趙書雪， 劉曉青， 伍寧豐， 田健

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定071000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081)

生物體代謝會產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫酶(catalase，CAT)催化過氧化氫分解為水和氧氣，幾乎所有好氧生物體內(nèi)都通過這一抗氧化反應(yīng)來保護生物體機能[1]。過氧化氫酶由于其獨特的抗氧化能力在生物[2]、醫(yī)學(xué)[3]、臨床[4]和食品[5]等方面具有廣泛應(yīng)用。另外，過氧化氫酶作為過氧化氫消毒的后處理工藝中的重要酶制劑，在機械消毒、紡織漂白[6]和廢水處理[7]方面有著積極作用。此外，過氧化氫酶在畜牧[8]、乳品[9]、食品保鮮[10]等方面也有著廣泛的應(yīng)用。

商品過氧化氫酶主要來源于動物肝臟[11]和黑曲霉[12]。但是動物肝臟中的過氧化氫酶提取工藝復(fù)雜。黑曲霉過氧化氫酶一般通過黑曲霉自身發(fā)酵[13]產(chǎn)生，耐堿耐高溫，但一般商業(yè)銷售的黑曲霉過氧化氫酶的比活為100 U·mg-1，酶活力不高，且熱穩(wěn)定性不好。目前研究的過氧化氫酶多為中溫酶，最適溫度是30～50 ℃，比如葡萄球菌[14]、創(chuàng)傷弧菌[15]、地芽孢桿菌屬[16]來源的過氧化氫酶等。中溫酶在低溫或常溫條件下催化效率低，極大限制了其在食品、洗滌、低溫環(huán)境修復(fù)等產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用。對低溫過氧化氫酶的研究并不多，且熱穩(wěn)定性不好，嚴(yán)重制約了其在生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用，亟待改進。比如Lorentzen等[17]從嗜冷海洋細菌VibriosalmonicidaLFI1238中克隆的過氧化氫酶最適溫度是0～10 ℃，60 ℃處理不到10 min失活；Zeng等[18]從SerratiamarcescensSYBC08分離的過氧化氫酶最適溫度是20 ℃，在60 ℃處理45 min剩余酶活40%；王偉[19]從南極海洋微生物中分離的芽孢桿菌Bacillussp.N2a的過氧化氫酶的最適溫度是25 ℃，在60 ℃處理30 min失活。因此，分離在低溫下具有較高活力且熱穩(wěn)定性好的過氧化氫酶將能極大的提升其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。

垃圾滲濾液包含多種有害化學(xué)物質(zhì)：溶解的有機物、無機鹽、重金屬及作為活性氧(reactive oxygen species，ROS)來源的異生物質(zhì)有機化合物[20]，例如超氧化物，從而存在多種自由基物質(zhì)，已經(jīng)從中篩選到可以降解自由基的菌株，如假單胞菌[21]、擬桿菌屬[22]、雙酶梭狀芽胞桿菌[23]等。而過氧化氫酶是降解自由基的重要酶之一[24]，且垃圾滲濾液屬于城市污水，城市污水的溫度多為15～25 ℃[25]，因此垃圾滲透液是篩選低溫過氧化氫酶的理想來源。本研究從垃圾滲濾液中篩選出一株過氧化氫酶表達量較高的斯氏假單胞菌，并在大腸桿菌中表達其過氧化氫酶基因，酶學(xué)性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，該酶具有低溫性質(zhì)且熱穩(wěn)定性較好，為開發(fā)新型商品低溫過氧化氫酶提供了新的材料，并為其在低溫行業(yè)的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1菌株和質(zhì)粒 垃圾滲濾液采自北京北神樹衛(wèi)生填埋場，從中篩選獲得PseudomonasstutzeriS12菌株，pET30a(+)質(zhì)粒載體為本實驗室保存，E.coliTOP10克隆菌株、E.coliBL21(DE3)表達菌株購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2工具酶和試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自New England Biolabs (NEB) 公司；TaqDNA聚合酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購自Axygen生物技術(shù)有限公司；細菌基因組提取試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；BCA蛋白濃度定量試劑盒由江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司提供；鎳柱填料購自GE公司；30%過氧化氫購自阿拉丁試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，購自北京化學(xué)試劑公司。

