許 楠，趙雁煥，楊春山

（唐山市協(xié)和醫(yī)院，河北 唐山 063000）

牙周炎是牙齒周圍組織慢性破壞性進行性疾病，可引起牙齦發(fā)炎、牙周袋及牙槽骨吸收陷窩形成，導致牙齒動搖甚至脫落。我國牙周病患病率高達92%，是成年人牙齒損傷及缺失的主要原因[1]。致病微生物是牙周病的主要因素，研究表明牙菌斑中革蘭氏陰性厭氧菌與牙周炎發(fā)生密切相關[2]。大多數牙周病組織損傷由宿主本身對感染應答引起，如牙周致病菌及其毒性產物可通過白介素、前列腺素、一氧化氮和基質金屬蛋白酶等導致骨吸收與組織炎癥。中醫(yī)學認為牙周炎與腎虛、氣血不足及胃火上炎有關，故補氣養(yǎng)腎、清熱敗火是治療該病的關鍵[3]。自擬清熱涼血方由生地黃、赤芍、梔子、連翹、淡竹葉、玄參、牡丹皮、水牛角、川黃柏、白茅根、茜草和紫草組成，有清胃瀉火、消腫止痛、滋陰補腎、益精固齒、調補氣血、養(yǎng)齦健齒的作用[4]。Toll樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）屬于天然免疫受體家族，其表達受到腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-1β（IL-1β）等炎癥因子調節(jié)，TLR4在中樞神經系統(tǒng)炎癥免疫反應中起著重要調控作用[5]。研究表明，許多中藥是通過TLRs信號通路來發(fā)揮免疫調節(jié)作用，如金茵清熱口服液可以活化髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MYD88）依賴型TLR信號通路，而且TLR2抑制劑可以阻斷金茵清熱口服液介導的干擾素調節(jié)因子3（Interferon regulatory Factor 3，IRF3）和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的核轉位[6]。TLR4通路抗牙周炎及對牙周組織生長的影響作用機制研究較少，本研究通過建立牙周炎大鼠模型，探討自擬清熱涼血方對牙周炎大鼠的影響及可能作用機制，旨在為臨床治療牙周炎提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8周齡健康SPF級Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠85只，體質量（250±35）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物生產許可證號：SCXK（滬）2018-0003。所有大鼠實驗前于室溫23～25℃，濕度50%～65%，人工12 h晝/夜循環(huán)照明，分籠飼養(yǎng)，自由攝食及飲水。本研究經唐山市協(xié)和醫(yī)院動物實驗倫理委員會審查并批準。

1.2 藥物與試劑 自擬清熱涼血方，方藥組成：生地黃20 g，赤芍12 g，梔子10 g，連翹12 g，淡竹葉8 g，玄參15 g，牡丹皮12 g，水牛角30 g（先煎），川黃柏15 g，白茅根15 g，茜草30 g，紫草30 g，上述藥材由唐山市協(xié)和醫(yī)院中藥房提供，經唐山市協(xié)和醫(yī)院中藥房主任鑒定為正品，上述藥材加水1 L，文火煎煮，濃縮至300 mL。

TLR4通路抑制劑IAXO-102（美國MedChemExpress公司，批號：HY-125171，純度＞98.0%）；兔抗大鼠MYD88單克隆抗體（英國Abcam公司，批號：ab133739）；NF-κB p65多克隆抗體（美國Abbkine公司，批號：ABP51951）；p-NF-κB p65多克隆抗體（美國Abbkine公司，批號：ABP0043）；TLR4多克隆抗體（英國Abcam公司，批號：ab13556）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（上海碧云天生物技術有限公司，批號：A0208）；熒光定量PCR試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，批號：11201ES08）；反轉錄試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，批號：11141ES10）；TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒（上海通蔚生物科技有限公司，批號：tw045949）；IL-1β酶聯(lián)免疫試劑盒（上海通蔚生物科技有限公司，批號：tw039569）。

1.3 主要儀器HBS-1101全自動酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）；CX-41型生物顯微鏡（日本Olympus公司）；CFX熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD公司）。

