YP-2壓片機模具在25%相對濕度下壓片，壓力為15～20 MPa，持續(xù)壓片20 s，壓片至透明，厚度約為0.5 mm，采用PerkinElmer公司Frontier傅立葉變換紅外光譜儀測定光譜特征(掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)128次)，所有光譜扣除溴化鉀背景，最終得到樣品的原始光譜圖。為防止樣品從環(huán)境中吸收其他物質(zhì)(主要是水和二氧化碳)，系統(tǒng)使用干氮進行凈化。在相同條件下，每個樣品做3次平行實驗，取平均值并保存數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用紅外光譜數(shù)據(jù)處理軟件(OMNIC 8.0)對所采集的原始紅外光譜圖進行基線校正和自動平滑，利用Origin 8.5軟件進行光譜數(shù)據(jù)處理，導(dǎo)出蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物相關(guān)特征峰的峰高及峰面積。表1列出供分析植物所含脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物的主要吸收帶。其中，3 000～2 800 cm-1一般為脂肪酸甲基、亞甲基的基團振動吸收；1 670～1 500 cm-1一般為蛋白質(zhì)中酰胺基團的振動；1 500～900 cm-1主要為多糖，也包含蛋白質(zhì)和核酸的振動吸收[11,18-25]。

表1 生物體在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)主要大分子特征性峰位及基團歸屬

紅外光譜曲線是通過峰位和峰值(或峰面積)來確定樣品內(nèi)含物的種類和相對含量，不同光波上出現(xiàn)的峰值(或峰面積)代表不同化合物，而相同波數(shù)上峰值大小的不同則代表著相對含量的不同[26]。因紅外吸收光譜的峰面積受樣品因素和儀器因素的影響比峰高更小，所以使用吸收峰峰面積進行定量計算比使用吸收峰峰高更準確[27]。吸收峰面積通過對吸收峰進行積分計算可得，即將吸收峰波數(shù)范圍內(nèi)譜帶上的數(shù)據(jù)點平均值乘以波數(shù)范圍。譜帶面積基本上不受譜帶形狀變化的影響，譜帶面積與樣品中基團總數(shù)成正比[11]。本研究選擇峰面積相對比值來表征西蒙得木種子貯藏物質(zhì)(脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物)的相對含量。

采用Microsoft Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)的整理和作圖，運用IBM SPSS Statistics 19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。對實驗數(shù)據(jù)進行雙因素方差分析、多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準差表示，p<0.05表示差異顯著。用Pearson相關(guān)性分析貯藏物質(zhì)之間及其與浸種時間、發(fā)芽階段的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 西蒙得木種子吸水率變化

西蒙得木種子的吸水率隨著浸種時間的延長呈拋物線型(圖2)，0～10 h的斜率最大，吸水速率最快，為急劇吸水期；10～24 h吸水速率逐漸變緩，為緩慢吸水期；24 h后吸水速率變化不明顯，種子重量基本趨于恒定，進入吸水飽和期。由此可知，西蒙得木種子吸水吸脹主要集中在24 h內(nèi)。

圖2 西蒙得木種子吸水率變化趨勢

2.2 原始紅外光譜特征分析

圖3 不同浸種時間不同發(fā)芽階段西蒙得木種子的傅立葉變換紅外光譜

脂肪特征峰2 926、2 855、1 465、1 167、1 740 cm-1吸收強，無干擾，選作脂肪分析峰，其峰面積范圍為2 991.05～2 881.13 cm-1、2 879.20～2 819.42 cm-1、1 774.19～1 714.41 cm-1、1 482.99～1 427.07 cm-1、1 205.29～1 139.72 cm-1；蛋白質(zhì)的酰胺Ⅰ 1 646 cm-1、酰胺Ⅱ 1 547 cm-1、酰胺Ⅲ 1 246 cm-1特征峰作為分析峰，其峰面積范圍為1 714.63～1 492.62 cm-1和1 292.07～1 209.15 cm-1；1 075 cm-1特征峰作為碳水化合物分析峰，其峰面積范圍1 141.65～931.449 cm-1[28]。計算樣品脂肪特征峰面積、蛋白質(zhì)特征峰面積、碳水化合物特征峰面積與特征峰面積之和的比值RF、RP、RC，分析西蒙得木種子貯藏物質(zhì)的動員情況[28]。

