袁漢文 李琳 呂夢穎 羅江溢 劉楊 彭彩云 王煒

〔摘要〕 目的 對比枳實與其易混淆品枳殼、青皮、陳皮的薄層色譜鑒別方法，以期篩選更科學合理的鑒別方法，將其納入《美國藥典》和《歐洲藥典》標準。方法 采用《中華人民共和國藥典》《臺灣中藥典》《香港中藥材標準》以及《中藥色譜指紋圖譜精細分析圖集》所記載的枳實、枳殼、陳皮、青皮4味中藥材的薄層色譜鑒別方法，對4味藥材化學成分差異性進行系統(tǒng)分析研究。結(jié)果 對通過13種薄層色譜方法得到的色譜圖進行對比分析，發(fā)現(xiàn)2020版《中華人民共和國藥典》中枳殼的方法對枳實和其易混淆品種青皮和陳皮的鑒別效果較好。結(jié)論 4味藥材化學成分具有較高的相似性，各版本藥典中4味藥材的薄層色譜鑒別方法均能對四者化學成分進行分析，但絕大部分方法沒有特異性，無法區(qū)分四者。

〔關(guān)鍵詞〕 枳實;枳殼;青皮;陳皮;薄層色譜;鑒別

〔中圖分類號〕R282.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.10.011

Research on Discrimination of Zhishi （Aurantii Fructus Immaturus） From Its Commonly

Known Adulterants Based on Thin Layer Chromatography

YUAN Hanwen1， LI Lin1， LV Mengying1， LUO Jiangyi1， LIU Yang1，2， PENG Caiyun1， WANG Wei1*

（1. TCM and Ethnomedicine Innovation & Development International Laboratory， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Institute for Food and Drug Control， Changsha， Hunan 410001， China）

〔Abstract〕 Objective To compare the thin layer chromatography method for the identification of Zhiqiao （Aurantii Fructus）， Qingpi （Citri Reticulatae Pericarpium Viride） and Chenpi （Citri Reticulatae Pericarpium）， screen out the best one， and help to develop reasonable and scientific standards of American Pharmacopoeia and European Pharmacopoeia. Methods The differences of chemical components of four kinds of Chinese herbal medicines， namely， Zhishi （Aurantii Fructus Immaturus）， Zhiqiao （Aurantii Fructus）， Qingpi （Citri Reticulatae Pericarpium Viride） and Chenpi （Citri Reticulatae Pericarpium）， were systematically analyzed and studied by thin layer chromatography method recorded in Chinese Pharmacopoeia， Taiwan Traditional Chinese Medicine Dictionary， Hong Kong Standard of Chinese Herbal Medicines and Atlas of Fine Analysis of Chromatographic Fingerprint of Chinese Herbal Medicines. Results The results found the method in Chinese Pharmacopoeia （2020 edition） showed the method of Zhiqiao （Aurantii Fructus） had better discrimination effect on Zhishi （Aurantii Fructus Immaturus） and its commonly known adulterants， after comparison of 13 methods in the pharmacopeia. Conclusion The four herbal medicines showed high similarity in chemical constituents. All the methods can be used for the analysis of the herbs， but most of them have the shortcomings of poor specificity and can not be used to distinguish the four herbs.

〔Keywords〕 Zhishi （Aurantii Fructus Immaturus）; Zhiqiao （Aurantii Fructus）; Qingpi （Citri Reticulatae Pericarpium Viride）; Chenpi （Citri Reticulatae Pericarpium）; thin layer chromatography; discrimination

枳實為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果，5～6月收集自落的果實，除去雜質(zhì)，自中部橫切為兩半，曬干或低溫干燥，較小者直接曬干或低溫干燥[1-3]。枳實作為常用的理氣藥，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性微寒，味苦，辛、酸，歸脾、胃經(jīng)，具有良好的破氣消積、化痰散痞等功效[4]，臨床主要用于積滯內(nèi)停、痞滿脹痛、瀉痢后重、大便不通、痰滯氣阻胸痹、結(jié)胸、臟器下垂等疾病的治療[5-7]。