1.4 造模及分組85只大鼠隨機取70只，按照徐梅等[7]的方法建立牙周炎大鼠模型，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射輕度麻醉，仰臥固定，用絲線結扎上頜右側第一磨牙2～3圈，在牙齦上縫一針固定絲線。從實驗當天起，喂10%蔗糖水及軟飼料（大鼠正常飼料上噴含大鼠糞便的水，使其變軟）。造模4周后，肉眼檢查大鼠牙齦組織有充血、出血、腫脹、溢膿、潰瘍、糜爛等現象出現，并且牙齦指數≥2，即為建模成功。國際通用牙齦指數評價標準[8]：牙齦健康，為0分；牙齦輕度炎癥即牙齦的顏色有輕度改變并輕度水腫，探診不出血，為1分；牙齦中等炎癥即牙齦色紅，水腫光亮，探診出血，為2分；牙齦嚴重炎癥即牙齦明顯紅腫或有潰瘍，并有自動出血傾向，為3分。將建模成功的64只大鼠隨機分為模型對照組、抑制劑組、自擬清熱涼血方低劑量組（簡稱低劑量組）、自擬清熱涼血方高劑量組（簡稱高劑量組），每組16只，其余15只大鼠為正常對照組。

1.5 實驗給藥 建模成功后開始干預，灌胃劑量按照《中藥藥理學》[9]中人和動物體表面積折算的等效劑量比率表計算。低、高劑量組大鼠分別灌胃自擬清熱涼血方，0.75、1.50 mg/kg；抑制劑組、正常對照組和模型對照組每只大鼠均灌胃等量生理鹽水，2次/d。同時抑制劑組腹腔注射TLR4通路抑制劑IAXO-102（IAXO-102溶于無水乙醇，用生理鹽水稀釋為無水乙醇體積分數為5%），3 mg/kg。其余各組腹腔注射等量含5%無水乙醇的生理鹽水，1次/d。各組大鼠連續(xù)用藥3個月。

1.6 觀察指標

1.6.1 一般情況觀察 觀察各組大鼠造模前、干預結束后24 h一般情況，包括毛發(fā)、飲食、活動、體質量等。

1.6.2 牙齦指數 根據“1.4”中國際通用牙齦指數評價標準，評估各組大鼠干預后牙齦指數變化。

1.6.3 動物取材及處理 完成一般情況及牙齦指數檢測后，大鼠以3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，摘眼球法采集靜脈血2 mL，隨后分離上頜右側磨牙區(qū)，冰上剝離牙周組織，分為3份，2份置于液氮保存，1份置于10%福爾馬林固定。

1.6.4 ELISA法檢測血清中TNF-α和IL-1β水平 取靜脈血，3 500 r/min，離心5 min，離心半徑為8 cm，取上層血清，-20℃保存?zhèn)溆?，測定TNF-α和IL-1β的含量。按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書加樣，用全自動酶標儀測定450 nm處的吸光（A值），通過繪制標準曲線得出TNF-α和IL-1β的含量。

1.6.5 HE染色觀察牙周組織病理學變化 取10%福爾馬林固定牙周組織，10%鹽酸脫鈣，流水沖洗24 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋、切片，厚4～5 μm，HE染色，用光學顯微鏡觀察牙齦、牙周膜及牙槽骨等牙周組織病變。

