呂芳，張園，趙春暉，李英，高峰，賈晨，宗超，楊靜

(北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(北京)，北京 100176)

孔雀石綠(Malachite green,MG)是一種三苯甲烷類染料，對魚類的水霉病治療效果十分顯著，因而備受養(yǎng)殖戶推崇。眾多研究證實孔雀石綠具有高毒性、高殘留、致突變、致畸及致癌等副作用[1-3]，極易在生物體內(nèi)蓄積，因此中國在2002年明令禁止孔雀石綠應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中[4-6]。但因其治療效果好，價格低廉，仍存在非法使用的現(xiàn)象。憑借山區(qū)優(yōu)越的天然條件，北京房山區(qū)、懷柔區(qū)虹鱒(Oncorhynchusmykiss)類冷水魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展壯大。為了增強北京地區(qū)虹鱒的市場競爭力，有效保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全，需嚴防禁用藥物孔雀石綠的非法使用，推進漁業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。為避免孔雀石綠不安全因素對大眾產(chǎn)生恐慌，消除“談綠色變”的顧慮，加強對孔雀石綠的監(jiān)管控制十分重要，而對水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測成為質(zhì)量控制的關(guān)鍵。

目前針對水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠(Leucomalachite green,LMG)殘留量的檢測方法主要有薄層色譜法、分光光度法、氣質(zhì)聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等[6-10]。其中液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法高效、靈敏、準確，成為定量檢測藥物殘留的有效手段，而檢測結(jié)果準確性的探討特別是不確定度尤為重要，直接關(guān)系消費者“舌尖上的安全”。

余孔捷等[11]、晁偉杰等[12]、劉柱等[13]及涂凡等[14]分析研究了液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測孔雀石綠的不確定度來源和影響，而采用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定北京特色冷水魚虹鱒中孔雀石綠及其代謝物殘留量的不確定度研究較少。本研究依據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》、《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》以及相關(guān)文獻研究[15-17]要求，分析在本實驗室中利用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定虹鱒中孔雀石綠殘留量過程不確定度的主要來源和影響程度，為實驗室質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。

1 試驗與方法

1.1 儀器與藥品試劑

Waters XEVO TQ-S超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國沃特世公司)；賽多利斯ME235P電子天平(德國賽多利斯公司)； 200 μL、5 mL移液槍(德國艾本德公司)。

孔雀石綠草酸鹽標準品(MG，純度≥95.8%)，購于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；隱色孔雀石綠標準品(LMG，純度≥99.0%)，購于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；孔雀石綠內(nèi)標標準品(MG-D5，純度≥99.6%)，購于德國Witega GmbH公司；隱色孔雀石綠內(nèi)標標準品(LMG-D6，純度≥99.8%)，購于德國Witega GmbH公司；甲酸：色譜純，購于美國Thermo Fisher Scientific公司；乙腈(色譜純)，購于美國Thermo Fisher Scientific公司；超純水，購于屈臣氏。

1.2 主要溶液配制

孔雀石綠混合標準儲備液的配制：準確稱取孔雀石綠草酸鹽標準品0.013 98 g(精確至0.000 01g)，隱色孔雀石綠標準品0.010 00 g(精確至0.000 01 g)，用乙腈溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，配制成100 mg/L混合標準儲備液，-18 ℃冰箱中冷藏，保存6個月。

孔雀石綠混合標準工作液的配制：吸取孔雀石綠混合標準儲備液，用乙腈逐級稀釋為100 ng/mL溶液，4 ℃冷藏，保存1個月。

1.3 虹鱒中孔雀石綠的提取與測定

虹鱒按照GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》[10]進行樣品處理，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定MG、LMG的殘留量?？瞻谆|(zhì)不加內(nèi)標按樣品前處理方法處理，配制一系列標準溶液，進行超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18 1.7 μm， 2.1×50 mm Column；流動相：A相為乙腈(75%)，B相為0.1%甲酸水溶液(25%)；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

離子化模式：大氣壓電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；離子源溫度：150 ℃；毛細管電壓：4.0 kV；脫溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/hr；碰撞氣流速：0.15 mL/min；錐孔反吹氣流量：150 L/hr；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測掃描(MRM)，定性離子及定量離子對、錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜條件參數(shù)見表1。

表1 孔雀石綠和隱色孔雀石綠質(zhì)譜條件參數(shù)Tab.1 Mass spectrometry parameters for malachite green and leucomalachite green

2 測量不確定度評定

2.1 數(shù)學(xué)模型

虹鱒中MG和LMG殘留量計算的數(shù)學(xué)模型見式(1)：

式(1)

2.2 不確定度的來源測量及計算

本研究中的測量不確定度主要來源于：外標標準溶液配制引入的不確定度，內(nèi)標標準物質(zhì)加入量引入的不確定度，樣品稱量引入的不確定度，定容體積引入的不確定度，提取回收率引入的不確定度及液質(zhì)聯(lián)用儀校準引入的不確定度。待測組分殘留量測量不確定度的來源分析見圖1。

