洪 麗，王 哲，湯小涵，袁海龍*

基于雷公法結(jié)合鹽炙法對補骨脂的炮制及肝毒性評價

洪 麗1, 2，王 哲2，湯小涵2，袁海龍1, 2*

1.安徽醫(yī)科大學(xué)空軍臨床學(xué)院，安徽 合肥 230032 2.空軍特色醫(yī)學(xué)中心藥學(xué)部，北京 100142

基于雷公法結(jié)合鹽炙法對補骨脂進行炮制減毒并評價補骨脂炮制前后的肝毒性變化。建立高效液相色譜法同時測定補骨脂中補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂甲素、補骨脂乙素和補骨脂酚6個指標成分的含量；選取醇濃度、醇浸時間和蒸制時間為考察因素，以指標成分含量下降率的綜合加權(quán)評分為指標，正交試驗優(yōu)化炮制工藝，并通過小鼠肝毒性實驗評價補骨脂炮制前后的肝毒性。補骨脂最佳炮制工藝，按《中國藥典》2020年版鹽炙法制備鹽補骨脂，取鹽補骨脂適量，加入5倍量80%乙醇浸泡24 h，倒出乙醇并用蒸餾水洗凈，加入5倍量蒸餾水，浸泡12 h，倒出蒸餾水并洗凈，置蒸鍋內(nèi)隔水蒸4 h，取出晾干；由該法炮制所得的補骨脂炮制品中毒性成分含量明顯下降，小鼠肝毒性顯著降低。該炮制方法可明顯降低補骨脂的肝毒性，為臨床合理炮制補骨脂提供參考。

補骨脂；雷公法；鹽炙法；炮制減毒；正交試驗；肝毒性；補骨脂素；異補骨脂素；新補骨脂異黃酮；補骨脂甲素；補骨脂乙素；補骨脂酚

補骨脂，又名破故紙，是豆科一年生直立草本補骨脂L.的干燥成熟果實，性溫，味辛、苦，歸腎、脾經(jīng)，具有溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉的功效，臨床用于治療腎陽不足、腰膝冷痛、五更泄瀉等，外用治白癜風及斑禿[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明補骨脂具有抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤和抗氧化等藥理作用[2]。然而，近年來臨床相繼出現(xiàn)了補骨脂及其復(fù)方制劑長期或大劑量使用致嚴重肝損害的案例報道[3-6]，已經(jīng)引起國內(nèi)外研究者及藥監(jiān)部門的廣泛關(guān)注，這在一定程度上限制了補骨脂及其復(fù)方制劑的臨床應(yīng)用。因此，探索有效的減毒方法，促進補骨脂及其復(fù)方制劑的臨床應(yīng)用及其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展顯得尤為重要。

合理炮制是降低中藥毒性的有效方法之一，文獻報道的補骨脂炮制減毒方法有鹽炙法、雷公法、酒焙法、清炒法等，其中以鹽炙法為主[7-8]，《中國藥典》2020年版一部收載的補骨脂炮制品為鹽補骨脂[1]。補骨脂鹽炙不僅是引藥下行、增補肝腎，還能通過除去藥物中的燥性達到減毒的目的[9]。但是，研究發(fā)現(xiàn)鹽補骨脂仍然具有一定的肝毒性[10-11]，影響其臨床應(yīng)用的安全性。

文獻報道，《雷公炮炙論》記載的酒浸水漂法（雷公法）可有效降低補骨脂的潛在肝毒性[12]。因此，本研究嘗試將鹽炙法與雷公法結(jié)合對補骨脂進行炮制減毒研究，以補骨脂中致毒的關(guān)鍵成分補骨脂酚、新補骨脂異黃酮、補骨脂甲素、補骨脂乙素[13]及毒效成分補骨脂素和異補骨脂素的含量變化為指標，重點對雷公法進行炮制工藝優(yōu)化，并初步評價其炮制減毒效果。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AD型高效液相色譜儀（日本島津公司）；BT25S電子天平（十萬分之一分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KQ5200-B型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；TG16-W高速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；Epoch酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；ASP300S型全自動封閉脫水機（Leica公司）；RM2135型切片機（Leica公司）；BX51型顯微鏡（OLYMPUS公司）；BMJ-1型包埋機（天津航空機電公司）；S1-M82型打粉機（九陽股份有限公司）；蒸鍋（浙江蘇泊爾股份有限公司）；C21-RT2149美的電磁爐（廣東美的生活電器制造有限公司）；藥典三號篩（上海楚柏實驗室設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

