黃淑霞，殷海波

1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是指由多種因素引起關(guān)節(jié)軟骨纖維化、斷裂、潰瘍、脫失而導(dǎo)致的關(guān)節(jié)疾病，具有致殘性。全球約有2.5億人受該病影響，治療方法主要包括減輕體質(zhì)量、口服和局部使用非甾體抗炎藥、關(guān)節(jié)內(nèi)治療等，但是難以收到有效且持久的療效[1-3]。

近年來的臨床研究顯示，中醫(yī)治療OA療效佳，相關(guān)數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果表明，雞血藤為治療OA的常用藥[4-6]，但是相關(guān)作用機制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等學(xué)科的集合與發(fā)展，為新藥研發(fā)提供了重要思路[7]。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，意在系統(tǒng)分析雞血藤的有效成分、潛在作用靶點以及治療OA的作用機制，以期為今后進一步實驗研究與藥物研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 活性成分篩選及相關(guān)靶點收集中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)是一個可以篩選中藥藥理學(xué)性質(zhì)較優(yōu)成分的數(shù)據(jù)庫[8]。本研究通過 TCMSP 數(shù)據(jù)庫(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)對雞血藤的成分進行檢索，并設(shè)置口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18作為ADME篩選條件，初步篩選出活性成分。之后在該平臺上收集篩選所得活性成分的相關(guān)靶點信息，并于UniProt數(shù)據(jù)庫[9](https：//www.uniprot.org)進行靶點蛋白與基因名稱的統(tǒng)一匹配。

1.2 疾病相關(guān)靶點篩選以“Osteoarthritis”為關(guān)鍵詞，在Drugbank數(shù)據(jù)庫[10](https：//www.drugbank.ca)、TTD數(shù)據(jù)庫[11](http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、Genecard數(shù)據(jù)庫[12](https：//www.genecards.org)、OMIM數(shù)據(jù)庫[13](http：//www.omim.org)進行檢索，收集相關(guān)靶點。之后將以上4個數(shù)據(jù)庫所得靶點信息進一步整合，刪去重復(fù)值得到OA的潛在靶點。

1.3 雞血藤“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過雞血藤“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，進一步探索兩者之間的聯(lián)系。將藥物相關(guān)活性成分、靶點信息上傳至Cytoscape 3.7.0[14]軟件，運用Network Analyzer工具進行網(wǎng)絡(luò)參數(shù)分析。其中Degree為重要參數(shù)，數(shù)值越大，代表該節(jié)點越重要。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用Venny2.1在線平臺(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)對藥物與疾病靶點繪制韋恩圖，并提取交集基因。將交集基因上傳至string11.0數(shù)據(jù)庫，Organism選擇“Homo sapiens”，將最低互相作用值設(shè)置為“highest confidence”(>0.9)，隱藏?zé)o相互作用蛋白，其余設(shè)置為默認值，得到PPI網(wǎng)絡(luò)TSV文件，借助Cytoscape軟件進行節(jié)點網(wǎng)絡(luò)分析，得到蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)合內(nèi)置插件“cytoHubba”[15]分析，篩選出關(guān)鍵靶點。

1.5 KEGG通路富集分析及GO功能富集分析將雞血藤作用于OA的潛在作用靶點導(dǎo)入Metascape平臺[16]，物種選擇人類，設(shè)置P<0.01，分別進行KEGG富集分析、GO富集分析，其中GO分析包括生物過程(biological processes，BP)，細胞功能(molecular function，MF)，細胞組分(cell composition，CC)。對所得富集分析結(jié)果按P值進行升序排列，篩選重要的前20位條目，相關(guān)數(shù)據(jù)信息上傳Omicshare平臺(https：//www.omicshare.com/)，繪制氣泡圖，實現(xiàn)數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果

2.1 雞血藤的活性成分及其靶點經(jīng)過OB、DL兩個ADME參數(shù)初步提取出24個成分，對24個活性成分進行手動檢索相關(guān)靶點信息，剔除未查詢到相關(guān)靶點的成分，最終獲得23個活性成分，見表1。相關(guān)作用靶點進行基因匹配，刪除無效值與重復(fù)值，共得到135個靶基因。

表1 雞血藤活性成分

2.2 骨關(guān)節(jié)炎靶點預(yù)測結(jié)果將“Osteoarthritis”作為關(guān)鍵詞在多個疾病數(shù)據(jù)庫檢索，在Genecard數(shù)據(jù)庫獲得2 885個基因，根據(jù)經(jīng)驗設(shè)定Relevance score大于中位數(shù)的靶點為潛在作用靶點，整合Drugbank數(shù)據(jù)庫(82個)、TTD數(shù)據(jù)庫(13個)、OMIM數(shù)據(jù)庫(69個)靶基因，最終獲得獨立而有效的基因835個。