圖1 待測組分殘留量測量不確定度的來源分析圖Fig.1 Source analysis chart of uncertainty for component residues detection

標準不確定度的計算見式(2)：

式(2)

相對標準不確定度的計算見式(3)：

式(3)

3 結(jié)果與分析

3.1 外標標準溶液配制引入的不確定度

3.1.1 外標標準物質(zhì)純度引入的不確定度

由標準物質(zhì)證書可知，MG的純度為95.8%，擴展不確定度為2.0%，LMG的純度為99.0%，擴展不確定度為0.5%，由于標準物質(zhì)給出的擴展不確定度屬正態(tài)分布，為B類評定，置信概率p=95%，包含因子k=2，標準不確定度和相對標準不確定度分別為：MG標準不確定度uP1和相對標準不確定度u1rel分別為1.0和0.010 4；LMG標準不確定度up2和相對標準不確定度u2rel分別為0.25和0.002 5。

3.1.2 外標標準物質(zhì)稱量引入的不確定度

稱取MG標準品質(zhì)量為13.98 mg，LMG標準品質(zhì)量為10.00 mg，所用稱量天平的分度值為0.1 mg，擴展不確定度為0.05 mg，包含因子為k=2，稱量標準不確定度umx為0.025 mg，MG相對標準不確定度umlrel和LMG相對標準不確定度um2rel分別為0.001 8和0.002 5。

3.1.3 外標標準溶液定容引入的不確定度

按檢定證書給出100 mL容量瓶(A級)容量允差為±0.10 mL，包含因子為k=2，不確定度u3為0.05 mL，相對標準不確定度u3rel為0.000 5。

容量瓶在不同的溫度條件下由于體積改變會引起一定的變化，但該變化很小，故其不確定度可忽略。

3.1.4 外標標準溶液稀釋引入的不確定度

用1 mL移液管、10 mL移液管和100 mL容量瓶將外標標準儲備液逐級稀釋，期間使用1次1 mL移液管、1次10 mL移液管和2次100 mL容量瓶，稀釋過程中引入的不確定度如下：

1 mL移液管(B級)檢定證書給出容量允差為±0. 015 mL，包含因子為k=2，移取1 mL引入的標準不確定度u4為0.007 5 mL，相對標準不確定度u4rel為0.007 5。

100 mL容量瓶(A級)檢定證書給出容量允差為±0.10 mL，包含因子為k=2，其引入的標準不確定度u5為0.05 mL，相對標準不確定度u5rel為0.000 5。

10 mL移液管(B級)檢定證書給出容量允差為±0.05 mL，包含因子為k=2，移取10 mL引入的標準不確定度u6為0.025 mL，相對標準不確定度u6rel為0.002 5。

100 mL容量瓶(A級)檢定證書給出容量允差為±0.10 mL，包含因子為k=2，其引入的標準不確定度u7為0.05 mL，相對標準不確定度u7rel為0.000 5：

因此，在標準溶液配制過程中MG的合成相對標準不確定度為：

LMG的合成相對標準不確定度為：

3.2 內(nèi)標標準溶液加入引入的不確定度

3.2.1 內(nèi)標標準物質(zhì)純度引入的不確定度

本研究中MG-D5的純度為99.7%，擴展不確定度為0.3%，LMG-D6的純度為99.8%，擴展不確定度為0.2%。標準物質(zhì)的擴展不確定度屬正態(tài)分布，按B類進行評定，置信概率p=95%，包含因子k=2，則MG-D5標準不確定度up1*和相對標準不確定度u1rel*分別為0.15和0.001 5；LMG-D6標準不確定度up2*和相對標準不確定度u2rel*分別為0.10和0.001 0。

3.2.2 內(nèi)標標準物質(zhì)稱量引入的不確定度

稱取MG-D5標準品質(zhì)量為10.00 mg，LMG-D6標準品質(zhì)量為10.00 mg，所用稱量天平按檢定證書給出的分度值為0.1 mg，擴展不確定度為0.05 mg，包含因子為k=2，稱量標準不確定度um*為0.025 mg。

MG-D5相對標準不確定度um1rel*和LMG-D6相對標準不確定度um2rel*分別為0.002 5和0.002 5。

3.2.3 內(nèi)標標準溶液定容引入的不確定度

100 mL容量瓶(A級)檢定證書給出容量允差為±0.10 mL，包含因子為k=2，標準不確定度u3*為0.05 mL，相對標準不確定度u3rel*為0.000 5。

由于容量瓶在不同的溫度條件下體積會引起一定的變化，本實驗均在25 ℃環(huán)境下進行，則由溫度產(chǎn)生的標準不確定度可忽略。

3.2.4 內(nèi)標標準溶液稀釋引入的不確定度

內(nèi)標標準溶液稀釋步驟同外標標準溶液稀釋過程。

1 mL移液管(B級)檢定證書給出容量允差為±0.015 mL，包含因子為k=2，移取1 mL引入的標準不確定度u4*為0.007 5 mL，相對標準不確定度u4rel*為0.007 5。