補骨脂（產(chǎn)地河南，購自北京人衛(wèi)中藥飲片有限公司，批號為20110306）經(jīng)空軍特色醫(yī)學(xué)中心袁海龍主任藥師鑒定為豆科植物補骨脂L.的干燥成熟果實；對照品補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂甲素、補骨脂乙素、補骨脂酚（批號分別為20062812、20061812、20062205、20060805、20121110、20060912，質(zhì)量分數(shù)均≥98%）均購自北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，批號分別為20201206、20201112）；食鹽（中鹽鹽業(yè)有限公司）；4%多聚甲醛溶液（北京索萊寶科技有限公司，批號20200508）；95%藥用乙醇（南京潤升石化有限公司）；乙腈和甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）；甲酸（色譜純，上海麥克林生化科技有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

昆明小鼠，雄性，SPF級，體質(zhì)量（20±2）g，購自北京科宇動物養(yǎng)殖中心，生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2018-0010。動物實驗經(jīng)空軍特色醫(yī)學(xué)中心倫理委員會批準，批準號為空特（科研）第2021-87-PJ01。

2 方法與結(jié)果

2.1 補骨脂中指標成分定量分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 Diamonsil-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫，0～12 min，48%～53%A；12～30 min，53%～70%A；30～40 min，70%～85%A；40～45 min，85%A；45～50 min，85%～48%A。柱溫30 ℃；檢測波長為240 nm；體積流量1.0 mL/min；進樣量10 μL。

2.1.2 對照品儲備液的制備 精密稱取對照品補骨脂素15.00 mg、異補骨脂素5.80 mg、新補骨脂異黃酮9.80 mg、補骨脂甲素8.00 mg、補骨脂乙素9.00 mg分別于10 mL量瓶中，甲醇定容，制成含1.50 mg/mL補骨脂素、580 μg/mL異補骨脂素、980 μg/mL新補骨脂異黃酮、800 μg/mL補骨脂甲素、900 μg/mL補骨脂乙素對照品儲備液。精密稱取補骨脂酚21.80 mg于25 mL量瓶中，甲醇定容，制成872 μg/mL對照品儲備液。

2.1.3 混合對照品儲備液的制備 精密量取1 mL補骨脂素、2 mL異補骨脂素、0.5 mL新補骨脂異黃酮、0.5 mL補骨脂甲素、0.5 mL補骨脂乙素、5 mL補骨脂酚對照品儲備液于同一10 mL量瓶中，甲醇定容，制成含150 μg/mL補骨脂素、116 μg/mL異補骨脂素、49 μg/mL新補骨脂異黃酮、40 μg/mL補骨脂甲素、45 μg/mL補骨脂乙素、436 μg/mL補骨脂酚的混合對照品儲備液。

2.1.4 供試品溶液的制備 取補骨脂適量粉碎，過三號篩，精密稱取粉末0.1 g，置25 mL量瓶中，加入20 mL甲醇，超聲提取30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，取適量，15 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液的進樣溶液。

2.1.5 陰性對照溶液 以甲醇為陰性對照溶液。

2.1.6 專屬性試驗 精密吸取陰性對照、混合對照品及供試品溶液各10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件分別進樣，記錄色譜圖，見圖1。補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂甲素、補骨脂乙素、補骨脂酚色譜峰均能實現(xiàn)基線分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按補骨脂素峰計均不低于3000，且陰性對照溶液對測定無干擾。

