林 童，郭徐靜，武敬宇，熊勇華，郭 亮

(南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047)

基于納米材料的免疫檢測(cè)探針因優(yōu)異的信號(hào)輸出能力在分析測(cè)試領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用[1-3]。充分暴露納米材料表面抗體的抗原結(jié)合區(qū)Fab片段有利于免疫探針捕獲抗原，提高免疫檢測(cè)性能。目前，在納米粒子表面固定抗體的方法有物理吸附法、共價(jià)偶聯(lián)法和生物親和法等。其中，物理吸附法[4-5]相對(duì)簡(jiǎn)單。但是使用該方法制備的抗體-納米顆粒復(fù)合物不穩(wěn)定，重復(fù)性差，且抗體在納米粒子表面無(wú)法定向。生物親和法是通過(guò)親和素-生物素系統(tǒng)或抗體結(jié)合蛋白介導(dǎo)的偶聯(lián)方式。其偶聯(lián)產(chǎn)物的穩(wěn)定性雖優(yōu)于物理吸附，但所用蛋白價(jià)格昂貴。共價(jià)偶聯(lián)法可形成穩(wěn)定的抗體-納米顆粒復(fù)合物，有效避免抗體在檢測(cè)及儲(chǔ)存過(guò)程中脫落，且無(wú)需使用額外的結(jié)合蛋白。利用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)活化羧基使納米粒子與抗體間通過(guò)酰胺鍵連接是最為常用的共價(jià)偶聯(lián)方法[6-7]。然而由于抗體中廣泛分布氨基和羧基，使抗體與納米材料的結(jié)合不是位點(diǎn)特異性的，導(dǎo)致抗體在納米粒子表面仍是隨機(jī)取向。由于無(wú)法充分暴露Fab片段，該方法制備的復(fù)合物表面的有效抗體數(shù)不足4%[8]。同時(shí)，通過(guò)酰胺鍵連接抗體還可能導(dǎo)致抗體自交聯(lián)，由此形成的多層抗體可產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，使抗體的抗原結(jié)合能力進(jìn)一步降低。IgG是一種糖基化蛋白，其恒定區(qū)Fc片段具有寡糖鏈。因此通過(guò)氧化Fc片段上的碳水化合物可獲得醛基[9]，從而可與氨基修飾的納米粒子實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性的共價(jià)偶聯(lián)。然而，其氧化反應(yīng)及醛基氨基偶聯(lián)步驟易破壞抗體天然構(gòu)象，降低抗體活性。另一種相對(duì)簡(jiǎn)單的位點(diǎn)特異性抗體偶聯(lián)策略是在納米粒子表面修飾可特異性結(jié)合Fc片段的蛋白[10]，如蛋白A、蛋白G和Fc受體。但是這種結(jié)合是非共價(jià)偶聯(lián)，且此類(lèi)結(jié)合蛋白價(jià)格昂貴，使檢測(cè)成本增加。

硼酸在適當(dāng)?shù)膒H條件下可以與含順式二醇的分子，如糖類(lèi)和糖蛋白等，快速形成穩(wěn)定的環(huán)狀酯。因此，表面修飾硼酸基團(tuán)的各類(lèi)材料最初被廣泛應(yīng)用于捕獲糖蛋白及構(gòu)建糖蛋白傳感器[11]。此后，Lin等[12]制備硼酸功能化磁珠并利用抗體Fc片段上的寡糖和硼酸間的親和作用在其表面定向結(jié)合抗體，用于捕獲富集相應(yīng)抗原。與表面抗體非定向偶聯(lián)的磁珠相比，其提取效率可提高5倍。該研究使硼酸化納米材料的應(yīng)用拓展至不含糖的靶標(biāo)的捕獲，如藥物[13]、毒素[14]等。近年來(lái)，硼酸介導(dǎo)的抗體固定化在相應(yīng)抗原的免疫法檢測(cè)中也開(kāi)始有所應(yīng)用。例如，Zeininger等人[15]在硼酸化的直徑為100 μm的熒光液滴表面偶聯(lián)腸道沙門(mén)氏菌抗體，利用抗體與沙門(mén)氏菌結(jié)合后液滴熒光的變化進(jìn)行檢測(cè)。Wang等人[16]則在硼酸化的熒光氮化碳納米片表面偶聯(lián)抗體，利用抗體與抗原結(jié)合后氮化碳納米片熒光的變化檢測(cè)多種生物標(biāo)志物。本研究在合成硼酸修飾的聚馬來(lái)酸酐-alt-1-十八碳烯(PBA-PMAO)的基礎(chǔ)上，采用超聲乳化法制備表面硼酸改性的量子點(diǎn)熒光微球(PBA-QBs)，并將其與甲胎蛋白(AFP)單克隆抗體結(jié)合制備高抗體活性的熒光檢測(cè)探針用于定量免疫層析檢測(cè)AFP。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