1.2 培養(yǎng)基和相關(guān)溶液

LB 培養(yǎng)基: 5 g·L-1酵母提取物，10 g·L-1蛋白胨，10 g·L-1NaCl，固體培養(yǎng)基含20 g·L-1瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

過氧化氫底物溶液：首先利用高錳酸鉀滴定法[26]測定30%過氧化氫試劑摩爾濃度，然后用50 mmol·L-1pH 7.4磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液稀釋到25 mmol·L-1，即為過氧化氫底物溶液。

1.3 實驗儀器

PCR儀(Bio-rad公司)、紫外分光光度計(上海尤尼科科技有限公司)、超聲破碎儀(美國Branson公司)。

1.4 試驗方法

1.4.1過氧化氫酶高表達菌株初篩 將垃圾滲濾液用LB液體培養(yǎng)基稀釋20倍，涂布在LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)14～18 h，此時菌株生長完好，從中篩選出26株菌落形態(tài)單一的菌株，用6%過氧化氫進行平板檢測，觀察菌株受到過氧化氫刺激而產(chǎn)生氣泡的情況。

1.4.2高過氧化氫酶表達菌株復(fù)篩 從垃圾滲濾液中篩選到3個具有過氧化氫酶活性菌株，以1%的接種量接種到5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，并對細胞進行超聲破碎，分別測量菌液、發(fā)酵液上清、菌體破碎上清的酶活。

1.4.3過氧化氫酶基因克隆 將從垃圾滲濾液中篩選到的具有高過氧化氫酶活性的菌株送到北京奧維森基因科技有限公司進行基因組測序，經(jīng)過全基因組序列分析獲得該菌株過氧化氫酶基因katE序列信息。通過基因組提取試劑盒提取該菌株的基因組，并以該基因組為模板,用katE基因特異性引物(katE-F: cggatccATGACCGATA-AACCCAAATTGACG；katE-R: cctcgagGACCAGC-GCCTCCGCCAGG)擴增獲得katE基因片段。 PCR反應(yīng)體系50 μL：基因組 2 μL，2×TaqBuffer 25 μL，katE-F1 μL，katE-R1 μL，dNTP Mix (10 mmol·L-1) 1.0 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1.0 μL，ddH2O到50 μL。 擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，62 ℃(每個循環(huán)降低1 ℃)30 s，72 ℃ 1 min，14 個循環(huán)；95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.4.4pET30a-katE重組質(zhì)粒的構(gòu)建katE基因擴增片段經(jīng)BamH I和XhoI酶切后，連接到經(jīng)同樣酶切的pET30a(+)載體上，構(gòu)建重組載體。將重組質(zhì)粒pET30a-katE轉(zhuǎn)化到E.coliTOP10克隆菌株，經(jīng)菌液PCR方法挑選陽性克隆子并送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。序列在NCBI比對分析保守結(jié)構(gòu)域。

1.4.5KatE過氧化氫酶的表達 從E.coliTop10菌株中提取重組質(zhì)粒pET30a-katE并轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)表達菌株，添加終濃度為0.336 mmol·L-1IPTG，16 ℃、200 r·min-1誘導(dǎo)18～20 h， 4 ℃、8 000 r·min-1離心5 min，棄上清獲得菌體，用20 mmol·L-1Tris-Cl重懸菌體，用超聲破碎儀進行超聲破碎，10 000 r·min-1離心30 min后取上清，通過鎳柱純化蛋白[27]。

1.4.6KatE過氧化氫酶活力測定 過氧化氫酶活力測定采用分光光度計方法[28]并適當(dāng)改進。在試管中加入900 μL含25 mmol·L-1過氧化氫底物的50 mmol·L-1pH 7.4的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，35 ℃預(yù)熱3 min，加入100 μL酶液，35 ℃反應(yīng)3 min，加入1 mL的2 mol·L-1硫酸終止反應(yīng)。在240 nm處檢測過氧化氫的剩余量，過氧化氫的消光系數(shù)是43.6 L·mol-1·cm-1。

酶活(U)定義：1 min分解1 μmol過氧化氫需要的酶量。

1.4.7KatE酶學(xué)性質(zhì)的測定 ①最適溫度。 在50 mmol·L-1pH 7.4磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉底物緩沖液下，分別在10、20、30、35、40、50、60、70 ℃下測定KatE的過氧化氫酶活力。