1-補骨脂素 2-異補骨脂素 3-新補骨脂異黃酮 4-補骨脂甲素 5-補骨脂乙素 6-補骨脂酚

2.1.7 線性關(guān)系考察 精密量取混合對照品儲備液5 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋定容后，再同法逐級稀釋，配制成一系列濃度梯度的混合對照品溶液，分別取10 μL按“2.1.1”項下色譜條件進行分析。以峰面積（）為縱坐標，對照品濃度（）為橫坐標繪制標準曲線，見表1。結(jié)果表明6種指標成分在一定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 指標成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.1.8 精密度試驗 取“2.1.7”項下中間濃度混合對照品溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂甲素、補骨脂乙素、補骨脂酚峰面積的RSD分別為0.44%、0.60%、0.51%、1.31%、1.37%、0.49%。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗 取補骨脂粉末0.1 g，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂甲素、補骨脂乙素、補骨脂酚峰面積的RSD分別為0.52%、0.42%、1.10%、1.05%、1.63%、0.87%。

2.1.10 重復(fù)性試驗 取補骨脂粉末0.1 g，共6份，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算各指標成分的質(zhì)量分數(shù)。結(jié)果顯示補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂甲素、補骨脂乙素、補骨脂酚含量的RSD分別為0.81%、0.81%、1.02%、1.70%、1.60%、0.69%。

2.1.11 加樣回收率試驗 取補骨脂粉末0.1 g，共9份，分別按指標成分含量的80%、100%、120%加入對照品，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，進樣測定并計算加樣回收率。結(jié)果顯示補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂甲素、補骨脂乙素、補骨脂酚的平均加樣回收率分別為103.46%、105.09%、92.91%、96.55%、100.02%、99.72%，RSD分別為0.62%、1.65%、1.90%、1.69%、1.18%、1.44%。

2.2 補骨脂炮制工藝研究

2.2.1 補骨脂鹽炙 照《中國藥典》2020年版四部通則（0213）鹽炙法，取凈補骨脂藥材100 g，鹽水20 mL（含鹽2 g）悶潤4 h，傾出鹽水，在炒藥鍋中炒制，文火炒至膨脹，崩裂，表面呈黑色或黑褐色，氣清香，味微咸，放涼即可，備用。

2.2.2 鹽補骨脂雷公法炮制 取同一批次的鹽補骨脂適量，對其進行雷公法炮制。在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合文獻方法[12]，選取醇濃度（A）、醇浸時間（B）和蒸制時間（C）為考察因素，每個因素設(shè)置3個水平，以補骨脂酚、新補骨脂異黃酮、補骨脂甲素、補骨脂乙素、補骨脂素和異補骨脂素的含量下降率的綜合加權(quán)評分為指標，采用L9(34)正交試驗優(yōu)化炮制工藝，因素與水平見表2。

表2 正交試驗因素與水平

按L9(34)正交表進行補骨脂炮制品的制備，并采用建立的HPLC方法測定各炮制品中指標成分的質(zhì)量分數(shù)，計算含量下降率。

下降率＝(補骨脂相應(yīng)成分質(zhì)量分數(shù)－炮制品相應(yīng)成分質(zhì)量分數(shù))/補骨脂相應(yīng)成分質(zhì)量分數(shù)

采用綜合加權(quán)評分法評價指標成分的變化。根據(jù)各成分在補骨脂中的含量高低和毒性強弱[13]，指定補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂甲素、補骨脂乙素和補骨脂酚的權(quán)重系數(shù)分別為10%、10%、20%、12%、18%、30%，計算綜合加權(quán)評分（）。

＝1×10%＋2×10%＋3×20%＋4×12%＋5×18%＋6×30%

123456分別為補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂甲素、補骨脂乙素和補骨脂酚的含量下降率

越高，補骨脂毒性成分降低越多，炮制品越優(yōu)，炮制工藝越好。實驗結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

由表3直觀分析可知，影響炮制工藝的主次順序為A＞B＞C，表4方差分析結(jié)果表明醇濃度和醇浸時間對炮制工藝影響顯著，結(jié)合生產(chǎn)成本因素確定最優(yōu)工藝為A2B3C1。即醇濃度80%，醇浸時間24 h，蒸制時間4 h。因此，補骨脂最佳炮制工藝：按《中國藥典》鹽炙法制備鹽補骨脂，取鹽補骨脂適量，加入5倍量80%藥用乙醇浸泡24 h，倒出藥用乙醇并用蒸餾水洗凈，加入5倍量蒸餾水，浸泡12 h，倒出蒸餾水并洗凈，置蒸鍋內(nèi)隔水蒸4 h，取出晾干。