CdSe/ZnS量子點(diǎn)，美國(guó)Ocean NanoTech公司；十二烷基磺酸鈉(SDS)、聚馬來(lái)酸酐-alt-1-十八烯(PMAO,MW=30000-50000)，美國(guó)Sigma公司； 3-氨基苯硼酸 (3-APBA)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，上海Aladdin公司；山羊抗IgG抗體，重慶欣源佳和生物科技有限公司；AFP標(biāo)準(zhǔn)品、一對(duì)抗AFP單克隆抗體(標(biāo)記與包被)，上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司。硝酸纖維素膜(NC膜)、吸水紙、PVC粘性底板，上海捷寧生物技術(shù)有限公司；其他化學(xué)品均為分析級(jí)。AFP陰性人血清樣品由江西省第一人民醫(yī)院醫(yī)院提供。

UNICELL干式熒光免疫分析儀，亞輝龍生物科技股份有限公司；F-4500熒光分光光度計(jì)，日立公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；可編程切條機(jī)、HGS510劃膜噴金機(jī)，杭州峰航科學(xué)儀器有限公司；TGL-16型高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；粒度與Zeta電位分析儀，馬爾文公司；超純水儀，Millipore公司；JEOL JEM 2100型透射電鏡，JEOL公司；分析天平，梅特勒-托利公司；ZF-2型三用紫外儀，上海市安亭電子儀器廠。

1.2 PBA-PMAO的合成

用15 mL三氯甲烷充分溶解350.0 mg PMAO、136.9 mg 3-APBA和122.0 mg DMAP后，將溶液轉(zhuǎn)至圓底燒瓶并置于50 ℃油浴中勻速攪拌反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液快速冷卻至室溫，向其中加入60 mL pH=5.0的硫酸氫鉀水溶液，充分振蕩，4 ℃、10 000 r·min-1離心10 min。離心結(jié)束后，去除上層水相，用移液槍吸取下層油相轉(zhuǎn)移至新離心管中，重復(fù)洗滌3次。隨后將油相置于含15 mL超純水的圓底燒瓶中，25 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至不再析出白色固體。旋蒸產(chǎn)物經(jīng)減壓過(guò)濾后，將白色固體轉(zhuǎn)至潔凈、干燥的玻璃培養(yǎng)皿中，置于60℃烘箱中干燥12 h，即可得到PBA-PMAO。

1.3 PBA-QBs的合成

PBA-QBs的合成采用微乳液法[17]。將5 mg量子點(diǎn)和10 mg PBA-PMAO充分溶解于110 μL三氯甲烷中，再向其中加入250 μL一定濃度的SDS水溶液，充分振蕩混勻?；旌弦河眉?xì)胞破碎儀超聲乳化后(超聲條件：超聲總時(shí)間2 min；運(yùn)行時(shí)間10 s；暫停時(shí)間5 s；超聲功率 80 W)，將微乳液置于60 ℃水浴加熱4 h除去三氯甲烷。PBA-QBs懸液離心15 min后，將沉淀重懸于于1 mL堿水(pH=10)中，振蕩水解過(guò)夜。最后將懸液離心除去上清，用超純水重復(fù)洗滌PBA-QBs 2次后復(fù)溶至1 mL超純水中，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PBA-QB免疫探針的制備

