田莉莉, 文少白, 馬旖旎, 季 榮

1.南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院, 江蘇 南京 210023

2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所, 江蘇 南京 210014

3.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院, 海南 ?？?571199

微塑料(小于5 mm)作為環(huán)境中一種無處不在的污染物引起國內(nèi)外廣泛關(guān)注，2015年的聯(lián)合國環(huán)境大會上，已經(jīng)將海洋微塑料污染列為與全球氣候變化、臭氧耗竭等并列的重大環(huán)境問題[1-3]. 近年來，微塑料在多種環(huán)境介質(zhì)中被檢出[4]，如表層海水[5]、近海河口海岸[6]、沉積物[7-8]和海洋生物[9-10]等. 微塑料可能通過物理毒害、化學(xué)毒性或載體作用等多種方式危害生態(tài)系統(tǒng)健康[11]. 海洋微塑料的生物效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的PVC(聚氯乙烯，polyvinyl chloride)微塑料會影響海洋浮游藻類的光合作用[12]，PS(聚苯乙烯，polystyrene)微塑料會影響多種浮游動物和太平洋牡蠣的攝食效率[13-14]. 微塑料還會影響蚤狀鉤蝦的生長[15]，造成藍(lán)貽貝細(xì)胞和組織產(chǎn)生一定的損傷[16]，影響牡蠣的能量分配和繁殖[17]，影響斑馬魚肝臟的脂質(zhì)和能量代謝[18]等. 微塑料對海洋生物產(chǎn)生毒性的原因與其進(jìn)入生物體以及在體內(nèi)如何分布有一定相關(guān)性，因此全面地了解海洋生物對微塑料的攝入和排出過程對其毒性評估具有重要意義.

一般大尺寸塑料在水環(huán)境中的存在狀態(tài)與其密度和形狀直接相關(guān)，但是當(dāng)塑料顆粒達(dá)到微米尺度時，由于自身性質(zhì)和環(huán)境因素的影響，微塑料的存在狀態(tài)會發(fā)生不同變化，如團(tuán)聚、降解、遷移、沉降等行為. 環(huán)境中微塑料發(fā)生降解的關(guān)鍵因素是太陽光中紫外線的照射[19]，微塑料表面接觸到光的面積和能量會對其光降解產(chǎn)生一定影響[20]. 微塑料在環(huán)境中自身團(tuán)聚或與環(huán)境中其他顆粒物發(fā)生異質(zhì)團(tuán)聚的行為造成微塑料發(fā)生沉降[21]，微塑料被微生物附著后表面形成生物膜，導(dǎo)致自身浮力發(fā)生改變，使漂浮在水面或者懸浮在水中的微塑料向更深水層縱向遷移[22]，微塑料被海洋生物攝食后可能在體內(nèi)停留或隨著糞便排出體外[10,13,23]，微塑料的環(huán)境行為受到其賦存狀態(tài)的影響，但目前海洋生物攝入和排出的過程對微塑料在環(huán)境中賦存狀態(tài)的影響尚不清楚.

已有研究報道了海洋魚體中微塑料的檢出[24-25]，但目前海洋魚類對微塑料的攝入和排出的定量研究仍比較缺乏. 熒光標(biāo)記法是實(shí)驗(yàn)室研究微塑料最常用的方法，熒光顯微鏡可以直接觀察微塑料在生物體內(nèi)的分布，如Pitt等[26]研究了斑馬魚對微塑料的攝食及其在斑馬魚體內(nèi)的分布；Lee等[27]研究了斑馬魚胚胎對微塑料的富集；Cong等[28]通過熒光顯微鏡下計數(shù)研究了海水青鳉(marine medaka,Oryziasmelastigma)對微塑料的富集，并對顆粒濃度進(jìn)行了分析. 當(dāng)微塑料粒徑較小時，在顯微鏡下無法實(shí)現(xiàn)計數(shù)，以顆粒濃度定量就不再適用. 熒光分光光度計可以實(shí)現(xiàn)質(zhì)量濃度的檢測，將生物組織消解處理后通過熒光信號的強(qiáng)度對生物體內(nèi)的微塑料進(jìn)行定量[29]，然而熒光標(biāo)記的檢測限較高，當(dāng)生物基質(zhì)中存在熒光信號時研究結(jié)果會受到一定的影響. 因此，當(dāng)微塑料含量較低或粒徑較小時需要檢測靈敏且易于排除背景干擾的方法. C-14同位素示蹤技術(shù)具有靈敏度高、定量準(zhǔn)確、檢測方便等優(yōu)點(diǎn)，在獲得C-14標(biāo)記微塑料的基礎(chǔ)上可以用來定量研究微塑料在生物體內(nèi)的富集與分布[30].

