董錚，劉婷婷，徐新月，周文飛

(山東省青島市即墨區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 青島 266200)

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，截止2019年底，中國(guó)水產(chǎn)品總產(chǎn)量達(dá)到6 450萬(wàn)t，占全球總量的61.7%，是全球最大的水產(chǎn)養(yǎng)殖國(guó)之一[1]。2019年水產(chǎn)品總量大幅度增長(zhǎng)，其中大宗淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量為3 013.74 萬(wàn)t[2]。隨著水產(chǎn)品市場(chǎng)和消費(fèi)群體的逐步擴(kuò)大，水產(chǎn)品貿(mào)易和消費(fèi)量也逐年攀升，水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的高值化利用問(wèn)題也得到越來(lái)越多人的關(guān)注。

藍(lán)圓鲹(Decapterusmaruadsi)，又名巴浪魚，屬鱸形目鲹科圓鲹屬，主要生活在中國(guó)的東海、南海附近海域，其不僅富含豐富的氨基酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值堪比“西洋參”，而且價(jià)格低廉[3]。近年來(lái)，隨著中國(guó)漁業(yè)迅猛發(fā)展，藍(lán)圓鲹的產(chǎn)量與日俱增，平均年產(chǎn)量達(dá)13萬(wàn)t以上，約占海洋捕撈量的2/3[4]。藍(lán)圓鲹作為中國(guó)水產(chǎn)中的低值魚類，其加工一直較為落后。伴隨著魚類加工企業(yè)生產(chǎn)規(guī)模以及產(chǎn)量的擴(kuò)大，占魚重50%～80%的魚肝臟、魚骨、小魚等魚類加工的副產(chǎn)物大量產(chǎn)生。這些副產(chǎn)物或被丟棄，或被制成了咸干制品及飼料魚粉使用，很少會(huì)被深加工，既造成了資源的浪費(fèi)又對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了一定的破壞[5-6]。隨著藍(lán)圓鲹產(chǎn)量及出口量的增加，藍(lán)圓鲹加工過(guò)程中產(chǎn)生的大量副產(chǎn)品的綜合利用顯得日益迫切。

隨著酶工程技術(shù)的不斷發(fā)展，酶解技術(shù)被應(yīng)用于漁業(yè)加工開發(fā)等方面，這為食品工業(yè)和魚副產(chǎn)品的發(fā)展提供了廣闊的開發(fā)及應(yīng)用前景。酶解技術(shù)是采用蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解后，使蛋白質(zhì)的內(nèi)部肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并進(jìn)一步修飾和提升了產(chǎn)物的功能特性、感官性質(zhì)和物化性質(zhì)，使得其更易被機(jī)體吸收利用的一種技術(shù)，因此被廣泛應(yīng)用于不同的領(lǐng)域[6-7]。利用酶解技術(shù)制備生物活性肽，不僅可以充分利用優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源，還可帶來(lái)明顯的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益[7]。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，水產(chǎn)蛋白源生物活性肽在降血壓、降血脂、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等方面具有較為明顯的生理活性作用[8-9]。相關(guān)科研人員已從眾多海洋生物中分離鑒定出抗氧化活性肽，比如：魷魚(TodarodesPacificus)、牡蠣(Ostreagigasthunberg)、金槍魚(Thunnini)等[10-11]。盧素珍[12]采用二步酶解法制備出了魚鱗明膠抗氧化肽，并進(jìn)一步篩選出了活動(dòng)較強(qiáng)的抗氧化肽；范鴻冰等[13]通過(guò)酶解螯合制得鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)魚骨膠原多肽螯合鈣；美國(guó)學(xué)者[14-15]分別以沙丁魚(Sardine)、鯖(Mackerel)魚為原料水解制得抗氧化肽,其安全無(wú)毒，分子量小、易被消化吸收、易溶解，在食品行業(yè)擁有廣闊的發(fā)展前景。