2.3 “雞血藤-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將雞血藤23個活性成分，135個作用靶點導(dǎo)入Cytoscape軟件，進行“藥物-活性成分-靶點”關(guān)系圖構(gòu)建，見圖1，網(wǎng)絡(luò)中共159個節(jié)點，440條邊。黃色圓圈代表雞血藤，粉色圓圈代表雞血藤活性成分，藍色六邊形為活性成分潛在作用靶點，圖形面積越大，代表節(jié)點的Degree值越大，提示相應(yīng)的生物功能越重要。

圖1 藥物-活性成分-靶點圖

2.4 雞血藤治療OA的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建得到的藥物和疾病的獨立作用靶點上傳至Venny2.1，得到交集基因53個，繪制韋恩圖，見圖2。將53個交集映射基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫進行PPI分析，得到TSV文件通過Cytoscape軟件進行可視化處理，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。圖中共有48個節(jié)點，225條關(guān)系路線，平均節(jié)點度值為8.49，平均局部聚類系數(shù)為0.53，節(jié)點圖形大小及顏色隨著Degree值增大而變大、加深，連接線段也相應(yīng)增粗。通過cytohubba插件，使用MCC算法篩選出前10個關(guān)鍵基因，見圖4，顏色越深表明重要程度越高。

圖2 雞血藤-骨關(guān)節(jié)炎靶點韋恩圖

圖3 靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點

2.5 GO功能與通路富集分析運用Metascape數(shù)據(jù)平臺對雞血藤治療OA相關(guān)靶點進行富集分析后，借助Omicshare平臺進行數(shù)據(jù)可視化，見圖5-圖8。圖中氣泡大小取決于通路上的基因數(shù)，顏色代表P值，數(shù)值越小，富集程度越高[17]。GO的BP主要包括：細胞因子介導(dǎo)的信號通路(cytokine-me-diated signaling pathway)、對脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、T細胞活化(Tcell activation)、T細胞增殖(Tcell proliferation)、對無機物的反應(yīng)(response to inorganic substance)、平滑肌細胞增殖的正調(diào)控(regulation of smooth muscle cell proliferation)等；GO的CC主要涉及：膜筏(membrane raft)、膜微結(jié)構(gòu)域(membrane microdomain)、髓鞘(myelin sheath)、核膜(nuclear membrane)等；GO的MF主要涉及：細胞因子受體結(jié)合(cytokine recepto rbinding)、蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(transcriptionfactor binding)、細胞因子活性(cytokine activity)、生長因子的結(jié)合(growth factor receptor binding)、類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)等；KEGG通路分析顯示靶點主要富集在：癌癥通路(Pathways in cancer)、乙型病毒性肝炎通路(HepatitisB)、AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、內(nèi)分泌抵抗(Endocrine resistance)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、NF-κB信號通路(NF-kappaB signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)等。綜上，雞血藤治療OA是通過調(diào)節(jié)復(fù)雜的生物過程及信號通路而實現(xiàn)的。

圖5 GO-BP分析

圖6 GO-CC分析

圖7 GO-MF分析

圖8 KEGG信號通路分析

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)痹證范疇?！端貑枴け哉摗吩疲骸帮L(fēng)、寒、濕三氣雜至，合而為痹……以冬遇此者為骨痹……痹在于骨則重?！爆F(xiàn)多稱之“骨痹”。中醫(yī)認為肝腎、氣血虧虛為發(fā)病內(nèi)在因素，風(fēng)寒濕熱、外邪、外傷、勞損為外在因素，痰瘀阻滯是主要病機[2]?！额愖C治裁·痹證》曰：“痹久必有瘀血。”有醫(yī)家認為瘀血貫穿整個OA病程始終[18]。OA相關(guān)證型研究則顯示瘀血痹阻是主要證型之一，因此活血化瘀為治療OA的重要方法[19-20]?！讹嬈聟ⅰ酚涊d了雞血藤“去瘀血，生新血，流利經(jīng)脈，治風(fēng)血痹證。”《綱目拾遺》曰其“活血，暖腰膝?！北砻骰钛娼畹碾u血藤是治療OA的合適藥味。

