徐志華，孟勇，楊洪生，劉崇萬(wàn)，耿雪冰，葛筱琴，朱曉華*

(1.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017；2.江蘇省漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210017)

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大，高密度集約化養(yǎng)殖程度提高[1]，魚類疾病頻繁發(fā)生，為防治疾病和促進(jìn)生長(zhǎng)[2]，相關(guān)從業(yè)人員經(jīng)常會(huì)使用磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等抗菌藥物，甚至硝基呋喃類、孔雀石綠類、氯霉素類、洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等違禁藥物[3-5]。在全球消費(fèi)的抗生素中，50%以上用于動(dòng)物，以治療或防止感染并促進(jìn)生長(zhǎng)[6]，2018年中國(guó)養(yǎng)殖使用的全部抗菌藥總量為29 774 t，動(dòng)物養(yǎng)殖每生產(chǎn)1 t動(dòng)物產(chǎn)品使用獸藥抗菌藥量為140 g[7]。按獸用抗菌藥類別計(jì)，目前使用量最大的為四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺及抑制劑類、大環(huán)內(nèi)酯類、酰胺醇類等。水產(chǎn)養(yǎng)殖中，投入的抗生素有20%～30%被魚類等水產(chǎn)品吸收[8-10]，通過(guò)走訪發(fā)現(xiàn)部分養(yǎng)殖戶濫用藥物和不遵守休藥期等現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，從而導(dǎo)致動(dòng)物性食品中藥物殘留問(wèn)題不斷增多，魚類作為人體的主要食物蛋白源，其體內(nèi)富集的有害物質(zhì)最終會(huì)通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，進(jìn)而危害人體健康[11]，給消費(fèi)者的食品安全帶來(lái)安全隱患。

目前國(guó)內(nèi)研究主要集中在水源地、養(yǎng)殖物及沉積物中抗生素殘留的監(jiān)測(cè)[12-15]，對(duì)某個(gè)養(yǎng)殖區(qū)水產(chǎn)品獸藥殘留全年監(jiān)測(cè)的少有報(bào)道。2019年，江蘇斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatu)主養(yǎng)區(qū)的池塘精養(yǎng)面積約66.67 km2，產(chǎn)量達(dá)到1 400 t[16]，本研究以江蘇斑點(diǎn)叉尾鮰為研究對(duì)象，選取5個(gè)典型的養(yǎng)殖區(qū)(養(yǎng)殖面積大于1.67 km2)，在一年內(nèi)分3次(3月、7月及10月)選取1～2個(gè)池塘抽取鮰樣品，跟蹤監(jiān)測(cè)6類37種藥物殘留，采用膳食暴露評(píng)估模型[17]對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰食用安全進(jìn)行健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，為評(píng)價(jià)養(yǎng)殖區(qū)其產(chǎn)品的食用安全健康風(fēng)險(xiǎn)，受污染程度提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

液質(zhì)聯(lián)用儀(QTRAP 4500，美國(guó)SCIEX公司；液相色譜 1290A，美國(guó)安捷倫)；勻漿機(jī)(T18，德國(guó)IKA公司)；離心機(jī)(AllegraTM，美國(guó)BECKMAN公司)；濃縮工作站(Turbo Vap 瑞典Biotage公司)；甲醇、乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；乙酸銨、甲酸、乙酸(色譜純，美國(guó)ROE公司)；乙二胺四乙酸二鈉(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為Millipore系統(tǒng)超純水；其他標(biāo)準(zhǔn)品及配制方法見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)Tab.1 Standard substances and internal standard

1.2 樣品采集、制備及前處理

1.2.1 樣品采集

選取5個(gè)示范基地(見表2)，根據(jù)苗種、成長(zhǎng)期、成魚期的生長(zhǎng)周期分3次(3月、7月和10月)抽取同一池塘產(chǎn)品，每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)根據(jù)池塘數(shù)采集具有代表性的樣品，具體抽樣信息見表2。

表2 抽樣地點(diǎn)及經(jīng)緯度Tab. 2 Sampling location and corresponding longitude and latitude

1.2.2 樣品制備

每個(gè)點(diǎn)位抽取斑點(diǎn)叉尾鮰3條，取可食部分，用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)打成勻漿，置于-20 ℃冰箱中冷凍貯存, 測(cè)定前將其室溫解凍以供前處理使用。

1.2.3 樣品前處理

大環(huán)內(nèi)酯類前處理方法參照GB 31660.1—2019[18]；氯霉素類前處理方法參照GB/T 20756—2006[19]；硝基呋喃代謝物類前處理方法參照農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告—1—2006[20]；孔雀石綠前處理方法參照GB/T 19857—2005[21]。