將0.6 mg PBA-QBs、45 μg抗AFP單克隆抗體(標(biāo)記)及4 mL pH=7的 0.01 M PB緩沖液充分混勻，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)5 min。加入0.2 mg葡萄糖，封閉反應(yīng)3 min后以13 500 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心15 min，沉淀復(fù)溶于2 mL PB復(fù)溶液中(含0.01M pH 7.4 PB緩沖液，含0.1% NaN3(w/v))，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PBA-QBs熒光試紙條的制備及免疫層析檢測(cè)流程

PBA-QBs熒光試紙條的制備[18]過(guò)程如下：將1.5 mg·mL-1的抗AFP單克隆抗體(包被)、1.0 mg·mL-1羊抗鼠IgG抗體以6 mm 的距離噴分別涂于NC膜上做為檢測(cè)AFP的檢測(cè)線(xiàn)(T線(xiàn))與質(zhì)控線(xiàn)(C線(xiàn) )；隨后將NC膜置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中37 ℃干燥12 h；最后將制備好的NC膜、樣本墊、吸水紙依次黏貼于PVC 底板上，再使用可編程切條機(jī)將其切割為寬度3.9 mm的成品試紙條，室溫密封干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品中AFP的檢測(cè)流程如下：將2 μL PBA-QB免疫檢測(cè)探針與68 μL AFP樣本溶液充分混合孵育5 min后，加入到試紙條的樣品孔中，室溫層析20 min后用干式熒光免疫分析儀讀取其T線(xiàn)熒光強(qiáng)度(FIT)、C線(xiàn)熒光強(qiáng)度(FIC)。

免疫層析檢測(cè)原理如圖1所示：當(dāng)樣本溶液中含有AFP時(shí)，PBA-QB免疫探針與AFP結(jié)合形成的免疫復(fù)合物，隨溶液在NC膜中向前涌動(dòng)至試紙條T線(xiàn)，并與固定在T線(xiàn)上的抗AFP單克隆抗體(包被)結(jié)合形成雙抗夾心免疫復(fù)合物，使T線(xiàn)區(qū)域顯現(xiàn)熒光；而當(dāng)樣本溶液中不含AFP時(shí)，PBA-QB免疫檢測(cè)探針不會(huì)被T線(xiàn)上的抗AFP單克隆抗體(包被)捕獲，無(wú)法形成夾心免疫復(fù)合物，T線(xiàn)區(qū)域無(wú)熒光；無(wú)論樣本溶液中是否含有AFP，未被T線(xiàn)捕獲的PBA-QB免疫檢測(cè)探針均會(huì)繼續(xù)向前遷移至C線(xiàn)區(qū)域，并被C線(xiàn)上的羊抗鼠IgG抗體捕獲產(chǎn)生熒光。若C線(xiàn)無(wú)熒光條帶產(chǎn)生，則說(shuō)明該檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。

圖1 PBA-QBs熒光免疫層析試紙條檢測(cè)AFP的原理圖

1.5 PBA-QBs熒光試紙條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

通過(guò)倍比稀釋法將AFP標(biāo)準(zhǔn)品從250 ng mL-1稀釋至0.98 ng mL-1，用PBA-QBs熒光試紙條檢測(cè)各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)3次，在最佳讀取時(shí)間記錄FIT與FIC。以AFP濃度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)IT/FIC值為縱坐標(biāo)，繪制檢測(cè)AFP的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將20個(gè)陰性樣本(AFP濃度為：0 ng·mL-1)的FIT/FIC值的平均值加上其3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)帶入標(biāo)準(zhǔn)方程中，以計(jì)算出的AFP濃度作為最低檢測(cè)限。