②溫度穩(wěn)定性。分別將酶蛋白在50、60和70 ℃下處理1、2、3、4、5 h，然后在35 ℃、50 mmol·L-1pH 7.4磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉底物緩沖液下測定KatE的過氧化氫酶活力，以未處理的酶活計為100%，計算熱處理后酶蛋白的相對酶活力。

③最適pH。在35 ℃條件下，分別在pH 5．0～6．0 (50 mmol·L-1磷酸氫二鈉-檸檬酸)、pH 6．0～8．0 (50 mmol·L-1磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉)、pH 8．0 ～ 9．0 (50 mmol·L-1Tris-鹽酸)、pH 9．0～10．0 (50 mmol·L-1甘氨酸-氫氧化鈉)的底物緩沖液下測定KatE的過氧化氫酶活力。

④pH穩(wěn)定性。將酶蛋白分別在pH 5．0～6．0 (50 mmol·L-1磷酸氫二鈉-檸檬酸)、pH 6．0～8．0 (50 mmol·L-1磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉)，pH 8．0～9. 0 (50 mmol·L-1Tris-鹽酸)、pH 9．0～10．0 (50 mmol·L-1甘氨酸-氫氧化鈉)中4 ℃孵育1 h，然后在35 ℃、50 mmol·L-1pH 8.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉底物緩沖液下測定KatE 的過氧化氫酶活力，以未處理的酶活計為100%，計算pH緩沖液處理后酶蛋白的相對酶活力。

⑤金屬離子對酶活的影響。將0.03 mg·mL-1的酶分別在終濃度1 mmol·L-1的金屬離子Li+、Na+、K+、Ni2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Ba2+、Co2+、Al3+中4 ℃孵育1 h，然后在35 ℃、50 mmol·L-1pH 8.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉底物緩沖液下測定KatE的過氧化氫酶活力，以未處理的酶活計為100%，計算金屬離子溶液處理后酶蛋白的相對酶活力。

⑥動力學(xué)參數(shù)。以不同濃度的過氧化氫(4.5、6、7.5、9、12、13.15、15、18、24 mmol·L-1)為底物，分別測定不同底物濃度下的過氧化氫的利用速率，采用雙倒數(shù)作圖法 (Lineweaver-Burk法)，求該酶的Km值和Vmax值。

2 結(jié)果與分析

2.1 高活力過氧化氫酶菌株的篩選

從垃圾滲濾液中篩選到26株細菌，經(jīng)過平板檢測發(fā)現(xiàn)3株菌產(chǎn)生氣泡較多，具有過氧化氫酶活性。對這3株菌進行擴大培養(yǎng)并測量其菌液、發(fā)酵液上清、菌體破碎上清的過氧化氫酶酶活，發(fā)現(xiàn)1號菌株相對其他菌株具有更高過氧化氫酶酶活，且其過氧化氫酶在胞內(nèi)表達，結(jié)果如圖1所示。經(jīng)過對1號菌株的16S rDNA分析，發(fā)現(xiàn)該菌株與假單胞菌屬的序列相似性為99%以上，因此該菌株是假單胞菌屬。之后結(jié)合全基因組分析發(fā)現(xiàn)該菌株的全基因組數(shù)據(jù)與斯氏假單胞菌相似性最高，因此可以判斷該菌株屬于斯氏假單胞菌，并命名該菌株為PseudomonasstutzeriS12。

圖1 從垃圾滲濾液篩選的3個菌株的過氧化氫酶活力

2.2 過氧化氫酶基因katE的序列分析

對上述篩選得到的高過氧化氫酶活性的菌株P(guān).stutzeriS12進行全基因組測序及分析，發(fā)現(xiàn)該基因組上具有1個編碼過氧化氫酶的基因katE。該基因編碼486個氨基酸和1個終止密碼子，具有NADPH、血紅素、四聚體結(jié)合位點，典型(單功能)血紅素過氧化氫酶，屬于過氧化氫酶中的小亞基酶。

2.3 重組過氧化氫酶KatE的誘導(dǎo)表達

將含有過氧化氫酶基因katE的重組質(zhì)粒pET30a-katE轉(zhuǎn)入到E.coliBL21(DE3)表達菌株，誘導(dǎo)表達并通過鎳柱純化獲得目的蛋白，將純化后的酶蛋白進行SDS-PAGE檢測，如圖2所示，純化后的蛋白條帶單一且條帶大小和通過計算得到的62 kD相符合。

