洪 偉,孫浩浩,王 洲

(1.蕪湖職業(yè)技術學院生物工程學院，安徽蕪湖 241003；2.安徽工程大學生物與食品工程學院，安徽蕪湖 241000)

0 引言

谷胱甘肽(Glutathione ,GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸縮合而成的一種含γ-谷氨?；蛶€基的生物活性三肽類化合物[1-3]，在蛋白質(zhì)和DNA的合成、氨基酸的轉(zhuǎn)運、細胞的保護過程中起著重要作用.同時，谷胱甘肽具有抗衰老、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性[4-6].它主要分布于動物、植物、微生物細胞中，被廣泛應用于臨床醫(yī)學、運動保健、食品加工等很多領域.因此GSH已成為各國科學家研究和探索的熱點[7].

目前國內(nèi)外生產(chǎn)谷胱甘肽的方法主要有萃取法、化學合成法、發(fā)酵法、酶法[8].由于發(fā)酵法生產(chǎn)GSH具有菌種易于培養(yǎng)、原料來源方便廉價、反應步驟簡單、成本低、轉(zhuǎn)化效率高、生產(chǎn)速率快等優(yōu)點，已成為當前生產(chǎn)谷胱甘肽的主要方法[9].但目前微生物發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽的產(chǎn)量較低，因此通過誘變提高微生物合成谷胱甘肽能力具有重要意義.現(xiàn)行常用的菌種選育方法是隨機篩選法，即采用搖瓶逐個進行發(fā)酵培養(yǎng)并測定菌株的目標產(chǎn)量，該方法存在工作量大、周期長和成本高等缺點[10].高通量篩選技術目前在微生物制藥領域有很多成功的應用[11-12]，同時微孔板具有孔板工作容積小，高度平行化，可同時發(fā)酵大量突變株的優(yōu)勢.因此，將高通量篩選技術應用于GSH高產(chǎn)菌株的篩選中，可縮短篩選周期，提高工作效率.在GSH高產(chǎn)菌株的高通量篩選中，通過優(yōu)化發(fā)酵條件以達到接近搖瓶的產(chǎn)量可以減少篩選中的誤差，提高篩選效率，為GSH高產(chǎn)菌株的選育奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試菌株畢赤酵母GYW-1由蕪湖職業(yè)技術學院微生物實驗室保藏.

1.2 實驗試劑

培養(yǎng)基用酵母粉和胰蛋白胨，購自英國OXOID公司；還原型谷胱甘肽，購自國藥集團化學試劑有限公司；DTNB標準品購自生工生物工程股份有限公司；其他常用試劑如無機鹽和有機試劑等，購自國藥集團化學試劑有限公司.

1.3 儀器與設備

FC型酶標儀：Thermo Fisher Sciencetific；紫外分光光度計，TU-1810：北京普析通用儀器有限責任公司；電子天平，TLE104E：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；722可見分光光度計，YK1109102：上海佑科儀器儀表有限公司；pH儀，EI20：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司.

1.4 實驗方法

1.4.1 培養(yǎng)基的配制 A)固體培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，魚粉蛋白胨20，瓊脂18～22，用NaOH調(diào)pH至5.2～5.7.滅菌：115 ℃ 30 min.B)種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，魚粉蛋白胨15，泡敵1，自然pH值.裝量：50 mL/500 mL，滅菌：115 ℃ 30 min.C)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉12.5，(NH4)2SO45，KH2PO49，MgSO4·7H2O 1.0, 用NaOH調(diào)pH至5.0～5.5.裝量：50 mL/500 mL，滅菌：115 ℃ 30 min.

1.4.2 GSH的DTNB法測定 采用蒸餾水和產(chǎn)物GSH混合配制不同濃度的標樣，然后在408 nm下通過酶標儀測值繪制標準曲線，同時用紫外分光光度計在408 nm下進行測定并繪制標準曲線.

1.4.3 菌株生長曲線的繪制 在無菌環(huán)境下用接種環(huán)挑取固體平板上長勢良好的單菌落轉(zhuǎn)接至裝有新鮮種子培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶置于振蕩恒溫培養(yǎng)箱中，200 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng).以2 h為一個測定周期，取200 μL種子液用酶標儀在OD600條件下測定生物量，并繪制菌株生長曲線.

1.4.4 GSH的多孔板發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 A)24孔板與48孔板的比較:將各裝有2 mL新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基的24孔板和48孔板按10%的接種量接入活化后的新鮮種子液，同時放在溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上發(fā)酵30 h.B)最適碳源、有機氮源、無機氮源的篩選:在培養(yǎng)基其它成分和配比不變的情況下，一個因素變化其他因素不變，即分別采用葡萄糖、蔗糖、乳糖、作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源；采用酵母粉、牛肉膏、蛋白胨作為培養(yǎng)基中的有機氮源；采用硫酸銨、氯化銨、檸檬酸銨作為培養(yǎng)基中的無機氮源.C)前體物質(zhì)合成GSH的影響:在葡萄糖作為碳源、酵母粉作為有機氮源、檸檬酸銨作為無機氮源時，將L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸三種前體物質(zhì)以不同的組合方式添加到發(fā)酵培養(yǎng)基.其他條件不變，研究不同前體物質(zhì)對GSH產(chǎn)量的影響.D)最適葡萄糖、酵母粉、檸檬酸銨、甘氨酸濃度的選擇:采取一個因素變化其他因素不變的原則，分別配制不同濃度的葡萄糖、酵母粉、檸檬酸銨、甘氨酸測定GSH含量，篩選出最適濃度.