本研究以藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物為原料，對(duì)堿性蛋白酶酶促水解制備抗氧化肽的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)酶解液中高抗氧化活性的肽段進(jìn)行分離純化，為開發(fā)藍(lán)圓鲹抗氧化肽功能性產(chǎn)品提供理論依據(jù)，并為進(jìn)一步探究和開發(fā)藍(lán)圓鲹這一低值魚的附加價(jià)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

藍(lán)圓鲹：購(gòu)于福建龍巖當(dāng)?shù)氐暮ｔ~市場(chǎng)，捕獲于福建莆田海峽；堿性蛋白酶：上海生命科學(xué)公司；牛血清白蛋白(BSA)：生化純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：上海浩然生物技術(shù)有限公司；葡聚糖凝膠Sephadex G-25: 上海浩然生物技術(shù)有限公司；Sephacryl S-100 HR丙烯葡聚糖凝膠色譜柱：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)中其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)(UV1000 型)，天美(中國(guó))科學(xué)儀器公司；超濾裝置，Cole-Parmer中國(guó)公司；AKTA Pure 25蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(AKTA avant 25型)，GE Healthcare Life Science公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗氧化肽制備工藝流程

藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物→絞碎、脫脂→烘干、粉碎→脫脂魚粉→確定魚粉總蛋白含量→酶促水解(單因素試驗(yàn)探究、響應(yīng)面方法優(yōu)化)→確定優(yōu)化后的最佳工藝條件。

1.2.2 酶促水解

稱取適量的脫脂魚粉，選擇pH 8.5的50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液作為反應(yīng)體系，加入相應(yīng)比例的堿性蛋白酶于55 ℃的恒溫水浴中水解。水解一定時(shí)間后，置于90 ℃水浴高溫滅酶10 min，室溫下冷卻后，8 000 r/min 離心15 min，去除沉淀，收集上清液保存?zhèn)溆?，以便進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 水解條件的探究與優(yōu)化

(1)單因素探究試驗(yàn)

利用水解度和抗氧化活性這兩個(gè)指標(biāo)，首先通過(guò)單因素試驗(yàn)分別探究料液比、酶添加量和水解時(shí)間3個(gè)因素對(duì)藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物酶解效果的影響，如表1所示。

表1 單因素試驗(yàn)的因素水平表Tab.1 Factor level table of single factor experiment

(2)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)Box-Benhnken Design[16-17]的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，通過(guò)對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果的分析，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。應(yīng)用 Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)測(cè)定不同條件下制得水解液的水解度和DPPH自由基清除率，確定優(yōu)化后的最佳條件。

1.2.4 蛋白含量及TCA可溶性短肽含量測(cè)定

利用 Folin-Phenol 法[18]測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)的含量，根據(jù)蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋倍數(shù)計(jì)算蛋白及TCA 可溶性短肽含量。

1.2.5 水解度的測(cè)定

根據(jù)Pericin D等[19]的實(shí)驗(yàn)方法稍加修改，取0.5 mL水解液，加入0.5 mL 20%三氯乙酸溶液，混勻后在4 ℃下靜置20 min，然后在10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min，取0.5 mL上清液(按實(shí)際需要進(jìn)行稀釋)，用Folin-Phenol法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。同時(shí)用蒸餾水代替水解液重復(fù)上述步驟，得到的溶液作為測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)的空白溶液。

水解度DH(%)=(TCA可溶性
蛋白含量/水溶性總蛋白質(zhì)含量)× 100%

式(1)

1.2.6 抗氧化活性的測(cè)定

以水解液清除DPPH自由基能力來(lái)表示抗氧化能力。根據(jù)參考文獻(xiàn)略作修改[20-21]，測(cè)定方法如下：將酶解液稀釋至0.5 mg/mL，然后移取2 mL酶解液，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH(三組平行實(shí)驗(yàn))，置于暗處30 min后在517 nm下測(cè)定吸光度，記為Ai，用2 mL酶解液加2 mL無(wú)水乙醇調(diào)零。用蒸餾水代替酶解液重復(fù)以上步驟，測(cè)得吸光度記為Aj，用無(wú)水乙醇調(diào)零。DPPH清除率按以下公式求得：

