陳書秀，李 霞，趙 楠，孫 娟，史 良，李曉捷

( 山東東方海洋科技股份有限公司，國(guó)家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264003 )

籠目海帶(Kjellmaniellacrassifolia)，又稱厚葉切氏海帶、厚葉解曼藻，屬褐藻門、褐藻綱、海帶目、海帶科，主要分布于日本北海道函館和室蘭的深水區(qū)[1]?；\目海帶含有較豐富的巖藻多糖硫酸酯，且其他雜糖含量相對(duì)較少，因此是制備提取巖藻多糖的良好優(yōu)質(zhì)原料。巖藻多糖硫酸酯具有調(diào)節(jié)血脂、降血糖、降血壓、抗腫瘤等功效[2]。

籠目海帶是一種大型褐藻，一般在冬季和初春生長(zhǎng)和繁殖，研究溫度、光照對(duì)其生長(zhǎng)、發(fā)育的影響，對(duì)苗種繁育及養(yǎng)殖均有重要意義。已有很多溫度、光照、營(yíng)養(yǎng)鹽與海帶(Laminariajaponica)生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)報(bào)道[3-9]，但針對(duì)籠目海帶的研究還較少。目前，海帶種苗生產(chǎn)主要采用孢子體采苗，兼有配子體克隆育苗[10]，與孢子體采苗相比，配子體克隆育苗可使品種純度高且育苗時(shí)間不受季節(jié)限制。雖然配子體克隆育苗技術(shù)在海帶試驗(yàn)中應(yīng)用較廣，但在規(guī)?；a(chǎn)上應(yīng)用較少[11]，這主要是因?yàn)楹Т?、雄配子體的發(fā)育不同步以及孢子放散量的限制，從而限制其在實(shí)際規(guī)?；缰械膽?yīng)用。

筆者以籠目海帶雌、雄配子體為材料，通過(guò)顯微觀察配子體生長(zhǎng)、發(fā)育狀況，計(jì)算配子體萌發(fā)率等，探究不同溫度對(duì)其配子體生長(zhǎng)、發(fā)育的影響，為籠目海帶克隆育苗技術(shù)提供參數(shù)，為籠目海帶規(guī)?；绱蛳禄A(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及培養(yǎng)條件

籠目海帶配子體保存條件為溫度10 ℃，鹽度31，光照度1000 lx，光周期24L∶0D。在直徑12 cm的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，取適量的雌、雄配子體，分別用300目篩絹過(guò)濾，獲得2～5個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞段懸濁液，按照2∶1的比例，將雌、雄配子體混合，取10 mL懸濁液加入到直徑12 cm的培養(yǎng)皿中，置于不同溫度下培養(yǎng)，光周期10L∶14D，光照度1000 lx。海水經(jīng)過(guò)濾、消毒、冷卻后，添加硝酸鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸鐵作為培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中總氮4 mg/L、總磷0.4 mg/L、鐵0.05 mg/L。溫度設(shè)置5、8、12、15、20、25 ℃ 6個(gè)處理組，每組3個(gè)平行。

1.2 配子體生長(zhǎng)、發(fā)育指標(biāo)的測(cè)定

在顯微鏡下觀察配子體的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)，每3 d顯微拍照1次，培養(yǎng)周期為30 d。

配子體發(fā)育率的計(jì)算：每個(gè)培養(yǎng)皿隨機(jī)觀察10個(gè)100倍視野，分別統(tǒng)計(jì)卵囊形成、排卵、幼孢子體和總細(xì)胞數(shù)，萌發(fā)率為卵囊形成數(shù)、排卵數(shù)和孢子體數(shù)之和占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0軟件對(duì)發(fā)育率進(jìn)行單因子方差分析、多重比較，P<0.05表示差異顯著。用Excel軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對(duì)籠目海帶配子體細(xì)胞形態(tài)的影響

在20 ℃條件下時(shí)，籠目海帶配子體僅營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，不發(fā)育，無(wú)卵囊形成，外觀形態(tài)變化見圖1a～c。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，配子體細(xì)胞段分支，顏色深，細(xì)胞質(zhì)分布均勻，細(xì)胞段數(shù)目增多，配子體的細(xì)胞數(shù)量顯著高于其他各組(圖2)；25 ℃條件下，配子體大量死亡，極少數(shù)的存活細(xì)胞生長(zhǎng)極度緩慢且不發(fā)育(圖2)。

圖1 籠目海帶雌配子體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程Fig.1 Growth and development of female gametophytes in seaweed K. crassifoliaa.打碎后的雌配子體； b.雌配子體營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)初期； c.雌配子體營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)后期； d.雌配子體卵囊形成； e.雌配子體排卵； f.幼孢子早期形態(tài).a.fragment of female gametophyte; b.early stage of vegetative growth of female gametophyte; c.late vegetative growth stage of female gametophyte; d.oogonium development of female gametophyte; e.ovulation of female gametophyte; f.early morphology of juvenile sporophyte.