表3 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表4 方差分析

2.2.3 工藝驗證 為了進一步驗證上述炮制工藝的可行性和穩(wěn)定性，平行制備3份炮制品。按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，照“2.1.1”項下色譜條件進樣測定炮制品中指標成分的含量，測定結(jié)果見表5。與補骨脂比較，炮制品中補骨脂素和異補骨脂素的含量分別上升15.45%、5.61%，新補骨脂異黃酮、補骨脂甲素、補骨脂乙素和補骨脂酚的含量分別下降72.23%、84.38%、74.75%、61.87%，且平行實驗獲得的炮制品中指標成分含量基本沒有差異，表明該炮制工藝有很好的重復(fù)性。

表5 驗證結(jié)果

2.3 肝毒性評價

2.3.1 供試藥物的制備 取補骨脂炮制品40 g，加8倍量水，浸泡0.5 h，提取2次，每次1.5 h，合并2次提取液后濃縮至100 mL，即得補骨脂炮制品水提液[14]。同法制備補骨脂水提液。

2.3.2 分組與給藥 小鼠按體質(zhì)量隨機分為7組，每組7只。對照組ig給予等體積蒸餾水，補骨脂炮制品低（1.5 g/kg）、中（3 g/kg）、高（6 g/kg）劑量組，補骨脂低（1.5 g/kg）、中（3 g/kg）、高（6 g/kg）劑量組，每日給藥1次，連續(xù)ig給藥7 d。

2.3.3 血清生化檢測 小鼠ig給藥結(jié)束后，禁食不禁水過夜，摘眼球取血，室溫下3500 r/min離心10 min，分離血清。按照試劑盒說明書測定ALT、AST，結(jié)果見表6。

2.3.4 肝臟系數(shù)及組織病理學(xué)檢查 剖腹摘取小鼠肝臟，稱質(zhì)量，計算肝臟系數(shù)（肝臟系數(shù)=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量），結(jié)果見表6。切取小鼠一葉肝臟于4%多聚甲醛溶液中固定，固定液為組織體積的5～10倍，固定48 h后，石蠟切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察組織病變（圖2）。

與對照組相比，補骨脂高、中劑量組ALT明顯升高（＜0.01，0.001），補骨脂高、中、低劑量組AST顯著升高（＜0.001），補骨脂高、中劑量組肝系數(shù)明顯升高（＜0.01，0.001），補骨脂炮制品組無顯著差異。與對照組相比，補骨脂高、中劑量組肝臟明顯炎性細胞浸潤，充血；炮制品組肝臟未見明顯異常改變。結(jié)果表明補骨脂炮制品的肝毒性顯著降低。

表6 各組小鼠肝臟系數(shù)和血清ALT、AST測定結(jié)果()

與對照組比較，**＜0.01***＜0.001

**< 0.01***< 0.001 vs control group

圖2 小鼠肝組織病理形態(tài)（HE，×200）

綜上，基于雷公法結(jié)合鹽炙法對補骨脂進行炮制，可明顯降低毒性指標成分的含量，且通過小鼠給藥補骨脂肝毒性實驗驗證，說明該法可達到炮制減毒目的。

3 討論

本實驗首次將鹽炙法和雷公法結(jié)合對補骨脂進行炮制減毒，建立了同時測定補骨脂中6種指標成分含量測定的HPLC。結(jié)果表明該炮制方法可顯著降低毒性成分的含量。小鼠肝毒性結(jié)果顯示該炮制方法所得補骨脂與生品給藥相同劑量及時間，補骨脂生品表現(xiàn)出明顯的肝損傷，而補骨脂炮制品未見肝損傷，表明該炮制方法能夠有效降低生補骨脂肝毒性[14]。

補骨脂炮制品中補骨脂素和異補骨脂素的含量相比補骨脂生品有所提高，可能在炮制過程中由補骨脂苷和異補骨脂苷轉(zhuǎn)化而來[15]，使補骨脂素和異補骨脂素的含量保持在有效劑量范圍內(nèi)，而其余毒性指標成分大大降低，保障了補骨脂用藥的安全性及有效性。炮制品中新補骨脂異黃酮、補骨脂甲素和補骨脂乙素的含量均顯著下降，可能是由于其都屬于二氫黃酮類，在高溫下不穩(wěn)定，A環(huán)開環(huán)發(fā)生降解所致，且在炮制過程中，加入高濃度的藥用乙醇長時間浸泡，溶于乙醇也使其含量降低。補骨脂酚是一種異戊二烯基酚萜類化合物，是補骨脂揮發(fā)油的主要成分，易氧化，且在炮制過程中受熱揮發(fā)，是其含量下降的主要原因。