DPPH自由基清除率(%)=(1-Ai/Aj)×100%

式(2)

1.2.7 抗氧化肽的分級(jí)分離純化

(1) 超濾分離純化抗氧化肽

利用最優(yōu)堿性蛋白酶酶解工藝酶解得到藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物的水解液，經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜初濾，除去不溶性雜質(zhì)，再利用超濾裝置對(duì)多肽液進(jìn)行分離、濃縮。采用不同截留分子量(10.0 kDa、5.0 kDa和3.0 kDa)的超濾膜對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白酶解液分步分離，得到4組分子量不同的組分，選擇抗氧化活性最強(qiáng)的組分進(jìn)行下一步凝膠層析分離純化。

(2) Sephadex G-25凝膠色譜層析分離純化抗氧化肽

采用Sephadex G-25作為凝膠填料，將其進(jìn)行預(yù)處理后裝于規(guī)格為16 mm×400 mm的玻璃層析柱中，并將上步所得的抗氧化活性最高的組分配制成濃度50 mg/mL的溶液，在凝膠層析柱最適條件下進(jìn)行洗脫，于280 nm處檢測(cè)并收集各洗脫峰對(duì)應(yīng)的洗脫溶液，選擇抗氧化活性最強(qiáng)的組分進(jìn)行分子量的測(cè)定。

(3)凝膠滲透色譜(GPC)測(cè)定抗氧化肽分子量

選用GPC凝膠色譜柱對(duì)凝膠過(guò)濾分離得到的DPPH自由基清除率最高的組分進(jìn)行分子量的測(cè)定。將上步所得組分配制成濃度50 mg/mL的溶液，于280 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)洗脫峰，獲得樣品的洗脫體積，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品分子量的大小。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)平行，最終數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。用Excel軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖，用 Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析和繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 響應(yīng)面優(yōu)化工藝條件

綜合前期單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比、酶添加量、酶解時(shí)間為考察變量，中心點(diǎn)分別為1∶10、8 U/mg、2.5 h，變化步長(zhǎng)分別為5.0、2.0及0.5，以Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)，試驗(yàn)次數(shù)為17，其中4個(gè)為中心點(diǎn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2、表3。藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物酶促水解液的水解度在19.56%～38.00%，DPPH自由基清除率在20.38%～41.89%，而且不同試驗(yàn)設(shè)計(jì)組之間的差異較明顯。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Box-Behnken Design(BBD)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行方案設(shè)計(jì)。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平表Tab.2 Factor level table of response surface method n=3

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)結(jié)果Tab.3 The experimental design and corresponding results of response surface method n=3

2.1.1 以DPPH自由基清除能力為目標(biāo)的響應(yīng)面結(jié)果分析

本試驗(yàn)研究利用Design-Export 8.0.6軟件對(duì)表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，最終得到的回歸分析結(jié)果如下表4中所示。

表4 以 DPPH 清除能力為目標(biāo)的回歸分析結(jié)果Tab.4 Regression analysis results aimed at DPPH scavenging activity

在回歸模型中，概率值P越小，說(shuō)明相對(duì)應(yīng)的因素其顯著性越高[22]。從表4的回歸模型方差分析結(jié)果中可知，本模型的P值小于0.000 1，表示該回歸模型顯著性較好，在試驗(yàn)研究范圍內(nèi)擬合程度較高。復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.988 1，表明DPPH自由基清除率的實(shí)際測(cè)定值與模型預(yù)測(cè)值擬合較好；校正決定系數(shù)Adj-R2=0.972 9，表明DPPH自由基清除率的97.29% 的變化可以用該模型進(jìn)行解釋。一般而言，變化系數(shù)CV值越小，說(shuō)明試驗(yàn)的精確度越高，本模型中CV值為3.31，說(shuō)明該模型的精確度較好。綜上所述，該模型可以有效地用DPPH自由基清除率為目標(biāo)進(jìn)行堿性蛋白酶酶解工藝的優(yōu)化。