圖2 KatE蛋白SDS-PAGE分析

2.4 KatE的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1溫度對KatE的酶學(xué)性質(zhì)的影響 從圖3可以看出， KatE的最適溫度為35 ℃，且在10～40 ℃之間酶活力較平穩(wěn)且高，40 ℃之后，酶活迅速下降，因此KatE在低溫下酶活力較好。在60 ℃保溫2 h后剩余酶活為50%左右，因此該酶熱穩(wěn)定性較好。

圖3 溫度對KatE活力的影響

2.4.2pH對KatE的酶學(xué)性質(zhì)的硬性 在pH 5.0～12.0范圍內(nèi)對KatE的過氧化氫酶活力進行測定，結(jié)果圖4所示，KatE的最適pH為8.0。且在35 ℃、pH 8.0時KatE酶比活可達到1 349 U·mg-1。將酶液于不同pH緩沖液處理1 h后測定酶的pH穩(wěn)定性，該酶在pH 7～ 10剩余酶活均在90%以上，說明該酶在堿性條件下比較穩(wěn)定，且最適pH 8.0下酶最穩(wěn)定，因此該酶是堿性過氧化氫酶。

圖4 pH對KatE活力的影響

2.4.3金屬離子對KatE的過氧化氫酶活力的影響 測定不同金屬離子對酶活力的影響，結(jié)果如圖5所示，1 mmol·L-1Na+、Mg2+對該酶的活性有一定的促進作用，酶活分別提高2%、6%，Li+、K+、Ba2+對該酶的活性抑制作用不明顯，Zn2+、Mn2+、Ca2+、Al3+對酶活有部分抑制作用，Ni2+、Cu2+、Co2+對酶的抑制作用最強，酶活均下降了99%。

圖5 金屬離子對KatE過氧化氫酶活力的作用

2.4.4KatE的動力學(xué)參數(shù)測定 通過雙倒數(shù)作圖法 (Lineweaver-Burk 法)計算該酶Vmax為16 666 μmol·L-1·min-1，Km為100.5 mmol·L-1，kcat為574.05 s-1。如圖6所示，線性擬合較好，R2為0.993 2，因此該數(shù)據(jù)分析是準(zhǔn)確的。

圖6 動力學(xué)參數(shù)測定

3 討論

斯氏假單胞菌P.stutzeri通常是生物安全級別較高的菌株，對其進行基因挖掘不僅對生物實驗安全有益處，更為以后的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供安全基礎(chǔ)。目前對P.stutzeri的研究主要集中于對有機磷農(nóng)藥的降解[29]、反硝化作用[30]、固氮[31]、降解黃曲霉毒素的作用[32]，但是對于其抗氧化作用目前沒有報道。而過氧化氫酶是生物抗氧化應(yīng)激的細胞防御機制的重要組成部分，它可以將過氧化氫分解為氧氣和水，具有良好地抗氧化作用[33]。過氧化氫酶在動物、植物、微生物中廣泛存在，細菌、酵母、霉菌中都分離出來不少過氧化氫酶[34]。但是目前沒有關(guān)于對斯氏假單胞菌的過氧化氫酶進行體外表達和性質(zhì)的研究，因此本研究對該層面進行了探究，以此豐富了對斯氏假單胞菌的研究。

