姚 平，楊翼菲，夏 星，林國彪

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

肝臟是機體重要的代謝器官，肝臟疾病是危害機體健康的嚴(yán)重疾病之一，病毒、藥物、酒精等多種因素均會造成肝細(xì)胞病變，引起肝纖維化，甚至發(fā)展成為肝硬化、肝衰竭等惡性疾病[1]。近年來，中藥抗肝損傷的實驗研究是臨床研究的熱點，為治療提供了許多新思路。假木豆廣泛分布于我國廣西、廣東、海南等省份，味辛、甘，性寒，具有舒經(jīng)活絡(luò)、清熱涼血、健脾利濕的功效，在骨折、風(fēng)濕骨痛、咽喉腫痛、內(nèi)傷吐血等疾病的治療中應(yīng)用較為廣泛。假木豆各部分提取物具有抗菌活性[2]，保肝及抗肝纖維化作用機制尚無相關(guān)報道。本次研究采用四氯化碳（CCl4）致大鼠肝損傷模型[3]，通過觀察肝臟形態(tài)學(xué)改變和相關(guān)生化指標(biāo)的變化，探討假木豆對肝損傷的保護(hù)作用和機制，為假木豆藥用資源的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6～8周齡SPF級SD健康大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量（190±10）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)提供，許可證號：SCXK（桂）2020-0003。分籠飼養(yǎng)，恒溫恒濕適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，期間自由進(jìn)食、飲水。經(jīng)醫(yī)學(xué)實驗動物管理委員會批準(zhǔn)，飼養(yǎng)嚴(yán)格遵循動物實驗要求執(zhí)行。

1.2 藥物與試劑 復(fù)方聯(lián)苯雙酯片（廣州白云山天心制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H44024819，批號：201828）；假木豆由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥房提供，采自廣西地區(qū)，經(jīng)鑒別為正品；CCl4（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號：20091250）；TBIL檢測試劑盒（批號：2400087）、ALT檢測試劑盒（批號：2400737）、AST檢測試劑盒（批號：2400136）（北京科美生物技術(shù)有限公司）；TNF-α ELISA試劑盒（批號：2401885）、IL-1 ELISA試劑盒（批號：2401961）、IL-6 ELISA試劑盒（批號：2403182）、IL-10 ELISA試劑盒（批號：2403980）（武漢純度生物）；MDA檢測試劑盒（批號：S0131S）、SOD檢測試劑盒（批號：S0086）、GSH檢測試劑盒（批號：S0053）、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號：c0105S）（碧云天公司）；RT-PCR試劑盒（Solarbio公司，批號：C11730017）；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 主要儀器Selectra-E型動物全自動生化分析儀（荷蘭VITALAB）；DMD108光學(xué)顯微鏡（德國徠卡）；Lightwave S2000紫外分光光度計（英國WPA）；CLARIOstar Plus酶標(biāo)儀（德國BMG）；DK-2000-IIIL型水浴鍋（廣東佛衡）；KD-TS3A型全自動生物組織脫水機、KD-BMIV型組織冷凍包埋機（金華科迪）；885300-0002勻漿器（美國Kimble）；CUT4062病理切片機（德國SLEE）；H2100R型臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀）；CFX96型實時熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD）。

1.4 造模與分組 取30只大鼠隨機分為模型組、聯(lián)苯雙酯組和假木豆組，每組10只，采用CCl4制備肝損傷大鼠模型[4]：適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，使用0.1% CCl4花生油溶液腹腔注射，劑量為10 mL/kg，2次/周，連續(xù)注射6周。以大鼠肝細(xì)胞病理檢查顯示肝細(xì)胞排列紊亂，廣泛的脂肪變性及肝細(xì)胞水腫、脂肪空泡、纖維組織增生，炎癥細(xì)胞浸潤為造模成功。另選取10只大鼠作為空白對照組。

1.5 實驗給藥 按大鼠的等效劑量相當(dāng)于人的6.3倍換算用藥劑量。假木豆組大鼠灌胃給予假木豆水提物，100 mg/kg；聯(lián)苯雙酯組大鼠灌胃給予復(fù)方聯(lián)苯雙酯片水溶液，100 mg/kg；空白對照組和模型組大鼠灌胃給予生理鹽水；灌胃體積均為10 mL/kg；1次/d，6次/周，連續(xù)6周。末次灌胃后禁食24 h，禁水12 h，稱量大鼠體質(zhì)量，經(jīng)腹主動脈取血，分離血清；使用頸椎脫臼法處死大鼠，摘除肝臟并稱質(zhì)量，取部分肝組織制備10%肝勻漿，取部分肝組織采用4%多聚甲醛固定。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 肝臟病理形態(tài)學(xué)分析 取部分多聚甲醛固定肝組織，乙醇梯度脫水，透明、石蠟包埋、切片后行蘇木精-伊紅（HE）染色，具體步驟為二甲苯浸泡15 min，100%～50%乙醇梯度沖洗3 min，蒸餾水沖洗1 min，蘇木精浸泡15 min后，再次使用蒸餾水沖洗15 min。完成伊紅染色后再次使用酒精和二甲苯浸泡，最后中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