2.1.2 以水解度為目標(biāo)的響應(yīng)面結(jié)果分析

本試驗(yàn)研究利用Design-Export 8.0.6軟件對(duì)表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，最終得到的回歸分析結(jié)果如下表5中所示。

表5 以水解度為目標(biāo)的回歸分析結(jié)果Tab.5 Regression analysis results aimed at the degree of hydrolysis

從表5的回歸模型方差分析結(jié)果中可知，本模型的P值為0.010 7(<0.05)，表示該回歸模型顯著，在試驗(yàn)研究范圍內(nèi)具有一定的擬合程度。復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.894 1，說(shuō)明水解度的實(shí)際測(cè)定值與模型預(yù)測(cè)值擬合較好；校正決定系數(shù)Adj-R2=0.757 9，表明水解度75.79%的變化可以用該模型進(jìn)行解釋。本模型中CV值為4.67，說(shuō)明該模型的精確度好。綜上所述，該模型基本可以用水解度為目標(biāo)進(jìn)行堿性蛋白酶酶解工藝的優(yōu)化。

2.1.3 堿性蛋白酶最佳酶解工藝條件的確定

根據(jù)回歸模型的分析，得到以DPPH自由基清除率為目標(biāo)的各個(gè)影響因素的回歸方程為：

Y1=41.558+5.305X1+2.270X2+0.190X3-0.265X1X2-2.498X1X3+0.075X2X3-7.389X12-4.889X22-4.434X32

式(3)

以水解度為目標(biāo)的各個(gè)影響因素的回歸方程為：

Y2=33.368 00+2.821 25X1-0.422 50X2+1.893 75X3+1.717 50X1X2+2.340 00X1X3-1.477 50X2X3-8.589 00X12-1.866 50X22+2.431 00X32

式(4)

式中X1表示料液比，X2表示酶添加量(U/mg)，X3表示水解時(shí)間(h)。

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的分析結(jié)果和多元二次回歸方程的分析，以DPPH自由基清除率為優(yōu)化指標(biāo)，得到的堿性蛋白酶最佳酶解工藝條件如下：料液比為1∶11.6、酶添加量為9.4 U/mg、水解時(shí)間為2.9 h，將此條件代入預(yù)測(cè)模型，得到在該條件下 DPPH自由基清除率預(yù)測(cè)值為39.70%，水解度預(yù)測(cè)值為37.21%。

為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的可信度，在料液比為1∶11.6、酶添加量為9.4 U/mg、水解時(shí)間為2.9 h的條件下，設(shè)置三組平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，具體結(jié)果如表6所示。實(shí)際測(cè)得的DPPH自由基清除率為40.23%，水解度為36.04%，在模型給出的范圍：DPPH自由基清除率38.32%～41.09%，水解度33.66%～40.75%之內(nèi)，證明該模型的預(yù)測(cè)分析可行，可用于最佳酶解條件的確定。

表6 最佳酶解工藝條件驗(yàn)證結(jié)果Tab.6 Verification results of optimal enzymatic hydrolysis process conditions

2.2 抗氧化肽的分級(jí)分離純化

2.2.1 超濾分離純化抗氧化肽

由表7可知，經(jīng)超濾分離后，組分RSH-Ⅳ的DPPH自由基清除活性最強(qiáng)(62.82±0.36)%，表明其抗氧化活性相對(duì)較好。同時(shí)其他組分也具有一定的抗氧化活性，但各組分的抗氧化活性有所不同，與分子量大小有一定關(guān)系，其中低分子量的肽段即組分RSH-Ⅳ的DPPH自由基清除活性均高于其他組分，說(shuō)明藍(lán)圓鲹蛋白酶解產(chǎn)物中抗氧化活性最強(qiáng)的是小分子肽。