1.6.6 RT-qPCR檢測TLR4 mRNA、MYD88 mRNA及NF-κB p65 mRNA相對表達水平 取1份液氮保存牙周組織，冰上研磨，用TRIzol法提取總RNA，TaKaRa逆轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA。進行RT-qPCR，檢測TLR4 mRNA、MYD88 mRNA、NF-κB p65 mRNA相對表達量。PCR反應條件為A：預變性95℃3 min；B：變性95℃15 s；退火56℃20 s，延伸72℃20 s，共45個循環(huán)；C：72℃5 min，4℃終止反應。以GAPDH為內參基因，取均值，采用2-△△Ct法對數據進行相對定量分析。引物由上海生工生物技術有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6.7 Western blotting檢 測TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白相對表達水平 取1份液氮保存牙周組織，加入蛋白提取裂解液，冰上裂解，離心取上清用BCA蛋白定量試劑盒進行定量，95℃水浴使蛋白變性，進行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，洗膜后分別加入1∶1 000稀釋的MYD88、N-FκB p65、p-NF-κB p65單克隆抗體，TLR4多克隆抗體，4℃孵育過夜，洗膜后加入1∶4 000辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL發(fā)光液顯影，采用Image J軟件分析圖像，以β-actin為內參，各蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值表示TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以“均數±標準差”（s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況 造模前，所有大鼠毛發(fā)光亮、飲食正常、活動靈敏。干預后，正常對照組大鼠毛發(fā)光亮，飲食及活動正常；模型對照組大鼠皮毛粗糙無光澤，少動，食欲不振，體質量減輕；與模型對照組比較，低劑量組、高劑量組和抑制劑組大鼠皮毛逐漸恢復光澤，食欲變好，活動增加，體質量明顯增加。

2.2 各組大鼠牙齦指數比較 正常對照組大鼠牙齦指數為0；模型對照組大鼠牙齦指數明顯高于正常對照組（P＜0.01）；低劑量組、高劑量組和抑制劑組大鼠牙齦指數均低于模型對照組（P＜0.01）；高劑量組和抑制劑組大鼠牙齦指數明顯低于低劑量組（P＜0.01）；抑制劑組大鼠牙齦指數明顯低于高劑量組（P＜0.01）。（見表2）

表2 各組大鼠牙齦指數比較s，分）

表2 各組大鼠牙齦指數比較s，分）

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型對照組比較，bP＜0.01；與低劑量組比較，cP＜0.01；與高劑量組比較，dP＜0.01

組別 動物數（只） 給藥劑量（mg/kg） 牙齦指數正常對照組 15 - 0模型對照組 16 - 2.21±0.32a低劑量組 16 0.75 1.11±0.12b高劑量組 16 1.50 0.70±0.08b c抑制劑組 16 3.00 0.34±0.04b c d F 46.422 P 0.000

2.3 各組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平比較 與正常對照組比較，模型對照組、低劑量組、高劑量組和抑制劑組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，低劑量組、高劑量組和抑制劑組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平降低（P＜0.01）；與低劑量組比較，高劑量組和抑制劑組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平降低（P＜0.05）；與高劑量組比較，抑制劑組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平降低（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平比較，ng/L）

表3 各組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平比較，ng/L）

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型對照組比較，bP＜0.01；與低劑量組比較，cP＜0.05；與高劑量組比較，dP＜0.05

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg）TNF-α IL-1β正常對照組 15 - 125.32±10.32 108.62±11.85模型對照組 16 - 259.62±15.78a 268.68±21.32a低劑量組 16 0.75 164.21±13.25ab 172.16±18.24ab高劑量組 16 1.50 150.02±12.15abc 146.32±15.22abc抑制劑組 16 3.00 135.54±11.05abcd 128.14±12.36abcd F 325.041 152.154 P 0.000 0.000

2.4 HE染色觀察牙周組織病理學變化 正常對照組大鼠牙周組織正常；模型對照組大鼠牙齦組織糜爛、潰瘍，炎癥細胞形成，牙周袋出現并加深，牙槽骨骨吸收陷窩形成；低劑量組、高劑量組和抑制劑組大鼠牙齦組織破壞情況得到改善，炎癥細胞減少，牙周袋逐漸變淺，牙周間隙逐漸恢復正常，牙槽骨出現新生，且抑制劑組修復效果更好。（見圖1）