為了研究海洋中微塑料與海洋生物的相互影響，定量海洋生物對微塑料的攝入和排出，該研究以熒光法和C-14同位素法為基礎(chǔ)，研究海洋生物對微塑料的攝食過程. 海水青鳉是一種具有個體小、世代周期短、產(chǎn)卵率高等特點(diǎn)的海洋模式生物，被廣泛應(yīng)用于海洋魚類的毒性效應(yīng)研究中[31]. 因此以海水青鳉為受試生物，選取熒光標(biāo)記的PS微塑料和C-14標(biāo)記的PS微塑料，使用不同方式定量研究微塑料在海水青鳉不同成長階段的攝入情況，觀察并定量研究微塑料在海水青鳉不同部位的分布特征，同時研究海水青鳉攝食行為對微塑料狀態(tài)的影響，以期全面地了解海洋中微塑料與生物的相互作用，為海洋微塑料的環(huán)境風(fēng)險評價提供理論支撐.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

氯化鈉(NaCl)、十二烷基磺酸鈉(SDS)和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)均購自南京化學(xué)試劑股份有限公司；Tris-HCl(1 mol/L，南京建成生物工程研究所)；蛋白酶K(>30 U/mg，上海麥克林生化有限公司)；天然海鹽購自天津中鹽技術(shù)研究所；閃爍液購自英國Meridian生物科技有限公司；熒光PS微塑料(粒徑0.5 μm)購自美國Thermo Fisher公司；C-14標(biāo)記的PS微塑料(粒徑為0.3～0.5 μm，放射性比活度為 2 300 Bq/mg)為筆者所在課題組實(shí)驗(yàn)室合成[20].

1.2海水青鳉培養(yǎng)

海水青鳉種源來自國家海洋監(jiān)測中心，在筆者所在課題組實(shí)驗(yàn)室馴化培養(yǎng)3年以上，試驗(yàn)所用海水青鳉為繁殖三代后獲得，仔魚為1月齡，體長為(0.88±0.18) cm，成魚為3月齡，體長為(1.9±0.2) cm. 試驗(yàn)前海水青鳉喂養(yǎng)于循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)(Z-A-S4，上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，所用海水為天然海鹽和純水配制而成的人工海水，海水鹽度為30‰，pH為8.2～8.4，培養(yǎng)溫度為26～28 ℃，光照周期為光照14 h、黑暗10 h. 培養(yǎng)期間，仔魚每日早晚各喂魚食一次，成魚每日早晚各喂食孵化24 h鹵蟲幼體一次，中午均喂魚食一次. 喂食結(jié)束后，及時清理殘留魚食及糞便以免污染水質(zhì).