表7 超濾分離的4種組分的抗氧化活性Tab.7 Antioxidant activity of 4 components separated by ultrafiltration n=3

2.2.2 凝膠層析分離純化抗氧化肽

由超濾實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，抗氧化活性最高的組分是經(jīng)3.0 kDa的超濾膜超濾分離得到的組分RSH-Ⅳ，因此選用Sephadex G-25葡聚糖凝膠層析該組分進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。綜合考慮柱體積、柱壓等相關(guān)因素[23]，確定本實(shí)驗(yàn)的樣品濃度控制在50 mg/mL，上樣量為1.0 mL。分離結(jié)果如圖1所示，主要收集到A、B、C和D 4個(gè)組分，分別測(cè)定各組分的DPPH自由基清除活性，結(jié)果如表8所示。

圖1 超濾組分RSH-Ⅳ的Sephadex G-25凝膠柱層析分離Fig.1 Sephadex G-25 gel column chromatography separation of RSH-IV

表8 凝膠層析A～D各組分DPPH自由基清除活性Tab.8 DPPH free radical scavenging activity of A, B, C and D components n=3

由表8可知，凝膠層析所得的A、B、C和D 4個(gè)組分均表現(xiàn)出不同程度的抗氧化活性，其中組分B的抗氧化活性最強(qiáng)約(51.61±0.23)%，說(shuō)明酶解產(chǎn)物多肽中可能含有某些與自由基反應(yīng)的電子供體，從而終止了自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[24]。而其他3個(gè)組分的DPPH自由基清除能力的強(qiáng)弱順序依次為A>C>D。因此，選擇組分B進(jìn)行分子量的測(cè)定。

圖2 Sephacryl S-100 HR洗脫曲線Fig.2 Elution curve of Sephacryl S-100 HR

2.2.3 GPC凝膠色譜測(cè)定抗氧化肽分子量

綜合考慮組分B的分子量范圍，采用低壓GPC凝膠色譜柱(Sephacryl S-100 HR)對(duì)組分B進(jìn)行分子量測(cè)定。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫體積在0～120 mL的范圍內(nèi)時(shí)，洗脫體積與分子量的自然對(duì)數(shù)呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系，如圖4所示。因此，標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=-0.079 5x+ 14.988，相關(guān)系數(shù)R2= 0.997 7。由圖3可以看出，組分B經(jīng)Sephacryl S-100 HR色譜柱洗脫后，洗脫體積約為105 mL，因此利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可知，組分B的平均分子量大小為765 Da。說(shuō)明藍(lán)圓鲹水解產(chǎn)物中分子量處于此分子量附近的多肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性。這與Park等[25]報(bào)道的分子量處于1 kDa以下的鱈魚骨蛋白組分的抗氧化活性較強(qiáng)的研究結(jié)果相似。

圖3 Sephacryl S-100 HR分子量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of molecular weight determination for Sephacryl S-100 HR

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)堿性蛋白酶酶促水解藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物制備抗氧化肽的酶解工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳工藝條件為：料液比為1∶11.6、酶添加量為9.4 U/mg，水解時(shí)間為2.9 h。在此條件下，通過(guò)分離純化試驗(yàn)，得到抗氧化活性最高的肽段，其DPPH自由基清除率高達(dá)51.61%，同時(shí)，測(cè)得其平均分子量為765 Da。由此表明，藍(lán)圓鲹蛋白多肽中抗氧化活性較高的組分為小分子肽段，分子量集中在1 kDa以下。

在本實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，后續(xù)還可以對(duì)藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物的蛋白水解液展開更深入的研究。一方面，可以采用RP-HPLC對(duì)凝膠層析所得的抗氧化活性較高的肽段進(jìn)行氨基酸序列分析，確定其氨基酸序列，進(jìn)一步探究抗氧化活性肽與氨基酸之間的關(guān)系；另一方面，還可以利用蛋白水解液制備鐵肽螯合物，為制備新型補(bǔ)鐵劑提供基礎(chǔ)理論研究。