1.4.5 GSH的多孔板發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化 A)裝液量對24孔板發(fā)酵的影響:確定發(fā)酵培養(yǎng)基組分及配比之后，選擇24孔板裝液量分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，接種量10%，30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)30 h，研究不同裝液量對GSH產(chǎn)量的影響.B)接種量對24孔板發(fā)酵的影響:確定最佳裝液量2.0 mL，選擇24孔板接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%，30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)30 h，研究不同接種量對GSH產(chǎn)量的影響.C)pH值對24孔板發(fā)酵的影響:配制pH值分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5五組新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基，其他條件不變，研究不同pH對GSH產(chǎn)量的影響.

1.4.6 正交實驗設計 綜合以上各因素對GSH產(chǎn)量的影響，選擇A:酵母粉、B:檸檬酸銨、C:接種量三個影響較大的因素設計L9(33)正交實驗.其中，酵母粉濃度的三個水平A1、A2、A3分別為36 g/L、44 g/L、52 g/L，檸檬酸銨濃度的三個水平B1、B2、B3分別是11、13、15 g/L，接種量的三個水平C1、C2、C3分別為12%、14%、16%.

2 結(jié)果與討論

2.1 GSH含量的測定

分別使用分光光度計和酶標儀測定GSH含量都有很好的一致性，且采用酶標儀法不僅能節(jié)約試劑成本，而且還能夠高通量檢測，效率更高.所以選擇酶標儀方法測定GSH含量.

2.2 菌株的生長曲線

菌株在200 r/min、30 ℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)10 h左右開始進入對數(shù)生長期，在15 h左右開始進入穩(wěn)定期，而在25 h左右開始進入衰亡期.根據(jù)不同生長期菌株的特點，即選擇對數(shù)生長期的種子液用于接下來的孔板發(fā)酵.在接下來的種子液制備時培養(yǎng)10～15 h即可.

2.3 培養(yǎng)基條件優(yōu)化

2.3.1 24孔板與48孔板的比較 由圖1可以看出24孔板的發(fā)酵值明顯高于48孔板，鑒于該株菌為好氧菌，24孔板與48孔板相比氧容量較高，因此以下實驗均采用24孔板培養(yǎng)畢赤酵母GYW-1.

2.3.2 不同碳源及其濃度對酵母產(chǎn)GSH產(chǎn)量的影響 碳源是提供微生物生命活動中所需能源的原料，是用于構(gòu)成微生物細胞和代謝產(chǎn)物中碳素的營養(yǎng)物質(zhì)，故碳源是需要量最大的營養(yǎng)物[13].

由圖2可知，當以葡萄糖、蔗糖以及乳糖作為碳源時，GSH產(chǎn)量較高且相差不大，產(chǎn)量分別為35.111、33.444、29.185 mg/L.鑒于葡萄糖與蔗糖、乳糖相比經(jīng)濟實惠，并且葡萄糖可以直接經(jīng)微生物發(fā)酵進入GSH的合成途徑.綜合考慮選用葡萄糖作為唯一碳源.以五組不同葡萄糖濃度進行GSH的發(fā)酵合成，其發(fā)酵液產(chǎn)量分別為29.494、30.111、32.457、29.494、29.988 mg/L，即當葡萄糖濃度為60 g/L時GSH產(chǎn)量最高.因此，確定發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖最佳濃度為60 g/L.

圖2 不同碳源及其濃度對酵母產(chǎn)GSH產(chǎn)量的影響

2.3.3 不同氮源及其濃度對酵母產(chǎn)GSH產(chǎn)量的影響 與碳源相似，氮源也是微生物的主要營養(yǎng)物，微生物可利用的氮源范圍也十分廣泛，可分為有機氮源和無機氮源兩類[14].不同的微生物對氮源的要求差異較大.結(jié)果如圖3和圖4所示：

圖3 不同有機氮源及其濃度對酵母產(chǎn)GSH產(chǎn)量的影響

圖4 不同無機氮源及其濃度對酵母產(chǎn)GSH產(chǎn)量的影響

由圖3可知，不同的有機氮源對GSH產(chǎn)量的影響差別較小.當有機氮源為酵母粉時GSH產(chǎn)量較高，為34.432 mg/L.再以五組不同酵母粉濃度的發(fā)酵液進行GSH合成，GSH產(chǎn)量分別為30.296、30.667、33.444、37.519、36.963 mg/L，即當酵母粉濃度為40 g/L時GSH產(chǎn)量最高.因此，確定發(fā)酵培養(yǎng)基酵母粉最佳濃度為40 g/L.