在5～15 ℃條件下，15 d后，約有5%～15%的雌配子體發(fā)育為成熟的卵囊(圖1d)；15～28 d，大部分雌配子體生成成熟卵囊、排卵并受精形成幼苗(圖1e、f)。其中5 ℃和15 ℃條件下最終的卵囊形成率、排卵率及小苗形成率顯著低于8 ℃和12 ℃處理組(圖2a～m)，28 d時(shí)，8 ℃和12 ℃條件下配子體發(fā)育率為85%～90%，其中約50%為多細(xì)胞幼苗(圖2f、i)。

2.2 不同溫度對(duì)籠目海帶配子體萌發(fā)率的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明(表1)，第15天，8、15 ℃條件下有卵囊形成，12 ℃條件下出現(xiàn)卵囊形成并排卵，5 ℃條件下出現(xiàn)卵囊及排卵的時(shí)間稍晚于以上3組。高溫(20、25 ℃)最終均未出現(xiàn)配子體發(fā)育。在整個(gè)培養(yǎng)周期中，溫度對(duì)籠目海帶配子體萌發(fā)率有顯著影響(P<0.05)。多重比較結(jié)果表明，從第19天開始，溫度為8、12 ℃時(shí)萌發(fā)率顯著高于其他各組。第28天，5、15 ℃時(shí)最終萌發(fā)率為23.85%、34.41%，8、12 ℃時(shí)最終萌發(fā)率高達(dá)88.47%、88.59%(圖3)。

表1 籠目海帶雌配子體在不同溫度下萌發(fā)情況觀察 %

圖3 不同溫度下籠目海帶配子體萌發(fā)率Fig.3 The germination rate of gametophytes in seaweed K. crassifolia exposed to different temperatures小寫字母下標(biāo)相同數(shù)字的為同一組多重比較，同一組的不同字母表示差異顯著(P<0.05).The letters on the histogram with the same number are compared as the same group; the different letters in the same group represent significant differences (P<0.05).

籠目海帶配子體發(fā)育的最適溫度為8～12 ℃，低溫5 ℃和高溫15 ℃均對(duì)其配子體的發(fā)育有抑制作用，高于20 ℃時(shí)配子體不能正常發(fā)育。

3 討 論

3.1 溫度對(duì)籠目海帶配子體生長(zhǎng)的影響

方宗熙等[12]發(fā)現(xiàn)，人工培養(yǎng)條件下海帶雌、雄配子體均可形成無(wú)性繁殖系(又稱克隆系)并可單獨(dú)培養(yǎng)，此后其逐步并廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)生物學(xué)研究以及海帶雜交育種[13-14]。曾呈奎等[15]最早發(fā)現(xiàn)，海帶配子體適宜生長(zhǎng)和適宜發(fā)育的溫度條件分別是15 ℃和10 ℃；李曉捷等[16]對(duì)901海帶配子體的研究也得出相似結(jié)論，并且發(fā)現(xiàn)25 ℃是其致死溫度。本試驗(yàn)結(jié)果表明，籠目海帶配子體在20 ℃時(shí)生長(zhǎng)速度顯著高于其他組，這與孫娟等[17]對(duì)多肋藻(Costariacostata)配子體的研究及王軍等[18]對(duì)利尻海帶(L.ochotensis)配子體的研究結(jié)論相似。

3.2 溫度對(duì)籠目海帶配子體發(fā)育的影響

本試驗(yàn)中觀察到，籠目海帶配子體在5～15 ℃均可發(fā)育，8～12 ℃下，大部分配子體(80%～90%)進(jìn)入生殖生長(zhǎng)狀態(tài)，且50%以上為多細(xì)胞幼苗。在5、15 ℃條件下，大部分配子體(70%～80%)處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)，雖有部分配子體(20%～30%)進(jìn)入生殖生長(zhǎng)狀態(tài)，但明顯滯后于8～12 ℃溫度組。20 ℃和25 ℃下所有配子體維持在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)。王軍等[18]也發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)利尻海帶的配子體成熟度有影響，在10 ℃條件下，雌、雄配子體的成熟度最高；在20 ℃條件下，配子體不發(fā)育。Martins等[19]證實(shí)，掌狀海帶(L.digitata)配子體生長(zhǎng)的最適溫度為10～18 ℃，而發(fā)育的最適溫度為5～15 ℃。Schreiber[20]發(fā)現(xiàn)，糖海帶(L.saccharina)配子體生長(zhǎng)的最適溫度為13～18 ℃，而發(fā)育的最適溫度為6 ℃。

4 結(jié) 論

筆者僅利用單因子試驗(yàn)研究溫度對(duì)籠目海帶配子體生長(zhǎng)發(fā)育的影響，結(jié)果表明，海帶配子體發(fā)育的最適溫度為8～12 ℃，建議大規(guī)模育苗前期采用8～12 ℃，以達(dá)到短期內(nèi)獲得大量孢子體的目的。但是各種環(huán)境因子對(duì)海帶配子體的生長(zhǎng)發(fā)育的影響一般存在著交互作用，因此籠目海帶配子體發(fā)育所需的最佳環(huán)境因子如光照度、光照周期及鹽度等是下一步研究的重點(diǎn)，以便為籠目海帶的大規(guī)模養(yǎng)殖提供理論支持。