市售枳實存在基源混亂的現(xiàn)象[8-10]。其中，枳殼、陳皮、青皮3種中藥材與枳實同屬于蕓香科柑橘屬，基源相同或相近，在化學成分和功效方面皆存在相似之處，導致4種藥材極易混淆，特別是枳實與個青皮，炮制后的飲片大小、形狀相似，色澤相同，橫切面特征相近[11]。枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種的干燥未成熟果實，于7月果皮尚綠時采收，自中部橫切為兩半，曬干或低溫干燥[12];陳皮為蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟果皮，藥材可分為“陳皮”和“廣陳皮”，于釆摘成熟果實，剝?nèi)」ぃ瑫窀苫虻蜏馗稍颷13];青皮為蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實的果皮，5～6月收集自落的幼果，曬干，習稱“個青皮”;7～8月采收未成熟的果實，在果皮上縱剖成四瓣至基部，除盡瓤瓣，曬干，習稱“四花青皮”[14-15]。由于基源、采收時間、入藥部位等的不同，4味藥材藥性存在差異，各藥在功效上也各有側(cè)重，枳實藥力竣猛，多用于破積導滯;枳殼藥力緩和，多用于理氣寬中、消脹除滿;而陳皮長于理氣健脾;青皮長于疏肝破氣;在臨床上需區(qū)別使用[16]。國際上收錄的中草藥標準除《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）外，還有在國際上被廣泛認可的《美國藥典》和《歐洲藥典》，兩者均強調(diào)利用薄層色譜或指紋圖譜對同屬植物、混淆品、偽品進行鑒別。

課題組承擔了2018年國家重點研發(fā)計劃“中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究”專項“中藥國際標準示范研究”子課題，其中的任務(wù)包括了制定枳實的《美國藥典》或《歐洲藥典》標準。本文對主流藥典中收載有枳實及其易混品種的薄層色譜鑒別方法進行了對比分析，旨在對枳實及其易混淆品種化學成分差異性進行系統(tǒng)研究，并通過比較不同藥典及版本中記載的方法，篩選出能鑒別枳實及其混偽品的方法，促進枳實臨床用藥的安全性和有效性。同時，為枳實藥材納入《美國藥典》和《歐洲藥典》標準提供更科學的理論參考。

1 材料與方法

1.1? 藥材

從亳州中藥材市場、邵陽廉橋中藥材市場及各產(chǎn)地收集枳實藥材24批、枳殼5批、青皮8批（其中個青皮4批、四花青皮4批）、陳皮3批，其產(chǎn)地主要為江西、湖南、浙江、廣東，每批樣品收集500 g。所有藥材均由湖南中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室龔力民教授初步鑒定。樣品信息見表1。

1.2? 試劑

辛弗林對照品（上海詩丹德生物技術(shù)有限公司，批號：5337）;川陳皮素（上海詩丹德生物技術(shù)有限公司，批號：6082）;橘皮素（上海詩丹德生物技術(shù)有限公司，批號：6083）;柚皮苷（寶雞市辰光生物科技有限公司，批號：HN206558198）;橙皮苷（寶雞市辰光生物科技有限公司，批號：HN206560198）;新橙皮苷（寶雞市辰光生物科技有限公司，批號：HAD6D5D3198）;各分析純有機試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司;薄層層析硅膠板（煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司）;1%氫氧化鈉硅膠板（上海盛亞薄層層析硅膠板）;0.5%氫氧化鈉硅膠板（青島海洋化工有限公司）;聚酰胺薄膜板（薄層層析，浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）。

1.3? 主要儀器

101型電熱鼓風干燥箱（北京市光明醫(yī)療儀器有限公司）;KH-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）;TG16-WS臺式高速離心機（湖南湘立科學儀器有限公司）;SP-20E型全自動點樣儀（上?？普苌萍加邢薰荆?TH-Ⅱ型數(shù)控薄層顯色加熱器（上?？普苌萍加邢薰荆?GoodLook-1000型薄層色譜成像系統(tǒng)（上?？普苌萍加邢薰荆?。

1.4? 方法

本文采用2020版《中國藥典》、《臺灣中藥典》第二版和第三版、《香港中藥材標準》第四期以及《中藥色譜指紋圖譜精細分析圖集》中所記載的枳實、枳殼、陳皮、青皮4味中藥材的薄層色譜鑒別方法，對4味藥材化學成分差異性進行系統(tǒng)分析研究[1，17-20]。