圖1 各組大鼠牙周組織病理學變化比較（HE，×400）

2.5 各組大鼠牙周組織TLR4 mRNA、MYD88 mRNA及NF-κB p65 mRNA相對表達量比較 與正常對照組比較，模型對照組、低劑量組、高劑量組和抑制劑組大鼠牙周組織TLR4 mRNA、MYD88 mRNA相對表達量明顯升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，低劑量組、高劑量組和抑制劑組大鼠牙周組織TLR4 mRNA、MYD88 mRNA相對表達量明顯降低（P＜0.01）；與低劑量組比較，高劑量組和抑制劑組大鼠牙周組織TLR4 mRNA、MYD88 mRNA相對表達量明顯降低（P＜0.01）；與高劑量組比較，抑制劑組大鼠牙周組織TLR4 mRNA、MYD88 mRNA相對表達量明顯降低（P＜0.01）。5組大鼠牙周組織NF-κB p65 mRNA相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠牙周組織TLR4 mRNA、MYD88 mRNA、NF-κB p65 mRNA相對表達量比較s）

表4 各組大鼠牙周組織TLR4 mRNA、MYD88 mRNA、NF-κB p65 mRNA相對表達量比較s）

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型對照組比較，bP＜0.01；與低劑量組比較，cP＜0.01；與高劑量組比較，dP＜0.01

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg）TLR4 mRNA MYD88 mRNA NF-κB p65 mRNA正常對照組15 - 0.32±0.02 0.29±0.03 1.12±0.05模型對照組16 - 0.98±0.05a 1.15±0.06a 1.09±0.06低劑量組 16 0.75 0.62±0.04ab 0.73±0.05ab 1.12±0.04高劑量組 16 1.50 0.51±0.03abc 0.61±0.03abc 1.11±0.05抑制劑組 16 3.00 0.43±0.03abcd 0.48±0.02abcd 1.11±0.03 F 793.509 977.533 1.072 P 0.000 0.000 0.377

2.6 各組大鼠牙周組織TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白相對表達量比較 與正常對照組比較，模型對照組、低劑量組、高劑量組和抑制劑組大鼠牙周組織TLR4、MYD88、p-NF-κB p65蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，低劑量組、高劑量組和抑制劑組大鼠牙周組織TLR4、MYD88、p-NF-κB p65蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.01）；與低劑量組比較，高劑量組和抑制劑組大鼠牙周組織TLR4、MYD88、p-NF-κB p65蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.01）；與高劑量組比較，抑制劑組大鼠牙周組織TLR4、MYD88、p-NF-κB p65蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.01）。5組大鼠牙周組織NF-κB p65蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見圖2、表5）

表5 各組大鼠牙周組織TLR4、MYD88、NF-κB p65及p-NF-κB p65蛋白相對表達量比較

表5 各組大鼠牙周組織TLR4、MYD88、NF-κB p65及p-NF-κB p65蛋白相對表達量比較

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型對照組比較，bP＜0.01；與低劑量組比較，cP＜0.01；與高劑量組比較，dP＜0.01

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg）TLR4 MYD88 NF-κB p65 p-NF-κB p65正常對照組 15 -模型對照組 16 -低劑量組 16 0.75高劑量組 16 1.50抑制劑組 16 3.00 F 229.227 343.869 0.148 482.911 P 0.000 0.000 0.963 0.000 0.29±0.02 0.83±0.09a 0.58±0.06a 0.50±0.04abc 0.38±0.03abcd 0.31±0.03 0.85±0.08a 0.56±0.04ab 0.47±0.03abc 0.37±0.02abcd 0.89±0.05 0.89±0.06 0.88±0.05 0.88±0.07 0.89±0.05 0.39±0.03 0.79±0.04a 0.57±0.03ab 0.51±0.03abc 0.37±0.02abcd

圖2 各組大鼠牙周組織TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達western blotting圖

3 討 論

牙周炎是一種慢性破壞性炎癥疾病。牙菌斑是導致牙周炎的起始因子，牙菌斑中各種致病微生物及毒素不僅直接破壞牙周組織，還通過宿主自身免疫反應與多種炎癥細胞因子損傷牙周組織。目前牙周炎治療方式主要是基礎治療與手術治療，并輔以抗生素，但抗生素存在副作用，且長期使用會導致致病微生物產生抗藥性。中醫(yī)學稱牙周炎為牙宣，牙宣之病變雖在牙周組織，但與全身臟腑氣血陰陽之盛衰有密切因果關系，尤與胃火、腎虛、氣血不足有關，清熱涼血中藥有敗火、消腫、補氣、養(yǎng)腎功能，對牙周炎有明顯療效。因此，本研究用自擬清熱涼血方對牙周炎模型大鼠進行治療，探究其對牙周炎的抑炎作用及對牙周組織生長的影響，旨在為臨床治療提供思路。