補骨脂生品經(jīng)過鹽炙法炮制再雷公法炮制，最終得到補骨脂炮制品，實驗測得中間炮制品鹽補骨脂中指標成分補骨脂素、異補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂甲素、補骨脂乙素、補骨脂酚的含量分別為7.824、10.030、3.078、1.502、2.772、47.208 mg/g，與生品比較，毒效成分補骨脂素和異補骨脂素的含量分別上升117.03%、127.70%，說明鹽炙法能夠增強補骨脂溫腎助陽、補腎納氣的功效[16]；毒性成分新補骨脂異黃酮、補骨脂甲素、補骨脂乙素、補骨脂酚的含量分別下降29.53%、52.14%、38.17%、29.18%，說明鹽炙法具有炮制減毒的作用[17]。但研究已證明鹽補骨脂的毒性仍然存在，所以本實驗對鹽補骨脂進行雷公法再炮制，由結(jié)果可知，與生品相比，最終炮制品中補骨脂素和異補骨脂素的含量略微上升，而新補骨脂異黃酮、補骨脂甲素、補骨脂乙素、補骨脂酚的含量大大降低，說明該炮制方法可保障補骨脂的的有效性及安全性。

本實驗通過合理炮制選擇性減少毒性指標成分的含量，在一定程度上降低了補骨脂的毒性，由于中藥成分的復(fù)雜性，實驗僅以6個毒性指標成分評價炮制減毒工藝存在一定的局限性，有關(guān)補骨脂更多毒性物質(zhì)基礎(chǔ)還有待進一步深入研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Processing ofbased on combination of Leigong method and salt processed method and its hepatotoxicity evaluation

HONG Li1, 2, WANG Zhe2, TANG Xiao-han2, YUAN Hai-long1, 2

1.Air Force Clinical College,Anhui Medical University, Hefei 230032, China 2.Department of Pharmacy, Air Force Medical Center, Beijing 100142, China

Buguzhi (, PF) was processed based on combination of Leigong method and salt processed method, and the hepatotoxicity of PF before and after processing were evaluated.An HPLC method was established for simultaneous determination of 6 index components (psoralen, isopsoralen, neobavaisoflavone, bavachin, isobavachalcone and bakuchiol) in PF.With alcohol concentration, alcohol soaking time and steaming time as the investigation factors, the processing technology was optimized by orthogonal test with the comprehensive weighted score of the decrease rate of index components content as the index, and the hepatotoxicity of PF before and after processing was evaluated by hepatotoxicity test in mice.The optimal processing technology was as follows: the salt-processed PF was prepared according to the Chinese Pharmacopoeia, and then was soaked in 5 times the amounts of 80% medicinal ethanol for 24 h.After removing the medicinal ethanol and washing with distilled water, the PF was further soaked in 5 times the amounts of distilled water for 12 h.After removing the distilled water and washing with fresh distilled water, the PF was steamed in a steamer for 4 h and then air-dried.The content of toxic components in the processed PF were significantly reduced, and hepatotoxicity in mice was significantly reduced.The processing method can significantly reduce the hepatotoxicity of PF, and provide reference for rational clinical processing of PF.

; Leigong method; salt processed method; processing attenuation; orthogonal test; hepatotoxicity; psoralen; isopsoralen; neobavaisoflavone; bavachin; isobavachalcone; bakuchiol

R286

A

0253 - 2670(2021)22 - 6983 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.22.025

2021-05-06

軍隊后勤目錄重點課題（BKJ15J005）

洪 麗，女，碩士研究生，研究方向為中藥學(xué)。E-mail: 2385517652@qq.com

通信作者：袁海龍，男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥新型給藥系統(tǒng)。Tel: (010)66928505 E-mail: yhlpharm@126.com

[責任編輯 時圣明]