由圖4可知，當無機氮源為檸檬酸銨時產(chǎn)量較高，為38.877 mg/L.綜合考慮采用檸檬酸銨作為無機氮源進行接下來的實驗.以五組不同檸檬酸銨濃度進行GSH發(fā)酵，其產(chǎn)量分別為27.889、32.148、34.370、30.667、30.481 mg/L，即當酵母粉濃度為12 g/L時GSH產(chǎn)量最高.因此，確定發(fā)酵培養(yǎng)基檸檬酸銨最佳濃度為12 g/L.

2.3.4 不同前體物質(zhì)及其濃度對GSH合成的影響 谷胱甘肽的合成依賴其前體物質(zhì)在培養(yǎng)基中的含量[15]，因此將L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸三種前體物質(zhì)以不同的組合方式添加到發(fā)酵培養(yǎng)基，考察其對GSH合成的影響.

由圖5可知，當單獨添加三種前體物質(zhì)時，GSH產(chǎn)量相較于未添加前體物質(zhì)時都有所提高，并且甘氨酸的影響最大.而把三種前體物質(zhì)進行不同組合再添加時，GSH產(chǎn)量相較于未添加前體物質(zhì)時都有明顯的降低.因此，選擇添加甘氨酸一種前體物質(zhì)進行GSH發(fā)酵合成.再以五組不同甘氨酸濃度進行發(fā)酵生產(chǎn)，GSH產(chǎn)量分別為53.815、59.185、50.481、46.407、43.815 mg/L，即當甘氨酸濃度為1.5 g/L時GSH產(chǎn)量最高.因此，確定發(fā)酵培養(yǎng)基甘氨酸最佳濃度為1.5 g/L.

圖5 不同前體物質(zhì)及其濃度對酵母產(chǎn)GSH的影響

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件對GSH合成的影響

2.4.1 裝液量對24孔板發(fā)酵產(chǎn)GSH的影響 五組不同裝液量的發(fā)酵液產(chǎn)量分別為18.074、38.444、39.741、26.222、21.778 mg/L，即當裝液量為2.0 mL時GSH產(chǎn)量最高.因此，確定24孔板發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為2.0 mL.

2.4.2 接種量對24孔板發(fā)酵產(chǎn)GSH的影響 由圖6可知，五組不同接種量的GSH產(chǎn)量分別為21.963、26.593、25.852、39.185、40.481 mg/L，即當接種量為10%時GSH產(chǎn)量最高.因此，確定24孔板發(fā)酵培養(yǎng)基接種量為10%.

圖6 不同接種量對GSH產(chǎn)量的影響

2.4.3 pH值對24孔板發(fā)酵產(chǎn)GSH的影響 5組不同pH的GSH產(chǎn)量分別為32.148、25.481、36.963、45.296、45.296、41.778 mg/L，即當發(fā)酵培養(yǎng)基pH為5.5和6.0時GSH產(chǎn)量最高.因此，確定24孔板發(fā)酵培養(yǎng)基pH為5.5～6.0.

2.5 正交實驗設計

在明確了影響酵母產(chǎn)谷胱甘肽含量的單因素的基礎上，分別選取對GSH產(chǎn)量影響較大的因素，即酵母粉濃度、檸檬酸銨濃度以及接種量三個因素進行三因素三水平正交實驗，以考察分析其中對谷胱甘肽合成影響的關鍵因素，并對谷胱甘肽合成的最適培養(yǎng)基組成進行分析.

由表1可知，九組不同的水平組合中，以水平組合為A2B3C1時，GSH產(chǎn)量最高.從而確定發(fā)酵培養(yǎng)基最適組成為：葡萄糖60 g/L，酵母粉44 g/L，檸檬酸銨15 g/L，KH2PO49 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L、甘氨酸1.5 g/L，pH5.5～6.0.最適培養(yǎng)條件為：裝液量2.0 mL、接種量12%、30 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵30 h.

表1 正交試驗結(jié)果與分析

3 結(jié)論

本文對所建立的24孔板發(fā)酵方法進行培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化，以期獲得最優(yōu)的發(fā)酵條件.其中，在進行培養(yǎng)基優(yōu)化時，通過單因素實驗及正交實驗，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖60 g/L，酵母粉44 g/L，檸檬酸銨15 g/L，KH2PO49 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L、甘氨酸1.5 g/L，pH5.5～6.0.在進行發(fā)酵條件優(yōu)化時，確定了裝液量2.0 mL、接種量12%，30 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵30 h.在此優(yōu)化條件下的GSH產(chǎn)量達到43.815 mg/L.優(yōu)化后得到的GSH的含量相對于優(yōu)化前在原始培養(yǎng)基的GSH含量増加了55%.