《黃帝內經》云：“腎主骨，齒為骨之余”，牙齒與骨一樣由腎滋養(yǎng)，因此出現腎陰虛則虛火上炎，牙齦萎縮、紅腫、牙根頸宣露、牙齒松動，治宜滋腎陰、清火邪為主[10]。清熱涼血方中的生地黃有清熱、生津、滋陰、養(yǎng)血的功效；赤芍和茜草有涼血止血、活血祛瘀的功效；梔子具有清熱瀉火、涼血解毒、消腫止痛的功效；連翹主要治心肺積熱；淡竹葉有清熱、瀉火、利尿的功效；玄參清熱涼血，滋陰降火；牡丹皮具有清熱涼血、活血化瘀、退虛熱等功效；水牛角有清熱、涼血、定驚、解毒的作用；川黃柏和白茅根有清熱解毒、涼血止血、瀉火燥濕等功效；紫草活血涼血，補中益氣。諸藥合用，共奏清熱解毒、涼血、滋腎補氣之功效。有研究表明生地黃、赤芍、枸杞子、金銀花、連翹和丹參組成的養(yǎng)腎平消方用于治療慢性牙周炎，治療組臨床有效率高于對照組，牙周指數明顯降低，揭示其對牙周炎具有抑制作用[11]。張建霞等[12]通過檢測牙周炎模型大鼠血清IL-4、IL-6和TNF-α水平及牙周組織病理學變化，證實補腎堅骨湯（主要成分為熟地黃、川黃柏）通過降低IL-6和TNF-α水平，升高IL-4水平，達到抑制牙周組織炎癥、減緩牙周組織破壞的作用。另有研究采用酶聯(lián)免疫吸附實驗觀察中藥補腎合劑治療牙周炎的效果，發(fā)現其可降低牙周炎大鼠外周血中TNF-α的含量，改善牙周局部情況，補腎合劑主要成分為生地黃、川黃柏、白茅根等[13]。本研究中，低劑量組、高劑量組和抑制劑組大鼠皮毛逐漸恢復光澤，食欲變好，活動與體質量增加，牙齦指數降低，血清TNF-α和IL-1β水平降低，牙周組織病理學變化得到改善，提示清熱涼血中藥能減輕牙周組織炎癥反應，發(fā)揮抗炎作用。

牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）是目前公認的與牙周炎關系最密切的口腔細菌，屬于革蘭氏陰性菌[14]。TLR4主要識別Pg細胞膜上的脂多 糖（lipopolysaccharide，LPS），LPS與TLR4結合，通過MyD88依賴性信號轉導通路介導炎癥因子的分泌[15]。MyD88的啟動使下游的I-κB迅速被磷酸化激活，與NF-κB解離，NF-κB進入細胞核，與激活蛋白1共同作用促使細胞因子TNF-α、IL-1等分泌，形成組織周圍炎癥反應[16]。慢性牙周炎組IL-1β含量明顯高于健康組，而且TLR4蛋白表達明顯增加，揭示牙周炎發(fā)生可能與TLR4跨膜蛋白有關[17]。有TLR4在介導牙周組織炎癥的信號傳遞，參與牙周組織破壞過程中發(fā)揮了重要作用[18-20]。本研究中低劑量組、高劑量組及抑制劑組大鼠牙周組織TLR4 mRNA、MYD88 mRNA相對表達量明顯降低，TLR4、MYD88和p-NF-κB p65蛋白相對表達量明顯降低，提示自擬清熱涼血方能通過抑制TLR4通路發(fā)揮抑炎作用。

綜上所述，自擬清熱涼血方對大鼠牙周炎有抑炎作用且影響牙周組織生長，可能是通過抑制TLR4信號通路發(fā)揮作用的，為臨床牙周炎的治療提供了理論依據。