本研究從垃圾滲濾液中篩選出一株可表達過氧化氫酶的斯氏假單胞菌P.stutzeriS12，克隆了該菌株的過氧化氫酶katE基因，并對過氧化氫酶KatE的酶學(xué)性質(zhì)進行了研究。結(jié)果表明，KatE最適溫度是35 ℃，且在10～40 ℃酶比活較好，因此KatE是偏低溫的中溫酶。在50 ℃處理5 h，該酶酶活仍剩余70%左右，在60 ℃保溫2 h剩余50%左右,其熱穩(wěn)定性優(yōu)于一些中溫酶。來自谷氨酸棒桿菌C.glutamicumATCC 13032的過氧化氫酶的最適溫度為30 ℃，60 ℃保溫30 min失活，剩余酶活10%[35]；來自藤黃微球菌M.luteus的過氧化氫酶在60 ℃孵育15 min，剩余酶活70%[36]；兼性嗜冷菌V.rumoiensiss-1T的過氧化氫酶的最適溫度40 ℃，但是在65 ℃保溫10 min后蛋白酶完全失活[36]；該酶的熱穩(wěn)定性還能與一些高溫酶媲美，來自嗜熱球形脲芽胞桿菌UreibacillusthermosphaericusFZSF03的過氧化氫酶最適溫度為60 ℃，60 ℃熱處理1 h，剩余酶活70%[37]；來自海洋的不動桿菌屬Acinetobactersp. YS0810過氧化氫酶最適溫度是60 ℃，在60 ℃保溫30 min后剩余酶活78%[38]；與粘質(zhì)沙雷氏菌性質(zhì)相似的SerratiaSYBC-01 過氧化氫酶的最適溫度70 ℃，60 ℃熱處理1 h，剩余酶活70%[39]。此外，該酶的熱穩(wěn)定性明顯優(yōu)于商業(yè)過氧化氫酶，比如牛肝過氧化氫酶60 ℃熱處理15 min后剩余酶活僅有 20%[36]，黑曲霉過氧化氫酶在60 ℃熱處理1 h，剩余酶活40%多[40]?？梢?，本研究中過氧化氫酶KatE具有良好的熱穩(wěn)定性，有替代商品過氧化氫酶的潛力。此外，該酶在40 ℃之前的酶活力較高且穩(wěn)定，因此該酶在低溫條件下可能會有較好的應(yīng)用潛力，對于食品低溫保鮮[41]，全冷鏈行業(yè)中過氧化氫消毒的后處理有一定的作用。因此對katE基因的深入研究并寄希望于工業(yè)生產(chǎn)中實際應(yīng)用是后面實驗研究的重點。

金屬離子對蛋白酶的酶比活影響的作用機制目前研究并不完善。本研究發(fā)現(xiàn)，大部分金屬離子對KatE的過氧化氫酶活力的抑制作用不明顯，Ni2+、Cu2+、Co2+對酶的抑制作用較為明顯，而Na+、Mg2+對有一定的促進作用。由于KatE的最適pH是8.0，且在堿性條件下比較穩(wěn)定，因此推測該酶是堿性蛋白酶。因此，Na+提高KatE的過氧化氫酶活性的機理可能是增強了蛋白酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[42]，而Mg2+提高KatE的過氧化氫酶活性的機理可能是置換了KatE活性中心的金屬離子。Co2+、Cu2+可能是與KatE發(fā)生反應(yīng)，破壞了酶的空間結(jié)構(gòu)，致使KatE失活，而Ni2+的抑制作用可能是氯化鎳與磷酸鹽發(fā)生反應(yīng)生成絡(luò)合物從而抑制KatE的酶活。因此在反應(yīng)中適當(dāng)?shù)丶尤隢a+、Mg2+可提高酶活力，并避免在體系中混有Co2+、Cu2+、Ni2+而抑制酶活。

在35 ℃、pH 8.0時KatE酶比活可達到1 349 U·mg-1，Vmax為16 666 μmol·L-1·min-1，Km為100.5 mmol·L-1,Kcat是574.05 s-1。而牛肝過氧化氫酶的Km是 49 mmol·L-1，Kcat是68 000 s-1[43]，黑曲霉過氧化氫酶的Vmax是1 500 μmol·mg-1·min-1，Km是27.73 mmol·L-1[33]，UreibacillusthermosphaericusFZSF03過氧化氫酶的Km是101.5 mmol·L-1[28], 因此可以發(fā)現(xiàn)，KatE相對于商品過氧化氫酶，對過氧化氫的親和能力不高，對該蛋白進行改造以提高其對過氧化氫的親和能力，提高催化效率是后續(xù)實驗研究的重點。

本研究將來源于斯氏假單胞菌的過氧化氫酶進行了異源表達、純化并對其酶學(xué)性質(zhì)進行測定。結(jié)果表明，該過氧化氫酶具有較好的中低溫環(huán)境適應(yīng)性，熱穩(wěn)定性較好，在冷鏈消毒和食品保鮮方面有較好的應(yīng)用前景。但該過氧化氫酶的過氧化氫的親和能力不高，今后有望通過理性設(shè)計和定向進化等分子改造手段進一步提高過氧化氫酶的催化效率。