1.6 PBA-QBs熒光試紙條性能評(píng)價(jià)

將經(jīng)化學(xué)發(fā)光法測(cè)定為AFP陰性的血清樣品用PBS緩沖液(pH=7.4)稀釋10倍。取3份上述血清稀釋液，向其中添加不同量的AFP標(biāo)準(zhǔn)品制備濃度分別為10，4和1 ng mL-1的加標(biāo)血清樣品。在一天內(nèi)，使用同一批次試紙條檢測(cè)以上加標(biāo)樣品，每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)5次，計(jì)算回收率與變異系數(shù)，評(píng)價(jià)檢測(cè)的準(zhǔn)確度和批內(nèi)穩(wěn)定性；按上述方法重復(fù)檢測(cè)3天，計(jì)算回收率與變異系數(shù)，評(píng)價(jià)檢測(cè)的準(zhǔn)確度和批間穩(wěn)定性。將制備好的PBA-QBs熒光試紙條用鋁箔進(jìn)行單個(gè)塑封，隔絕光線(xiàn)以及防止空氣濕度的變化，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保存。每隔7 d測(cè)定1次HBsAg陽(yáng)性樣品(200 ng mL-1)，連續(xù)測(cè)定56 d，記錄試紙條的FIT/FIC值，以評(píng)價(jià)PBA-QBs熒光試紙條的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 PBA-PMAO的表征

PBA-PMAO合成的原理如圖2所示。PBA的氨基作為親核基團(tuán)進(jìn)攻PMAO中酸酐基團(tuán)的羰基碳，形成酰胺鍵和游離的羧基。合成產(chǎn)物的傅里葉變換紅外光譜(FTIR)如圖3所示：2 925和2 853 cm-1峰是-CH2中的C-H伸縮振動(dòng)峰；1 650 cm-1為酰胺(-CONH-)Ⅰ帶中C=O伸縮振動(dòng)峰；1 552 cm-1峰為酰胺Ⅱ帶中C-N伸縮振動(dòng)和N-H彎曲振動(dòng)耦合形成的特征吸收峰；1 343，1 188和1 028 cm-1峰分別為硼酸基團(tuán)(-B(OH)2)中的B-O伸縮振動(dòng)峰、B-O-H彎曲振動(dòng)峰和C-B伸縮振動(dòng)峰[19]。由上可知，產(chǎn)物分子中含有酰胺鍵和苯硼酸基團(tuán)，表明PBA-PMAO成功合成。

2.2 PBA-QBs的表征

通過(guò)調(diào)節(jié)SDS的濃度制備不同粒徑的PBA-QBs。如圖4a所示，當(dāng)SDS濃度為1，2，4和6 mg·mL-1時(shí)，PBA-QBs的水化粒徑分別為239.1，202.5，139.8和98.8 nm，多分散指數(shù)(PDI)分別為0.181，0.106，0.084和0.086。在同等質(zhì)量濃度下，以波長(zhǎng)為365 nm的激發(fā)光激發(fā)，其熒光強(qiáng)度(發(fā)射波長(zhǎng)：618 nm)分別為2 994，2 883，2 427和1 593(圖4b)。由于大粒徑的QBs粒徑分布相對(duì)不均一且可能產(chǎn)生相對(duì)較強(qiáng)的檢測(cè)背景信號(hào)[20]，而小粒徑QBs因熒光強(qiáng)度低不利于提高檢測(cè)靈敏度，因此本實(shí)驗(yàn)選擇使用水化粒徑為202.5 nm的PBA-QBs制備免疫探針。其透射電鏡圖顯示(圖4c)，制備的PBA-QBs成規(guī)則的球形，且粒徑分布較均勻；單個(gè)粒子的高分辨率透射電鏡圖顯示，大量油溶性CdTe /ZnSe 量子點(diǎn)緊密的包埋于聚合物中。

圖2 PBA-PMAO的合成

λ/cm-1圖3 PBA-PMAO的紅外圖譜

Sizc/nm

λ/nm

圖4 使用不同濃度SDS溶液制備時(shí)PBA-QBs的水化粒徑(a)與熒光圖譜(b)； 使用2 mg mL-1SDS溶液制備的PBA-QBs的透射電鏡圖(c)