磺胺喹諾酮類前處理方法：稱取2.0 g樣品至50 mL離心管中，加入1.0 mg/L混合內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，漩渦混合30 s。加入10 mL 0.1%甲酸-乙腈(9∶1，V/V)和0.1 g乙二胺四乙酸二鈉，渦旋振蕩、5 000 r/min離心10 min，取上清液。殘?jiān)屑尤?0 mL 0.1%甲酸-乙腈，用玻璃棒搗碎組織，重復(fù)提取一次，合并提取液。提取液用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)? mL的0.1%甲酸-乙腈溶解，加入2 mL正己烷，渦旋振蕩、5 000 r/min離心10 min，然后移取下層溶液離心，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜后上機(jī)測(cè)定。

1.3 儀器工作條件

喹諾酮類：色譜分析柱Agilent Poroshell EC-C18(100.0 mm×2.1 mm，2.7 μm)；流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液(A)和0.1%甲酸乙腈溶液(B)；柱溫35 ℃；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫程序：0～1 min，96% A；1～2 min，96%～85 %A；2～9 min，85%～75%A；9～15 min，75%～45 %A；15～16 min，45%～97 %A；16～20 min，97%A。電噴霧正離子電離模式(ESI+)，sMRM-IDA-EPI檢測(cè)模式；離子化電壓5 500 V；離子源溫度500 ℃；氣簾氣0.21 MPa；霧化氣0.41 MPa；輔助加熱氣0.41 MPa。母離子、子離子、保留時(shí)間及去簇電壓和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見文獻(xiàn)[22]，方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度等參見文獻(xiàn)[23]。其余儀器工作參數(shù)條件參照2.2相對(duì)應(yīng)國(guó)標(biāo)。

1.4 膳食暴露評(píng)估方法

本研究膳食暴露評(píng)估采用日允許攝入量(acceptable daily intake，ADI)，通過(guò)食用水產(chǎn)品途徑估算該抗生素的每日攝入量(estimated daily intake，EDI)，并將EDI與ADI標(biāo)準(zhǔn)值比較(EDI /ADI)，以此評(píng)估殘留抗生素的膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)EDI/ADI值≤1時(shí)，認(rèn)為對(duì)人群膳食暴露評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)水平在可接受范圍內(nèi)；EDI/ADI值>1，則說(shuō)明存在不可接受的風(fēng)險(xiǎn)[17, 24-25]。EDI 可由式(1)計(jì)算得出：

式(1)

式中：C為水產(chǎn)品中某種抗生素殘留量，μg/kg；C0為每天的人均消費(fèi)量，kg；B為成年人平均體重，kg。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑點(diǎn)叉尾鮰體內(nèi)藥物殘留情況

在5個(gè)主要養(yǎng)殖區(qū)的鮰樣品中篩查了6類目標(biāo)物，分別為3種酰胺醇類、10種大環(huán)內(nèi)酯類、6種喹諾酮類、12種磺胺類和4種硝基呋喃代謝物類、2種孔雀石綠類(具體參數(shù)見1.1)。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部250號(hào)公告、2292號(hào)公告、GB 31650—2019，孔雀石綠類(孔雀石綠和隱色孔雀石綠)、硝基呋喃代謝物(呋喃它酮代謝物及呋喃妥因代謝物、呋喃西林代謝物及呋喃唑酮代謝物)、喹諾酮類(洛美沙星及培氟沙星、氧氟沙星及諾氟沙星)為停止使用的藥物，其余幾類目標(biāo)物最大殘留限量(maximum residue limit, MRL)和日允許攝入量見下表3，根據(jù)殘留量，以MRL來(lái)判斷該項(xiàng)目是否合格。

表3 水產(chǎn)品部分抗生素最大殘留限量(MRL)和日允許攝入量(ADI)Tab. 3 Maximum residue limits (MRLs) and acceptable daily intake (ADI) values of some antibiotics in aquatic products

結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個(gè)斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖區(qū)6類37種藥物最大殘留量總體合格率91.7%，硝基呋喃類代謝物、磺胺類及大環(huán)內(nèi)酯類均未檢出(小于檢出限，視為未檢出)。