1.3 海水青鳉攝入微塑料的定量研究

1.3.1熒光標(biāo)記法

試驗(yàn)開始前將海水青鳉從養(yǎng)殖系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至燒杯，不喂食情況下清腸48 h. 添加熒光PS微塑料到400 mL人工海水中，為了更好地進(jìn)行攝食機(jī)制探究，該試驗(yàn)將PS微塑料濃度設(shè)置為50 mg/L，超聲分散均勻. 分別設(shè)置攝食組和分布組，每組燒杯中加入4條海水青鳉成魚，試驗(yàn)在光照培養(yǎng)箱(GZX-300BS-Ⅲ，上海新苗實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)中進(jìn)行，溫度設(shè)定為27 ℃，光照周期為光照14 h、黑暗10 h. 攝食組于培養(yǎng)24 h后取樣，成魚整體稱重后消解，測定攝入總量；分布組于培養(yǎng)24 h后取一半成魚解剖測定，另一半成魚放入干凈海水中進(jìn)行排出試驗(yàn)，在排出72 h后取樣測定，解剖分離魚鰓、腸道和魚體三部分，先通過熒光倒置顯微鏡(Eclipse Ti-S，尼康儀器上海有限公司)觀察各部分熒光信號，觀察結(jié)束后再分別消解測定不同部分熒光信號強(qiáng)度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算PS微塑料含量.

1.3.2C-14同位素法

由于仔魚帶有熒光背景，會對信號檢測造成干擾，因此試驗(yàn)又采用C-14標(biāo)記PS微塑料開展. 選取大小一致的仔魚，清腸48 h后待用. 設(shè)置低濃度組(5 mg/L)和高濃度組(50 mg/L)，均添加C-14標(biāo)記PS微塑料(分別為1.2、12 mg)于240 mL海水中，超聲分散30 min. 每個處理組中均加入仔魚12條，分別在24、48和72 h取樣測定. 試驗(yàn)是在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，溫度27 ℃，光照周期為光照14 h、黑暗10 h. 取樣時用一次性吸管隨機(jī)將仔魚吸出，轉(zhuǎn)移至干凈海水中，清洗體表可能的殘留，清洗3次后，將仔魚放入閃爍管中稱重，消解并測定其放射性量.

1.3.3生物體消解方法

試驗(yàn)采用蛋白酶消解法，參照J(rèn)iang等[32]研究方法并進(jìn)行一定改進(jìn)，試驗(yàn)證明酶解過程對生物體內(nèi)熒光微塑料的信號無影響. 配置混合消解液的步驟：計算配制1 L消解液所需各物質(zhì)的量，稱取相應(yīng)固體物質(zhì)加入到1 L容量瓶，再加入1 mol/L Tris-HCl 250 mL，并加水定容至1 L，超聲20 min使物質(zhì)充分溶解，即得混合消解液，其具體成分如表1所示.

表1 混合消解液成分表

成魚解剖后的不同組織分裝入離心管，魚鰓和腸道加入1 mL混合消解液，剩余魚體部分加入5 mL混合消解液，仔魚直接放入離心管，加入1 mL混合消解液，然后將離心管放在50 ℃恒溫水浴鍋中加熱15 min，再加入蛋白酶K(0.5～3)mg，升溫至60 ℃，繼續(xù)消解24 h. 消解結(jié)束后，取200 μL組織消解液加入到96孔板中，以不含生物組織的消解液作為空白，熒光酶標(biāo)儀(Synergy H4, 美國Biotek有限公司)測定不同樣品中的熒光信號強(qiáng)度.

1.4 微塑料的賦存形態(tài)

為了觀察微塑料被生物攝食后在環(huán)境中賦存形態(tài)的改變，選取熒光PS微塑料喂食海水青鳉成魚，并記錄攝食過程. PS微塑料試驗(yàn)濃度為50 mg/L，超聲20 min至PS微塑料在水中完全分散，加入4條成魚，培養(yǎng)過程中不喂食. 培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)期間觀察并拍照記錄，培養(yǎng)結(jié)束后，取魚的糞便通過熒光倒置顯微鏡觀察，另取少量糞便低溫烘干，固定于導(dǎo)電膠后噴金45 s，通過掃描電子顯微鏡(Quanta 250 FEG，美國FEI有限公司)觀察PS微塑料的形貌變化，工作電壓設(shè)定為10 kV，燈絲電流為171 μA.