1.6.2 肝功能檢測 使用全自動生化分析儀測定TBIL、ALT、AST水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作步驟執(zhí)行，血清標(biāo)本在4℃條件下以5 000 r/min離心10 min，分離上層血清，將試劑及血清標(biāo)本混勻后37℃孵育5 min，1 min后采用分光光度計讀取340 nm處吸光度，連續(xù)測量3次取平均值。

1.6.3 炎癥因子、纖維化因子檢測 腹主動脈血液樣本采用ELSIA法檢測血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10水平，血清標(biāo)本分離后取上清液，-20℃凍存；血清標(biāo)本加入50 μL樣本分析緩沖液后加入相應(yīng)的孔中后室溫孵育2 h，洗板5次加入抗體工作液100 μL，室溫孵育1 h；加入酶結(jié)合物工作液100 μL，避光孵育20 min；加入顯色劑后避光孵育20 min，加入50 μL終止液，混勻后測量450 nm處OD值，設(shè)置空白孔，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到各指標(biāo)在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的濃度。

1.6.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 取0.1 g肝臟組織加入1 mL提取液，勻漿后離心分離取上清液，吸取0.3 mL試劑加入離心管，并加入0.1 mL樣本混勻，95℃水浴30 min，隨后冰浴冷卻，25℃離心10 min，吸取上清液置于96孔板，分別測定600 nm、532 nm處吸光度，計算各指標(biāo)在肝臟中的含量。

1.6.5 大鼠肝纖維化因子基因表達(dá)檢測 稱取少量凍存肝臟組織，經(jīng)Trizol一步法提取總RNA，檢測RNA濃度和純度；取3μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，行PCR擴增，擴增條件：預(yù)變性95℃10 min，95℃、15 s變性，55～60℃、45℃退火，循環(huán)（40次），熔解曲線60℃→95℃，每15 s升溫0.3℃。引物序列：GADPH上游5’CTGGAGAAGGAGTAGTAGTAG-3’，下游5’GGTGCCAG ACCTGTAGTGCT-3’；HA上游5’CTGACTAGGGVTGACAT-3’，下 游5’AGTCTGATGCTGCCGCAT-3’；TGF-β1上 游5’ATT CCTGTGAGTCGTATTGG-3’，下游5’AGCCTGTATTCCTCTCCCT-3’；α-SMA上游5’AGGAGGTAGTCCCGTACATG-3’，下游5’GGTGATCCCTGATGATGCT-3’。采用2-△△Ct法 計算HA mRNA、TGF-β1 mRNA、α-SMA mRNA基因相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（s）表示，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肝組織病理學(xué)改變情況 空白對照組大鼠肝細(xì)胞正常，無變性壞死，排列整齊，匯管區(qū)結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞核與細(xì)胞漿對比鮮明；模型組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂，可見廣泛的脂肪變性及肝細(xì)胞水腫，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見大小不等的脂肪空泡，肝組織內(nèi)纖維組織增生等，胞質(zhì)界限模糊，伴有炎癥細(xì)胞浸潤；聯(lián)苯雙酯組和假木豆組大鼠肝細(xì)胞排列基本正常，出現(xiàn)部分肝細(xì)胞水腫及脂肪變性，未見明顯肝纖維化；與模型組比較，肝細(xì)胞病變明顯減輕。（見圖1）

圖1 各組大鼠肝組織病理切片圖（HE，×400）

2.2 各組大鼠肝功能指標(biāo)比較 與空白對照組比較，模型組大鼠血清TBIL、ALT、AST水平，肝臟指數(shù)均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組和假木豆組大鼠血清TBIL、ALT、AST水平，肝臟指數(shù)均明顯降低（P＜0.05），但仍高于空白對照組（P＜0.05）；假木豆組大鼠血清TBIL、ALT、AST水平，肝臟指數(shù)與聯(lián)苯雙酯組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠肝功能指標(biāo)比較