供試品溶液制備：各批次藥材樣品粉碎后按方法提取，各樣品溶液高速離心后經(jīng)微孔濾膜過濾，即得供試品溶液，各樣品制備方法詳見各版本藥典。

對照品溶液制備：取對照品適量，用相應溶劑溶解，配置成適宜濃度的對照品溶液。

點樣與展開：吸取適宜體積的樣品溶液，進行條帶狀噴霧點樣，于雙槽展開缸中展開，取出，晾干。

檢視：于紫外燈（365 nm）下檢識，或噴以相應顯色劑，加熱后于紫外燈（365 nm）或可見光下檢識。

2 結(jié)果與分析

2.1? 枳實薄層鑒別方法對比分析

不同版本藥典中枳實項下檢測的主要成分均為辛弗林等生物堿或氨基酸，均以辛弗林為對照品，且三者使用的展開劑相同，僅樣品制備方法及點樣量略有差異，因此，其對枳實、枳殼、青皮、陳皮的鑒別結(jié)果也類似（圖1）。從紅色方框中可以看出，青皮和陳皮化學成分差異較大，3種方法均能對其區(qū)分。而青皮中紅色箭頭位置斑點的顏色較枳實和枳殼深，即其含量相對較高，但是其區(qū)別并不明顯。薄層色譜圖中，各斑點顏色與對照品辛弗林類似，可以推測其為辛弗林的類似物，從圖中可以看出，該類成分較多，部分斑點并不明顯，且斑點之間重疊較嚴重，部分斑點難以達到較好分離。

2.2? 枳殼薄層鑒別方法對比分析

各版本藥典枳殼薄層色譜鑒別方法均主要檢測其中的黃酮化合物，并以新橙皮苷和柚皮苷為對照品。從圖2可以看出3種方法檢測的結(jié)果差別較大，其中，2020版《中國藥典》方法斑點清晰，枳實和枳殼的化學成分具有高度相似性，主要成分均為新橙皮苷和柚皮苷，該方法無法區(qū)分枳實和枳殼，但是二者與青皮和陳皮區(qū)別明顯。青皮和陳皮中無法檢測到新橙皮苷和柚皮苷，但其可以檢測到枳實和枳殼中沒有的成分C1和C2?！断愀壑兴幉臉藴省分械姆椒z測結(jié)果與《中國藥典》類似，但是其色譜圖中，在新橙皮苷上方?jīng)]有明顯的斑點，而前者中斑點較清晰（紅色方框區(qū)域），且這些成分其在在枳實和枳殼中可以檢測到，而青皮和陳皮中不存在。《臺灣中藥典》中項下方法對其主要成分分離較差，各斑點成分比移值十分接近，該方法不適用于枳實、枳殼、青皮及陳皮的鑒別。

2.3? 陳皮薄層鑒別方法對比分析

各版本藥典陳皮薄層色譜鑒別均以橙皮苷為對照品，其中，《中國藥典》和《臺灣中藥典》均采用二次展開，而且展開劑相同，但《中國藥典》使用的是0.5%氫氧化鈉制備的硅膠G薄層板，而《臺灣中藥典》使用的是普通硅膠板，并且兩者樣品溶液制備略微有所差異，但兩者的結(jié)果較為相似，說明硅膠板的酸堿性對于該方法的分離影響不大。從圖3A和圖3B中可以看出，枳實中斑點C1比枳殼更加明顯，說明枳實中C1的含量比枳殼中要高，而青皮和陳皮中無法檢測到C1，并且青皮中化合物C2含量明顯比陳皮要高，即該方法可用于四者的鑒別。但受不同批次樣品的影響，枳實和枳殼中化學成分C1的含量存在差異，該方法對枳實和枳殼的鑒別并不十分可靠。

2.4? 青皮薄層鑒別方法對比分析

2020版《中國藥典》中青皮的薄層鑒別與陳皮一致，而《香港中藥材標準》中未收載青皮，《臺灣中藥典》第二版與第三版使用的展開劑相同，但其樣品溶液制備方法略有不同，第二版中使用的是普通硅膠板，而第三版改用了0.5%氫氧化鈉制備的堿性硅膠板，其得到的結(jié)果與《中國藥典》類似，而第二版所用的普通硅膠板效果較差，說明堿性對其薄層色譜分離影響較大（圖4），綜合上述的實驗結(jié)果，硅膠板的堿性是否對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響取決于展開劑系統(tǒng)。