2.3 不同浸種時間不同發(fā)芽階段貯藏物質(zhì)紅外光譜分析

2.3.1RF的變化

雙因素方差分析(表2)顯示，浸種時間對RF有極顯著影響(p=0.010)，而吸脹和萌動的種子不同浸種時間之間差異不顯著，因此顯著影響來源于萌發(fā)階段的種子。由圖4 A可知，萌發(fā)階段的種子RF隨浸種時間總體呈逐漸增加的趨勢，浸種16 h和24 h的萌發(fā)種子RF均顯著高于對照組(未浸種)和浸種時間短(4 h)的種子，浸種24 h萌發(fā)種子的RF達到最高，吸脹的種子RF也有類似隨浸種時間逐漸增加的趨勢。不同發(fā)芽階段種子的RF之間差異不顯著(p=0.338)，除4 h和24 h外，總體為隨發(fā)芽進行RF呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(圖4 B)。浸種時間×發(fā)芽階段交互效應(yīng)對RF的影響不顯著(p=0.220)。

注：同組小寫字母相異表示差異顯著(p<0.05)，字母相同表示差異不顯著(p>0.05)。下同。

表2 不同浸種時間不同發(fā)芽階段西蒙得木種子RF的雙因素方差分析

2.3.2RP的變化

與RF類似，雙因素方差分析(表3)顯示，浸種時間對RP有顯著影響(p=0.024)，而吸脹和萌動的種子不同浸種時間之間差異不顯著，因此顯著影響來源于萌發(fā)階段的種子。由圖5 A可知，萌發(fā)階段的種子RP隨浸種時間總體呈逐漸降低的趨勢，浸種16 h和24 h的萌發(fā)種子RP顯著低于浸種4 h的，略低于ck組(未浸種)和浸種10 h的種子，但差異不明顯，當(dāng)浸種時間為24 h時，萌發(fā)種子的RP達到最低。不同發(fā)芽階段種子的RP之間差異不顯著(p=0.112)。浸種時間×發(fā)芽階段交互效應(yīng)對RP的影響也不顯著(p=0.091)。

圖5 不同浸種時間不同發(fā)芽階段西蒙得木種子的RP(平均值±標(biāo)準差，n=3)

表3 不同浸種時間不同發(fā)芽階段西蒙得木種子RP的雙因素方差分析

2.3.3RC的變化

雙因素方差分析(表4)顯示，浸種時間對RC有顯著影響(p=0.029)，而萌動和萌發(fā)的種子不同浸種時間之間差異不顯著，顯著影響來源于吸脹階段的種子。由圖6 A可知，萌發(fā)階段的種子RC隨浸種時間總體呈逐漸降低的趨勢，浸種16 h和24 h的萌發(fā)種子RC低于對照組(未浸種)、浸種4 h和10 h的種子，但差異不明顯，當(dāng)浸種時間為24 h時，萌發(fā)種子的RC達到最低。不同發(fā)芽階段種子的RC之間差異不顯著(p=0.668)，浸種時間×發(fā)芽階段的交互效應(yīng)對RC的影響也不顯著(p=0.580)。

圖6 不同浸種時間下不同發(fā)芽階段西蒙得木種子的RC(平均值±標(biāo)準差，n=3)

表4 不同浸種時間不同發(fā)芽階段西蒙得木種子RC的雙因素方差分析

2.4 貯藏物質(zhì)之間及其與浸種時間、發(fā)芽階段的關(guān)系

由表5可知，吸脹階段的種子RP、RC與RF、浸種時間均呈顯著負相關(guān)，RP與RC呈極顯著正相關(guān)，RF與浸種時間呈極顯著正相關(guān)；萌動階段種子的RP、RC與RF均呈顯著負相關(guān)，RP與RC呈極顯著正相關(guān)，此時RP、RC與RF三者之間相關(guān)性達到最大，而與浸種時間的相關(guān)性均達到最低；萌發(fā)階段種子的RP、RC與RF、浸種時間均呈顯著負相關(guān)，RF與浸種時間呈極顯著正相關(guān)。由表2～表4可知，發(fā)芽階段對西蒙得木種子RF、RP、RC影響并不顯著，而浸種時間對其影響顯著。將RF、RP、RC與浸種時間進行相關(guān)性分析，可知種子RF與RP和RC呈極顯著負相關(guān)，與浸種時間呈顯著正相關(guān)；RP與RC呈極顯著正相關(guān)；RC與浸種時間呈顯著負相關(guān)。