根據(jù)“藥物-活性成分-靶點”關(guān)系圖，雞血藤的主要作用成分有β-谷甾醇、木樨草素、豆甾醇、芒柄花素、甘草查爾酮a等。β-谷甾醇具有重要的抗炎作用，能夠減輕關(guān)節(jié)疼痛。其抗炎機制復(fù)雜，可以使STAT1和NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)失活、降低促炎因子水平、提高抗炎因子IL-10的濃度而起到抗炎作用，也可能與調(diào)節(jié)L型電壓依賴性鈣通道、PI3K活性等相關(guān)[21-23]。木樨草素作為一種天然黃酮類物質(zhì)，具有治療OA的潛力，表現(xiàn)在抗炎多途徑：包括影響花生四烯酸的代謝和多種炎性信號通路(NF-κB 信號通路、MAPK和AP-1信號通路、JAK和STAT信號通路)，顯著抑制巨噬細胞炎癥因子化及血管生成因子的表達等[24-25]。豆甾醇可以顯著抑制MAPK及NF-κB信號通路的激活，減少促炎介質(zhì)(TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS和COX-2)的表達，從而達到良好的抗炎效果[26]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)拓撲分析中的Degree值以及MCC算法，篩選出較為重要的靶點：STAT3、AKT1、TNF、VEGFA、MAPK1、IL-6、PTGS2、CASP3、MYC、JUN、IL-1B、IL-10、RELA等。實驗證明STAT3阻斷劑對OA小鼠的軟骨破壞具有保護作用。IL-6 是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的主要細胞因子，能夠誘導(dǎo)軟骨細胞中的STAT3和ERK1/2通路，上調(diào)參與OA發(fā)病機制的主要蛋白酶(MMP-3和MMP-13，ADAMTS-4和ADAMTS-5)的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致軟骨退化。臨床研究結(jié)果顯示，KOA患者血清IL-6水平較健康對照組明顯升高，可作為臨床早期診斷和評估疾病的指標[27-28]。TNF-α 作為常見炎癥介質(zhì)，可由巨噬細胞、纖維母細胞、軟骨細胞等產(chǎn)生[29]，能夠抑制成骨細胞的DNA和膠原合成以及骨鈣素基因的表達。實驗表明TNF-α是破骨細胞的重要分化因子[30]，在促炎級聯(lián)反應(yīng)中，TNF-α激活最重要的NF-κB/p65轉(zhuǎn)錄途徑，進而分泌IL-6和IL-8，導(dǎo)致OA加重[31]。隨著OA病情的發(fā)展，患者血清TNF-α水平也明顯增高[32]。而VEGFA在軟骨發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要作用，其高水平表達與OA發(fā)病密切相關(guān)，能夠刺激軟骨血管化，促進氧化損傷和炎癥因子的交換，常常預(yù)示著OA前期[33]。相較于正常滑膜組織，OA組織PTGS2呈現(xiàn)高表達，導(dǎo)致IL-6、TNF-α 表達也增強。抑制PTGS2的產(chǎn)生，能夠有效阻止滑膜成纖維細胞增殖和關(guān)節(jié)破壞[34]。

GO富集分析及KEGG通路結(jié)果顯示，雞血藤能通過調(diào)控炎癥因子的表達及影響其信號通路等達到治療OA的作用。PI3K/Akt信號通路，目前已經(jīng)被證實與OA相關(guān)。IL-1β、IL-6是參與PI3K/AKT信號通路的重要炎癥因子，降低軟骨組織中的這些炎癥因子水平或上調(diào)該信號通路的p-PI3K、p-AKT 的表達量以抑制線粒體細胞凋亡，能保護關(guān)節(jié)軟骨[35-37]。NF-κB在機體內(nèi)參與炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、細胞自噬等多種反應(yīng)過程，與OA相關(guān)的炎癥通路尤為重要。OA軟骨細胞產(chǎn)生大量促炎因子，激活NF-κB信號通路，導(dǎo)致膠原和蛋白多糖的再生較少，進一步增加軟骨損傷[38-39]。IL-17能夠促進多種炎癥因子的表達，其介導(dǎo)的信號通路通過參與關(guān)節(jié)軟骨的表達和活化，激活NF-κB，啟動炎癥反應(yīng)而引起軟骨病變[40]。研究顯示IL-17在小鼠關(guān)節(jié)局部表達能夠引起急性炎癥和軟骨蛋白糖化[41]。臨床研究結(jié)果顯示OA患者無論是血清還是關(guān)節(jié)滑液中的IL-17水平，均高于健康對照組，說明其含量可能與患者關(guān)節(jié)疼痛程度、病情進展等相關(guān)[28，42]。

綜上所述，本文借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步分析發(fā)現(xiàn)，雞血藤的主要活性成分為β-谷甾醇、木樨草素、豆甾醇等，涉及治療OA的STAT3、AKT1、TNF、VEGFA、IL-6、PTGS2、CASP3等可能為關(guān)鍵靶點，PI3K/Akt、NF-κB、IL-17等信號通路為治療OA的關(guān)鍵途徑。表明雞血藤治療OA通過多活性成分、多靶點、多通路實現(xiàn)，一定程度上驗證了雞血藤作為臨床治療OA常用藥的可行性，也為今后相關(guān)實驗研究、藥物開發(fā)提供了理論依據(jù)。由于關(guān)于雞血藤的臨床及實驗研究及各數(shù)據(jù)庫的局限性，中藥在臨床治療中辨證論治等諸多因素影響，今后仍需要不斷深入研究。