2.3 PBA-QB免疫探針的合成及表征

2.3.1 偶聯(lián)緩沖液pH的優(yōu)化

pH是決定硼酸與含順式二醇生物分子結(jié)合穩(wěn)定性的最重要因素。當(dāng)pH<硼酸pKa時(shí)，硼酸構(gòu)型趨向平面三角型(sp2雜化)，與順式二醇之間的結(jié)合有限；當(dāng)pH>硼酸pKa時(shí)，硼酸構(gòu)型趨向四面體型(sp3雜化)，可與順式二醇之間形成穩(wěn)定五元或六元環(huán)狀酯。由于傳統(tǒng)的硼酸材料pKa值相對(duì)較高(如氨基苯硼酸[21]，pKa=8.8)，其與IgG抗體結(jié)合通常需要一個(gè)偏堿性的pH值。而生物樣品的pH值一般在4.5～8.0之間，這會(huì)降低偶聯(lián)物在待測(cè)樣品中的穩(wěn)定性。本研究制備的PBA-PMAO(圖5a)是一種wulff型硼酸[22](O→B)，可降低PBA的pKa，使其硼酸基團(tuán)在較低的pH下即可與抗體上糖基結(jié)合，從而避免偶聯(lián)過(guò)程中抗體失活及檢測(cè)時(shí)抗體脫落。

在不同pH的緩沖液中偶聯(lián)PBA-QB和AFP單抗制備免疫探針并將其用于AFP溶液檢測(cè)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)均重復(fù)檢測(cè)3次并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，依據(jù)FIT值的大小評(píng)價(jià)偶聯(lián)效率。從圖5b可知，隨著緩沖溶液pH值的升高，其FIT值逐漸增大；當(dāng)pH=7時(shí)，F(xiàn)IT達(dá)到最大值。其原因可能是pH=7時(shí)硼酸基團(tuán)的構(gòu)型趨向四面體型，同時(shí)緩沖液pH值接近AFP單抗的等電點(diǎn)[23](IgG的pI= 6.95)，抗體帶電量較低，與硼酸間的靜電斥力較弱，利于抗體吸附在PBA-QBs表面并與硼酸結(jié)合。而當(dāng)pH值大于7時(shí)，F(xiàn)IT逐漸降低。其原因可能是溶液pH值大于抗體的等電點(diǎn)時(shí)，均帶負(fù)電的抗體與PBA-QBs發(fā)生靜電排斥，降低了抗體在微球表面的可及性，不利于與硼酸的共價(jià)結(jié)合。因此，選擇pH7做為最佳偶聯(lián)pH。

2.3.2 抗體添加量的優(yōu)化

使用不同量的AFP單抗在pH 7的緩沖液中偶聯(lián)PBA-QB制備免疫探針，并將其用于AFP溶液檢測(cè)，各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，依據(jù)FIT值的大小考察抗體最佳用量，結(jié)果如圖5c所示。當(dāng)AFP單抗添加量從15增加至 75 μg mg-1時(shí)，試紙條FIT逐漸上升；當(dāng)進(jìn)一步增加抗體用量時(shí)，F(xiàn)IT反而降低。其原因可能是當(dāng)固定在QBs表面的抗體密度過(guò)高時(shí)，抗體間相互擠壓導(dǎo)致其天然構(gòu)象破壞或產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)。因此，選擇75 μg·mg-1作為最佳抗體添加濃度。

2.3.3 PBA-QB免疫探針表征

在最佳pH值和最佳抗體用量條件下制備免疫探針并表征其水化粒徑、Zeta電位及熒光圖譜。表征結(jié)果如圖6a與6b所示，抗AFP單克隆抗體(標(biāo)記)與PBA-QBs偶聯(lián)后，其平均水化粒徑從202.5增大至225.4 nm，Zeta電位從-47.9 mV上升為-39.7 mV,表明AFP單抗成功偶聯(lián)至PBA-QBs表面。由熒光發(fā)射光譜圖(圖6c)可知，偶聯(lián)抗體前后PBA-QBs的熒光峰型和熒光強(qiáng)度均基本一致，表明所制備的探針具有良好的熒光特性。

(a)PBA-PMAO中的wulff型硼酸

pH(b)偶聯(lián)緩沖液pH對(duì)FIT的影響

Amount of added AFP mAb/(μg mg-1) (c)抗體添加量對(duì)FIT的影響圖5 免疫探針制備條件優(yōu)化

λ/nm

Zeta Potcntial/mV

λ/nm圖6 PBA-QBs與抗體偶聯(lián)前后的水化粒徑(a)、Zeta電位(b)及熒光圖譜(c)