100 mL容量瓶(A級)檢定證書給出容量允差為±0.10 mL，包含因子為k=2，其引入的標準不確定度u5*為0.05 mL，相對標準不確定度u5rel*為0.000 5。

10 mL移液管(B級)檢定證書給出容量允差為±0.05 mL，包含因子為k=2，移取10 mL引入的標準不確定度u6*為0.025 mL，相對標準不確定度u6rel*為0.002 5。

100 mL容量瓶 (A級)檢定證書給出容量允差為±0.10 mL，包含因子為k=2，其引入的標準不確定度u7*為0.05 mL，相對標準不確定度u7rel*為0.000 5。

3.2.5 內(nèi)標標準物質(zhì)加入體積引入的不確定度

200 μL移液器檢定證書給出其容量允差為±0.003 mL，包含因子為k=2，移取200 μL內(nèi)標引入的標準不確定度u(v*)為0.001 5 mL，相對標準不確定度urel(v*)為0.007 5。

因此，MG-D5加入的合成相對標準不確定度為：

LMG-D6加入的合成相對標準不確定度為：

3.3 樣品稱量引入的不確定度

利用精度為0.01 g的天平稱取5.00 g，其最大容許誤差為±0.05 g，包含因子為k=2，標準不確定度u(m)為0.025 g，相對標準不確定度urel(m)為0.005。

3.4 樣品液定容引入的不確定度

0.5～5.0 mL移液器檢定證書檢定給出容量允差為±0.01 mL(k=2)，其標準不確定度u(v)為0.005 mL。

加入定容液的量為2 mL，則其相對標準不確定度urel(v)為0.002 5。

3.5 樣品提取回收率引入的不確定度

樣品前處理包括溶劑提取、凈化等步驟，此過程中引入的不確定度可由加標樣品提取回收率引入的不確定度進行評定。

在虹鱒樣品中添加2.5 μg/kg的孔雀石綠混合標準工作液，做6個平行樣品測定MG、LMG的回收率，加標回收率見表2。

表2 加標回收率Tab.2 The results of standard recovery rates

MG標準不確定度u(1rec)和相對標準不確定度urel(1rec)分別為1.94%和0.019 7；LMG標準不確定度u(2rec)和相對標準不確定度urel(2rec)分別為1.25%和0.011 9。

3.6 液質(zhì)聯(lián)用儀校準引入的不確定度

根據(jù)北京市計量檢測科學(xué)研究院出具的儀器校準證書：超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的不確定度u=2%，包含因子k=2，其相對標準不確定度urel(fQ)為0.01。

3.7 標準不確定度的合成和擴展

3.7.1 孔雀石綠標準不確定度的合成和擴展

孔雀石綠的相對標準不確定度分量見表3。

表3 孔雀石綠的相對標準不確定度分量匯總表Tab.3 Summary of relative standard uncertainty components for malachite green

將上述所得數(shù)據(jù)代入下面公式得到孔雀石綠的相對合成標準不確定度為：

標準不確定度為：

u(1X)=0.079 6 μg/kg=urel(1X)×
2.5 μg/kg×98.63%

擴展標準不確定度為(k=2)：

U1=k×u(1X)=0.159 2 μg/kg

3.7.2 隱色孔雀石綠標準不確定度的合成和擴展

隱色孔雀石綠的相對標準不確定度分量見表4。

表4 隱色孔雀石綠的相對標準不確定度分量匯總表Tab.4 Summary of relative standard uncertainty components for leucomalachite green

將上述所得數(shù)據(jù)代入下面公式得到隱色孔雀石綠的相對合成標準不確定度為：

標準不確定度為：

u(2X)=urel(2X)×2.5 μg/kg×105.69%=
0.057 6 μg/kg

擴展標準不確定度為(k=2)：

U2=k×u(2X)=0.115 2 μg/kg

3.8 水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠殘留量的不確定度報告

在95%置信區(qū)間內(nèi)，取包含因子k=2，孔雀石綠殘留量的不確定度報告為：

X1=(2.5×98.63%±0.159 2)μg/kg=
(2.465 8±0.159 2)μg/kg (k=2)

隱色孔雀石綠殘留量的不確定度報告為：

X2=(2.5×105.69%±0.115 2)μg/kg=
(2.642 2±0.115 2)μg/kg (k=2)

4 結(jié)論

分析上述表3和表4不確定度分量可知，本研究不確定度占較大比例的是由樣品提取回收率引入。為了減少檢測方法的測量不確定度，應(yīng)在以后的實驗過程中盡量規(guī)范實驗人員的操作，減小溶劑提取、凈化前處理過程以及稱量、稀釋、定容等過程產(chǎn)生的不確定度，且使用誤差比較小的精密儀器，確保檢測結(jié)果的準確性。