1.5 檢測方法

C-14放射性量檢測：使用液體閃爍計數(shù)儀LSC(LS6500，美國Beckman有限公司)測定樣品中放射性含量. 液體樣品1 mL與3 mL閃爍液充分混合后測定；生物樣品需經(jīng)過消解后，將消解液與閃爍液以體積比為1∶3的比例混合均勻后測定.

熒光含量檢測：首先配制濃度為 1 000 mg/L的熒光PS微塑料儲備液，超聲分散30 min，梯度稀釋到濃度分別為2、5、10、20、100 mg/L，取200 μL加入到96孔板中，每個濃度5個平行，以純水作為空白，使用熒光酶標(biāo)儀測定不同濃度熒光微塑料的熒光信號強(qiáng)度，所得熒光強(qiáng)度扣除背景信號后，根據(jù)PS濃度和熒光信號強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線. 樣品中熒光微塑料的信號扣除背景信號后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計算得到生物體內(nèi)不同組織中微塑料的含量.

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)形式表示，不同數(shù)據(jù)之間顯著性差異分析通過SPSS 18.0軟件進(jìn)行One-way ANOVA分析，P<0.05即視為具有顯著性差異，且采用GraphPad Prism 5軟件繪圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 海水青鳉攝入微塑料的定量研究

根據(jù)熒光PS微塑料的熒光信號強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)，R2為0.999，線性較好. 測定消解液的熒光信號后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量消解液中的微塑料含量，結(jié)果如圖2所示. 由圖2可見，當(dāng)PS微塑料濃度為50 mg/L時，海水青鳉成魚在24 h 內(nèi)攝食PS微塑料含量為(246.8±38.1)mg/g(以魚濕質(zhì)量計)，顯著(P<0.05)高于同樣暴露時間的仔魚攝食量〔(4.32±0.77)mg/g，以魚濕質(zhì)量計〕. 這表明海水青鳉成魚具有更高的微塑料攝食能力.

圖1 PS微塑料濃度與熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

注： 不同字母表示數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異(P<0.05).

從海水青鳉仔魚攝食動力學(xué)結(jié)果(見圖3)可以看出，在不同濃度處理組中仔魚都攝食了一定量C-14標(biāo)記PS微塑料，均是24 h攝入量較高，其中5 mg/L處理組PS微塑料最高含量為(1.49±1.18)mg/g(以魚濕質(zhì)量計). 隨著培養(yǎng)時間的增加，PS微塑料含量先降后升，說明青鳉仔魚對PS微塑料的攝食是一個動態(tài)過程. 這與Cong等[28]研究結(jié)論一致，其通過熒光顯微鏡的觀察發(fā)現(xiàn)青鳉仔魚24 h攝食PS微塑料(10 μm)含量最高，但并未對攝入量進(jìn)行定量. 由于目前常用的微塑料定量方法是在熒光顯微鏡下觀察計數(shù)微塑料的顆粒數(shù)，但對于粒徑較小的微塑料，在樣品處理過程中可能會造成信號泄露或顯微鏡下計數(shù)困難[32]，因此小粒徑微塑料的定量數(shù)據(jù)目前報道較少. 該研究采用較為溫和的酶消解方式處理生物樣品，避免了因熒光信號泄漏對試驗(yàn)結(jié)果的影響，通過制備得到C-14標(biāo)記PS微塑料，利用C-14信號實(shí)現(xiàn)小粒徑微塑料在低濃度下的質(zhì)量濃度檢測，以該實(shí)驗(yàn)室制備所得C-14標(biāo)記PS微塑料的最大比活度(8.0×104Bq/mg)來計算，最低檢測限可達(dá)2.5 μg/L，若能夠使用更高放射性比活度的C-14標(biāo)記微塑料，可進(jìn)一步降低檢測限. 由此說明C-14同位素法是檢測低濃度小粒徑微塑料的有效方法.

注： 不同小寫字母或大寫字母表示數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異(P<0.05).