表1 各組大鼠肝功能指標(biāo)比較

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）TBIL（μmol/L）AST（U/L） ALT（U/L） 肝臟指數(shù)（%）空白對照組 10 - 14.28±2.89 112.38±10.95 29.68±8.54 3.25±0.27模型組 10 - 30.67±4.16a 215.44±35.82a 75.18±18.65a 4.38±0.51a聯(lián)苯雙酯組 10 100 20.37±3.98ab 127.96±12.58ab 41.34±11.97ab 3.67±0.35ab假木豆組 10 100 22.56±4.05ab 130.37±13.86ab 44.56±12.59ab 3.72±0.38ab F 31.717 49.588 20.856 14.538 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 各組大鼠血清氧化損傷指標(biāo)比較 與空白對照組比較，模型組大鼠血清MDA水平明顯升高，SOD、GSH水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組和假木豆組大鼠血清MDA水平明顯降低，SOD、GSH水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；假木豆組大鼠血清MDA、SOD、GSH水平與聯(lián)苯雙酯組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠血清氧化損傷指標(biāo)比較

表2 各組大鼠血清氧化損傷指標(biāo)比較

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）MDA（mmol/L）SOD（U/mL）GSH（μmol/L）空白對照組 10 - 6.07±1.14 125.72±7.81 413.60±38.46模型組 10 - 14.18±2.51a 70.28±11.59a 302.53±41.38a聯(lián)苯雙酯組 10 100 8.95±2.13b 116.54±10.28b 370.29±45.50b假木豆組 10 100 9.57±2.28b 110.59±9.34b 375.36±39.15b F 26.018 62.051 12.557 P 0.000 0.000 0.000

2.4 各組大鼠血清炎癥因子表達(dá)比較 與空白對照組比較，模型組大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平明顯升高，IL-10水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組和假木豆組大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平明顯降低，IL-10水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。假木豆組大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α、IL-10水平與聯(lián)苯雙酯組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠血清炎癥因子表達(dá)比較

表3 各組大鼠血清炎癥因子表達(dá)比較

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）IL-1（ng/L）IL-6(ng/L）TNF-α（μg/L）IL-10(ng/L)空白對照組10 - 40.28±3.75 25.86±4.59 11.68±2.15 124.30±15.82模型組 10 - 67.18±4.05a 127.98±15.77a 34.72±6.86a 84.37±13.75a聯(lián)苯雙酯組10 100 45.54±5.16b 45.83±6.91b 17.75±3.81b 108.96±12.29b假木豆組 10 100 42.81±4.88b 50.69±7.16b 18.34±4.02b 110.73±15.16b F 75.287 218.650 47.300 13.478 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.5 各組大鼠肝纖維化因子基因表達(dá)比較 與空白對照組比較，模型組大鼠HA mRNA、α-SMA mRNA、TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組和假木豆組大鼠HA mRNA、α-SMA mRNA、TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）；假木豆組大鼠HA mRNA、α-SMA mRNA、TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量與聯(lián)苯雙酯組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠肝纖維化因子基因表達(dá)比較

表4 各組大鼠肝纖維化因子基因表達(dá)比較

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）HA mRNA α-SMA mRNA TGF-β1 mRNA空白對照組 10 - 0.34±0.05 0.82±0.15 1.02±0.08模型組 10 - 1.28±0.24a 1.71±0.31a 1.65±0.19a聯(lián)苯雙酯組 10 100 0.41±0.10b 0.97±0.20b 1.13±0.12b假木豆組 10 100 0.44±0.12b 1.02±0.23b 1.24±0.15b F 93.172 29.642 38.119 P 0.000 0.000 0.000

3 討 論

本次研究采用CCl4制備肝損傷大鼠模型。作為一種肝毒性化學(xué)物，CCl4是化學(xué)性肝損傷的常用造模試劑，長期反復(fù)接觸會產(chǎn)生頭暈、乏力、食欲不振、惡心等癥狀[5]，嚴(yán)重者會出現(xiàn)肝功能異常甚至肝硬化。對大鼠長期使用CCl4能使肝細(xì)胞變性、壞死，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。在中醫(yī)理論中，肝為剛臟，體陰而用陽。肝臟受到化學(xué)物、酒精等毒素的侵襲會損耗肝陰，導(dǎo)致肝臟陰陽失衡，從而引起肝臟病理改變[6]。

本次研究顯示，造模后大鼠肝臟形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，CCl4毒性使得大鼠肝組織局灶性壞死，對肝細(xì)胞造成損傷，并提高IL-1、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子的釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)[7]。血清中ALT、AST是評價肝臟損傷程度的常用指標(biāo)，其水平越高表示肝損傷的程度越嚴(yán)重[8]，當(dāng)細(xì)胞膜受到傷害后細(xì)胞內(nèi)的ALT、AST會通過細(xì)胞膜進(jìn)入血液中，導(dǎo)致血液中ALT、AST水平升高。相關(guān)研究顯示，血清中ALT、AST活力的大小直接反映了肝損傷的程度[9]。肝臟對膽紅素的代謝具有重要作用，肝臟發(fā)生病變后膽紅素在血液中積聚，表現(xiàn)為TBIL水平明顯升高。本次研究顯示，假木豆組大鼠血清TBIL、ALT、AST水平明顯低于模型組（P＜0.05），與聯(lián)苯雙酯組水平相當(dāng)，證實假木豆能夠有效降低血清TBIL、ALT、AST水平，保護(hù)肝功能。