表5 不同發(fā)芽階段西蒙得木種子的RF、RP、RC與浸種時間的相關(guān)分析

3 討 論

種子萌發(fā)是植物生命周期的起始環(huán)節(jié)，種子自身特性與環(huán)境因子是影響種子萌發(fā)的主要因素。由吸水曲線可知西蒙得木種皮透水性良好，對種子吸水沒有限制，外種皮不是阻礙其萌發(fā)的原因，與趙葉等[29]的研究結(jié)果一致。西蒙得木種子具有短時間內(nèi)迅速吸水的特點，該特點與其長期適應(yīng)沙漠環(huán)境而進化的生存策略有關(guān)，這與張衛(wèi)華等[30]研究中沙芥種子吸水進程一致。西蒙得木種子吸脹前，內(nèi)部大分子的淀粉粒和蛋白質(zhì)等處于凝膠狀態(tài)。吸脹時，種子膨脹、軟化，水分子會迅速以擴散作用或毛細管作用等形式進入凝膠內(nèi)部，具有極性的水分子與親水凝膠結(jié)合起來，并使種子膨脹[31]。吸脹結(jié)束后，種子細胞原生質(zhì)從凝膠狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿苣z狀態(tài)，各種酶開始活化，呼吸和代謝作用急劇增強[32]。與此同時，細胞迅速分裂和生長，吸水量迅速增加，胚開始生長[16]，西蒙得木種子內(nèi)貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)開始大量消耗。西蒙得木胚根突破種皮而外露，接著長出胚芽。

種子內(nèi)貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)主要包括蛋白質(zhì)、糖類和脂肪三大類，蛋白質(zhì)可分解成小分子氨基酸，為種子萌發(fā)提供氮源，脂肪和糖類物質(zhì)為種子解除休眠與萌發(fā)階段的呼吸作用提供基礎(chǔ)物質(zhì)[33]。本研究中，西蒙得木種子貯藏物質(zhì)在不同發(fā)芽階段之間沒有顯著的差異，而主要影響來源于浸種時間，正如雙因素方差分析(表2～表4)所示。多重比較進一步表明，萌發(fā)階段的種子受浸種時間的影響顯著。然而，Pearson相關(guān)性表明西蒙得木種子的RP和RC之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系，且均與RF表現(xiàn)出強烈且顯著的負相關(guān)關(guān)系，本結(jié)果與張瑞等[34]的“芝麻種子萌發(fā)過程中總糖含量與粗脂肪含量呈極顯著負相關(guān)”結(jié)論相似，說明本研究中貯藏物質(zhì)之間是普遍存在的關(guān)系。RP和RC二者之間的正相關(guān)關(guān)系，蛋白質(zhì)和碳水化合物在西蒙得木種子發(fā)芽過程中存在協(xié)同作用(圖5 B和圖6 B)。西蒙得木種子在萌發(fā)前期，水解蛋白酶活性逐漸增強，貯藏蛋白被水解為氨基酸等小分子，用于合成新蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)化合成糖類和脂肪[10]，蛋白質(zhì)相對含量降低；種子內(nèi)的淀粉酶等水解酶會將自身貯藏淀粉等糖原分解為葡萄糖[17]，呼吸增強，為種子生命活動供能，糖類的相對含量降低；西蒙得木種子在萌發(fā)初始階段，子葉中的脂肪尚未動員或轉(zhuǎn)化很少，胚根突破種皮后脂肪開始水解轉(zhuǎn)化為碳水化合物(主要是糖)，這同韓克杰等[35]在研究歐洲榛子時發(fā)現(xiàn)的種子胚乳中脂肪動員情況相似；隨著浸種時間的增加，吸脹程度越高，蛋白質(zhì)和碳水化合物的損失就越快，因此與浸種時間呈負相關(guān)關(guān)系，而隨著蛋白質(zhì)和碳水化合物的減少，脂肪相對累積，與浸種時間呈正相關(guān)關(guān)系。

4 結(jié) 論

1) 西蒙得木種子吸水吸脹主要集中在前24 h內(nèi)，其中在0～10 h吸水速率最快，10～24 h吸水速率逐漸變緩，24 h以后達到飽和狀態(tài)。

2) 西蒙得木種子貯藏物質(zhì)在不同發(fā)芽階段之間沒有顯著差異，主要受到浸種時間的影響，其中萌發(fā)階段的種子受到浸種時間顯著影響。

3) 蛋白質(zhì)和碳水化合物在西蒙得木種子發(fā)芽過程中存在協(xié)同作用，隨浸種時間延長而減少，脂肪隨浸種時間延長而相對增加。