2.2 熒光標(biāo)記法示蹤微塑料在海水青鳉體內(nèi)的分布特征

Al-Sid-Cheikh等[30]采用C-14標(biāo)記的納米級PS微塑料在扇貝(Pectenmaximus)體內(nèi)的攝入、分布和排出情況，結(jié)果表明試驗(yàn)所用的PS微塑料(24和250 nm)可以被扇貝快速攝入，粒徑越小攝入越多，而排出14 d后，粒徑較小的PS微塑料(24 nm)已經(jīng)檢測不到，但是粒徑較大的PS微塑料(250 nm)排出28 d后仍有檢出，說明粒徑會影響微塑料的攝入和排出. 因此，小粒徑微塑料在海洋魚類中的攝入和排出仍值得關(guān)注.

海水青鳉成魚攝食PS微塑料24 h后，解剖分離魚鰓、腸道和魚體部分，熒光顯微鏡觀察結(jié)果(見圖4)顯示，海水青鳉攝食的PS微塑料魚鰓中有少量檢出〔見圖4(a)〕，腸道內(nèi)有大量檢出〔見圖4(b)〕，魚體表皮〔見圖4(c)〕未觀察到明顯熒光信號，這說明魚體表皮對PS微塑料吸附作用可能較小. 這與已有研究[18,23,28]中發(fā)現(xiàn)消化道是魚富集微塑料的主要部位一致. Cong等[28]研究中將海水青鳉暴露于10 μm PS微塑料，發(fā)現(xiàn)腸道中富集PS微塑料最多，但并未在其他部分檢測到PS微塑料的存在. 該研究在魚鰓中也檢測到了PS微塑料，這可能與該研究中所用PS微塑料的粒徑(0.5 μm)較小有關(guān)，PS微塑料可能隨著魚的呼吸進(jìn)入魚鰓，并被魚鰓截留. Lu等[18]研究中同樣發(fā)現(xiàn)，5 μm PS微塑料可以進(jìn)入斑馬魚的魚鰓. 排出72 h后，通過熒光顯微鏡觀察腸道、魚鰓和魚體部分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，魚鰓〔見圖4(d)〕中PS微塑料已經(jīng)完全排出，腸道〔見圖4(e)〕中微塑料仍有部分停留在腸道末端，這可能是由于排出階段未喂食，造成微塑料在腸道內(nèi)的滯留. Cong等[28]研究中也有類似發(fā)現(xiàn)，在不喂食情況下，微塑料排出緩慢，喂食會加速微塑料的排出.

圖4 熒光顯微鏡下觀察海水青鳉攝入和排出后PS微塑料在魚鰓、腸道和魚體中的分布情況

將顯微鏡觀察后的海水青鳉不同組織進(jìn)行消解并定量檢測，根據(jù)2.1節(jié)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，結(jié)果(見圖5)發(fā)現(xiàn)，攝食24 h后，PS微塑料在海水青鳉腸道內(nèi)含量為(246.6±38.1)mg/g(以魚濕質(zhì)量計)，占總攝入量的99.9%，而魚鰓(占0.07%)和體表(占0.03%)含量較少. 經(jīng)過72 h排出后，腸道內(nèi)剩余PS微塑料的含量為(1.29±0.52)mg/g. 表明PS微塑料主要通過攝食活動進(jìn)入魚體，并在腸道內(nèi)大量富集，隨后PS微塑料隨糞便緩慢排出，但被海水青鳉成魚排出之后的PS微塑料是否會重新懸浮到水中或重新進(jìn)入生物體有待開展更深入的研究.

注： 不同小寫字母或大寫字母表示數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異(P<0.05).