肝損傷發(fā)生發(fā)展過程中，氧化應(yīng)激反應(yīng)扮演了重要角色。氧化應(yīng)激是指抗氧化防御和細(xì)胞內(nèi)活性氧之間的平衡被打破，從而對肝臟造成損傷[10]。MAD是反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度和細(xì)胞氧化損傷的指標(biāo)，可間接反映細(xì)胞損傷的程度；SOD活力水平是機體內(nèi)清除氧自由基能力的體現(xiàn)，正常水平的SOD能夠預(yù)防和修復(fù)氧化應(yīng)激引起的肝損傷。GSH是LOOH、等低分子自由基的清除劑，是GSH-PX的底物，可用于氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化損傷程度的評估。上述三者常被用于評價機體氧化應(yīng)激和抗氧化應(yīng)激平衡[11]。本次研究中，模型組大鼠血清MDA水平明顯升高，SOD、GSH水平明顯降低（P＜0.05），說明肝損傷大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)增強。經(jīng)過假木豆干預(yù)后，大鼠血清MDA水平明顯降低，SOD、GSH水平明顯升高（P＜0.05），證實假木豆對肝損傷具有抗氧化保護(hù)作用，能夠降低肝組織中MDA水平，提高SOD、GSH水平，減輕肝組織氧化應(yīng)激損傷。

IL-6和TNF-α是代表性的促炎性細(xì)胞因子。IL-6是反映機體炎癥反應(yīng)程度的敏感指標(biāo)，在機體內(nèi)過度分泌會直接損傷肝細(xì)胞，使中性粒細(xì)胞向肝內(nèi)浸潤，造成肝臟微循環(huán)障礙，同時可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞合成CRP，進(jìn)一步加大炎癥反應(yīng)，加重肝損傷[12]。TNF-α具有釋放炎癥介質(zhì)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集的作用，與IL-6的分泌相互促進(jìn)，共同誘發(fā)炎癥反應(yīng)[13]。IL-10作為一種抗炎細(xì)胞因子能夠減輕炎癥的反應(yīng)程度，適當(dāng)分泌可中和促炎性細(xì)胞因子[14]。本次研究顯示，模型組大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平明顯升高，IL-10水平明顯降低（P＜0.05），證實肝損傷大鼠體內(nèi)存在強烈的炎癥反應(yīng)。經(jīng)過假木豆干預(yù)后，大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平明顯降低，IL-10水平明顯升高（P＜0.05），與聯(lián)苯雙酯組相當(dāng)，證實假木豆具有抑制炎癥反應(yīng)，降低肝損傷的效果。

肝纖維化是肝內(nèi)結(jié)締組織增生與降解失衡而產(chǎn)生的沉積[15]，是多數(shù)肝病共有的特征?？垢卫w維化治療是肝損傷治療的重要部分。α-SMA是平滑肌肌動蛋白中比例最高的亞型，具有收縮細(xì)胞和促進(jìn)細(xì)胞形成的作用[16]。正常情況下，肝臟中僅在大血管壁中表達(dá)，若發(fā)現(xiàn)在其他肝組織中表達(dá)則提示發(fā)生肝纖維化，因此可用來評價肝纖維化嚴(yán)重程度[17]。HA是肝纖維化四項檢查的指標(biāo)之一，對早期肝纖維化具有一定的預(yù)警作用，長期高水平會發(fā)展成為肝硬化[18]。TGF-β1是肝臟病理損傷過程中的重要因子，也是導(dǎo)致肝纖維化的重要因素，能夠激活肝星狀細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)大量合成[19]。本次研究顯示，模型組大鼠HA mRNA、α-SMA mRNA、TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），證實肝損傷模型大鼠存在肝纖維化。經(jīng)過假木豆干預(yù)后，HA mRNA、α-SMA mRNA、TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量水平明顯降低（P＜0.05），證實假木豆可降低HA、α-SMA、TGF-β1基因表達(dá)，從而對CCl4引起的肝纖維化具有一定的治療作用。

綜上所述，假木豆能夠有效改善CCl4致大鼠肝損傷，對肝功能具有良好的保護(hù)作用，其作用機制可能與抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)、阻斷肝纖維化有關(guān)。