2.4 PBA-QBs熒光試紙條優(yōu)化

PBA-QBs熒光試紙條T線(xiàn)上AFP單克隆抗體(包被)噴涂濃度和探針用量是影響試紙條靈敏度的關(guān)鍵參數(shù)。在不同噴涂濃度和探針用量下檢測(cè)AFP溶液，各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，依據(jù)FIT值的大小進(jìn)行優(yōu)化。從圖7a可知，當(dāng)T線(xiàn)上AFP單克隆抗體噴涂濃度從0.5 mg mL-1提高至1.5 mg mL-1時(shí)，F(xiàn)IT隨之升高；但當(dāng)濃度高于1.5 mg mL-1時(shí)，F(xiàn)IT基本無(wú)變化。圖7b表明，當(dāng)PBA-QB免疫探針的用量從0.5增加至2 μL時(shí)，F(xiàn)IT隨之升高；但當(dāng)用量大于2 μL時(shí)，F(xiàn)IT基本無(wú)變化。因此，本實(shí)驗(yàn)試紙條制備時(shí)，T線(xiàn)AFP單克隆抗體(包被)濃度為1.5 mg mL-1，PBA-QBs探針用量為2 μL。

免疫層析時(shí)間是影響熒光試紙條定量分析的重要因素之一。因此需要通過(guò)建立FIT、FIC和FIT/FIC與免疫層析時(shí)間的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)，確定最佳免疫層析時(shí)間。如圖7c所示，隨著免疫層析時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)IT、FIC及FIT/FIC值持續(xù)增大，且FIT、FIC值在30 min內(nèi)仍未達(dá)到穩(wěn)定值；而 FIT/FIC比值在層析20 min 后即趨于穩(wěn)定，并且在后 20 min內(nèi)比值無(wú)明顯變化。因此PBA-QBs熒光試紙條檢測(cè)AFP最佳定量判讀時(shí)間為20 min。

2.5 PBA-QBs熒光試紙條檢測(cè)AFP的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

PBA-QBs熒光免疫層析試紙條檢測(cè)AFP的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖8所示。在濃度為0.98～31.25 ng mL-1的范圍內(nèi)，F(xiàn)IT/FIC值隨AFP濃度的增加而線(xiàn)

Concentration of AFP mAbs on T line/(mg·mL-1)(a)T線(xiàn)上AFP抗體(包被)噴涂濃度對(duì)FIT的影響

Volume of PBA-QB probes/μL(b)PBA-QB免疫探針用量對(duì)FIT的影響

t/min(c)PBA-QBs熒光試紙條FIT、FIC和FIT/FIC的免疫動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)圖7 試紙條制備及檢測(cè)條件優(yōu)化

AFP concentration/(ng·mL-1)圖8 PBA-QBs 熒光試紙條定量檢測(cè)AFP的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

性增大。其線(xiàn)性方程為y=0.020 9x+0.039 3(R2=0.992 4)，最低檢測(cè)限(LOD)為0.45 ng mL-1，表明PBA-QBs熒光試紙條對(duì)AFP具有優(yōu)異的檢測(cè)性能。

2.6 PBA-QBs熒光試紙條準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)

批內(nèi)、批間加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，PBA-QBs熒光試紙條檢測(cè)AFP的批內(nèi)回收率介于91.0%～106.6%之間，CV值介于3.65%～6.92%之間；批間回收率介于91.2%～107.1%之間，CV值介于4.75%～ 10.42%之間。該結(jié)果表明，本研究建立的PBA-QBs熒光試紙條檢測(cè)AFP的方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度。PBA-QBs熒光試紙條穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果表明，測(cè)試期間試紙條的FIT/FIC值穩(wěn)定(CV<4.3%)，說(shuō)明該試紙條有較好的檢測(cè)穩(wěn)定性。

表1 血清加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了一種簡(jiǎn)單的基于PBA-PMAO的表面硼酸功能化PBA-QBs的制備方法。該微球既可與抗體簡(jiǎn)便、快速地定向偶聯(lián)，又因量子點(diǎn)含量高而具有很強(qiáng)的熒光信號(hào)，是一種優(yōu)良的免疫探針制備材料。將其與AFP單克隆抗體結(jié)合制備高抗體活性的熒光免疫層析檢測(cè)探針用于定量檢測(cè)血清中的AFP，效果良好。