2.3 海水青鳉攝食對微塑料賦存形態(tài)的影響

生物攝食活動對微塑料環(huán)境行為的影響目前研究較少，該研究結(jié)果(見圖6)發(fā)現(xiàn)，初始加入時PS微塑料顆粒在海水中呈分散狀態(tài)〔見圖6(a)〕，但經(jīng)過海水青鳉攝食，大部分PS微塑料變成糞便沉到水底〔見圖6(b)〕，說明生物攝食會改變PS微塑料在海水環(huán)境中的存在狀態(tài). 選取一粒糞便通過熒光顯微鏡觀察，結(jié)果〔見圖6(c)〕發(fā)現(xiàn)糞便中有較強(qiáng)熒光信號，通過掃描電鏡放大觀察糞便內(nèi)部，結(jié)果〔見圖6(d)〕顯示，PS微塑料以顆粒形式匯聚在糞便中，形貌無顯著變化，表明海水青鳉攝食可以改變PS微塑料的存在狀態(tài)但對其形貌無顯著影響. 由于密度的差異，微塑料在環(huán)境中存在狀態(tài)不同，密度較輕的微塑料一般會漂浮在水面或懸浮于水中，而經(jīng)過生物攝食后會使漂浮的微塑料團(tuán)聚而變重，發(fā)生沉降. Katija等[33]研究也發(fā)現(xiàn)巨型海鞘能夠通過攝食微塑料將其轉(zhuǎn)化為糞便包裹物，加速了微塑料從海水表層向深層的轉(zhuǎn)移，因此海洋微塑料的監(jiān)測應(yīng)該考慮對不同水層深度的采樣，以免造成微塑料含量的低估. 有研究發(fā)現(xiàn)PE(聚乙烯，polyethylene)微塑料經(jīng)過南極蝦消化系統(tǒng)后可以破碎產(chǎn)生納米塑料[34]，說明生物攝食行為可能增加環(huán)境中產(chǎn)生納米塑料的風(fēng)險. 海水青鳉不斷攝食其周圍環(huán)境中懸浮態(tài)微塑料，將其轉(zhuǎn)化為糞便排出體外，但不會再次攝食以糞便形式存在的微塑料，因此海水青鳉的攝食是一種將懸浮分散的微塑料不斷轉(zhuǎn)化為團(tuán)聚沉降的過程，這可能會影響微塑料的生物可利用性，但是否增加腐食性生物或底棲生物的暴露風(fēng)險值得進(jìn)一步探究.

圖6 微塑料在海水青鳉成魚攝食前后的狀態(tài)以及糞便的熒光信號表征和掃描電鏡形貌表征

3 結(jié)論

a) 該研究針對生物體內(nèi)小粒徑微塑料定量示蹤的技術(shù)難題，提出熒光法和C-14同位素法，并對比了兩種方法在檢測限、靈敏度和定性定量等方面的差異. 對比發(fā)現(xiàn)熒光法可以直觀觀察微塑料，在研究生物體內(nèi)的分布及高濃度暴露時的熒光定量方面較為適用，而C-14同位素法因具有更低的檢測限和高的靈敏度，在復(fù)雜介質(zhì)中進(jìn)行低濃度暴露時的定量檢測更具優(yōu)勢.

b) 利用兩種示蹤技術(shù)研究海水青鳉成魚和仔魚對微塑料的攝食動力學(xué)和體內(nèi)分布發(fā)現(xiàn)：成魚和仔魚攝入微塑料的量隨著培養(yǎng)時間而變化，均在24 h攝入較多微塑料，且成魚比仔魚具有更高的攝食能力；微塑料在海水青鳉的腸道分布極多，遠(yuǎn)大于魚鰓與體表，表明攝食是微塑料進(jìn)入海水青鳉的主要途徑，且在不喂食情況下排出72 h后，腸道內(nèi)仍殘留相當(dāng)一部分微塑料無法排出.

c) 值得注意的是，雖然魚類攝食微塑料后很難真正進(jìn)入內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)，但其攝入、消化、排出過程在很大程度上改變了微塑料尤其是小粒徑微塑料的環(huán)境賦存形態(tài). 海水青鳉通過對水中懸浮狀態(tài)微塑料的攝入，將海水中的微塑料由初始懸浮分散態(tài)變成糞便團(tuán)聚體沉入水底，攝食行為對微塑料形貌雖無顯著影響，但可能會對微塑料的環(huán)境過程和生態(tài)效應(yīng)產(chǎn)生未知影響.