2.5? 《中藥色譜指紋圖譜精細分析圖集》收錄方法研究

按照《中藥色譜指紋圖譜精細分析圖集》對枳實、枳殼、陳皮、青皮中黃酮苷和苷元分別進行了研究，其中，黃酮苷的研究方法與《中國藥典》中枳殼方法類似，其改變了展開劑比例并加入了冰醋酸以改變pH，結(jié)果也與之相類似（圖5），但新橙皮苷和柚皮苷上方的斑點相對不清晰。該方法應用了橙皮苷為對照品，結(jié)果顯示，枳實和枳殼中不存在橙皮苷，而其在青皮和陳皮中含量較高，并驗證了“2.2”實驗結(jié)果中C2斑點為橙皮苷。該方法利用10%的硫酸-乙醇溶液進行顯色后在可見光下觀察，但是其斑點不如直接在紫外光下檢識清晰。而對黃酮苷元部分得到研究也可清楚的看到四者化學成分的差異性，枳實和枳殼明顯比青皮和陳皮多3個斑點（C1、C2和C3），而青皮中C4的含量明顯比陳皮要高，這些特征亦可用于鑒別枳實、枳殼、青皮、陳皮，但是該方法中成分斑點較模糊，且各斑點之間分離度不高。

2.6? 所有樣品的薄層色譜檢測

綜合上述各實驗方法結(jié)果，2020版《中國藥典》枳殼鑒別方法結(jié)果斑點清晰，各成分分離效果較好，可用于對四者的鑒別，且操作簡單。利用該方法對所有收集的樣品進行檢測，結(jié)果表明，枳實枳殼化學成分相似，且酸橙和甜橙之間也沒有明顯區(qū)別。在陳皮樣品中，橙皮苷下方的一斑點比青皮要明顯，說明其含量較高。5個批次枳實樣品的薄層色譜圖（圖6，ZS-20～ZS-24）明顯與青皮一致，說明其基源應該為橘，而并非酸橙或甜橙。1個批次青皮（圖6，QP-8）主要成分為新橙皮苷和柚皮苷，其色譜特征與枳實和枳殼一致，說明其基源應為酸橙或甜橙，而并非橘。該結(jié)果也說明，市場中確實存在有將橘的幼果按枳實的加工方法制成了枳實，同時也有按青皮的采收季節(jié)和加工方法，用酸橙或甜橙制成的青皮藥材。在外觀性狀上，這些混偽品難以與正品進行區(qū)分，而通過優(yōu)選的薄層色譜方法，可以通過其化學成分的差異性對其進行區(qū)分，這對保障其臨床用藥的準確、安全與有效具有重要意義。

3 討論

中藥標準化是實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化、中藥國際化的重要戰(zhàn)略，對提升我國中藥質(zhì)量、確保中藥獨特治療功效具有重要意義。國際上收錄中草藥的標準除《中國藥典》《臺灣中藥典》和《香港中藥材標準》外，主要還有《美國藥典》《歐洲藥典》《日本藥局方》《韓國藥典》《印度草醫(yī)藥典》等，其中以《美國藥典》和《歐洲藥典》被認可范圍較廣。本文對《中國藥典》《臺灣中藥典》《香港中藥材標準》中枳實和其易混淆品種枳殼、青皮和陳皮的薄層色譜進行了對比研究，發(fā)現(xiàn)各版本藥典均能對4味藥材進行分析，但是其化學成分高度相似，無法特異區(qū)分。枳實和枳殼基源相同或相近，只是采收時期不一樣，實驗結(jié)果表明兩者的化學成分高度相似，從化學的角度難以對其進行區(qū)分，對枳實和枳殼藥材的鑒別可與其外觀性狀相結(jié)合。本研究表明，采用2020版《中國藥典》中枳殼項下方法分析得到的薄層色譜圖斑點更清晰，能夠準確區(qū)分與枳實易混淆的陳皮和青皮。因此，采用2020版《中國藥典》方法對市場上收集的樣品進行分析鑒別，結(jié)果表明樣品中4個批次的枳實樣品并非酸橙或甜橙，而是其混偽品，一個批次的青皮基源也并非橘，該實驗結(jié)果也驗證了枳實、枳殼、青皮和陳皮市場混亂的情況。枳實為湖南大宗道地藥材，保證其基源的準確性，是其臨床用藥安全性和有效性的基本保障，同時本文的研究結(jié)果也為枳實收錄于《歐洲藥典》和《美國藥典》的標準制定提供科參考。

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