酰胺醇類中氯霉素均未檢出；甲砜霉素檢出率8.33%，含量在ND～6.32 μg/kg，僅在CD組7月份檢出，其余組均未檢出，合格率100%，詳見表4；氟苯尼考含量為ND～269.5 μg/kg(詳見圖1)，根據(jù)表2，含量均在允許使用最大殘留限量以下，合格率100%。分析5個(gè)組別氟苯尼考使用規(guī)律，在7月份5個(gè)組別鮰體內(nèi)氟苯尼考均有檢出，個(gè)別組別3月、10月份也有檢出，檢出率54.2%。從2002年開始所有可被人類食用的動(dòng)物都禁止使用氯霉素，甲砜霉素、氟苯尼考作為氯霉素的衍生物，尤其作為安全高效殺菌劑藥物在國(guó)內(nèi)外畜牧和水產(chǎn)上迅速獲得廣泛應(yīng)用[26]，據(jù)王榮華等[27]近年來(lái)在預(yù)防和治療斑點(diǎn)叉尾鮰腸道敗血癥時(shí)采用內(nèi)服恩諾沙星和氟苯尼考的方法取得較好效果。結(jié)合養(yǎng)殖實(shí)際情況與查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，該病的流行具有明顯的季節(jié)性，每年的5～6月和9～10月是其流行季節(jié)[27-30]，因此本次監(jiān)測(cè)結(jié)果也印證了養(yǎng)殖戶使用了此類藥物，防治相關(guān)疾病。

表4 5個(gè)養(yǎng)殖區(qū)斑點(diǎn)叉尾鮰中6類藥物(酰胺醇類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、磺胺類、硝基呋喃代謝物類和孔雀石綠類)合格率與檢出率Tab. 4 Qualification rate and detection rate of six kinds of drugs (amide alcohols, macrolides, quinolones, sulfonamides, nitrofuran metabolites and malachite green) in Ictalurus punctatus from five aquaculture areas

圖1 5個(gè)養(yǎng)殖區(qū)斑點(diǎn)叉尾鮰中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留總量、氟苯尼考?xì)埩袅孔ⅲ篠Y1(3)表示養(yǎng)殖區(qū)SY1點(diǎn)位3月份，下同。Fig.1 Residues of enrofloxacin and ciprofloxacin and residues of florfenicol in Ictalurus punctatus from five aquaculture areasNote: SY1(3) means that the SY1 point in the breeding area is in March, the same below.

洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星及諾氟沙星4種停止使用藥物均未檢出，僅有恩諾沙星與環(huán)丙沙星被檢出，含量范圍在ND～948.0 μg/kg，其中恩諾沙星檢出率75.0%，環(huán)丙沙星檢出率25.0%，恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星僅在兩個(gè)檢測(cè)點(diǎn)SY1，CD2檢測(cè)出，且超過(guò)最大殘留限量100.0 μg/kg，分析C、D 兩點(diǎn)為3月份檢測(cè)出，在10月份最后一次未監(jiān)測(cè)到，不影響成魚上市。僅有SY1在10月份監(jiān)測(cè)中檢測(cè)超標(biāo)，含量為948.0 μg/kg，說(shuō)明養(yǎng)殖戶使用了相關(guān)藥物，該藥物對(duì)動(dòng)物感染性細(xì)菌疾病有良好的防治效果，廣泛應(yīng)用于水生動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療[31]。根據(jù)盤家永等[32]對(duì)恩諾沙星在斑點(diǎn)叉尾鮰中的降解規(guī)律研究，表明斑點(diǎn)叉尾鲴對(duì)恩諾沙星的個(gè)體代謝能力極其顯著，但是建議用藥后一般需經(jīng)過(guò)20 d 以上的休藥期才能上市，以確保食用安全性。

2.2 膳食暴露評(píng)估

本試驗(yàn)中，由于只有喹諾酮類中恩諾沙星和環(huán)丙沙星、酰胺醇類中甲砜霉素和氟苯尼考檢出，參照2.4計(jì)算公式，結(jié)合文獻(xiàn)資料，B選用江蘇成人體重為61.5 kg[33]，C0根據(jù)江蘇省統(tǒng)計(jì)局2019統(tǒng)計(jì)年鑒[34]，取值5.38×10-3kg/d。經(jīng)計(jì)算見表5，發(fā)現(xiàn)喹諾酮類EDI在0～8.29×10-2、EDI/ADI為0～1.34×10-2；甲砜霉素EDI為 0～5.35×10-4、EDI/ADI為0～1.07×10-4；氟苯尼考EDI 為0～3.54×10-2、EDI/ADI為0～1.18×10-2。3種抗生素EDI/ADI值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1，認(rèn)為對(duì)人群膳食暴露評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)水平在可接受范圍內(nèi)，說(shuō)明幾個(gè)養(yǎng)殖區(qū)養(yǎng)殖人員具有一定的科學(xué)用藥意識(shí)，風(fēng)險(xiǎn)控制在可接受水平。但是需要注意此次健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，是根據(jù)消費(fèi)者對(duì)食用魚肉量來(lái)評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)，但是日常生活中豐富的膳食結(jié)構(gòu)，消費(fèi)者在其他食物中也有可能攝入部分抗生素，如周偏偏等[35]研究發(fā)現(xiàn)某地雞蛋樣品中檢出6種四環(huán)素，雞肉樣品中檢出11種四環(huán)素?？股貧埩舨粌H對(duì)人體健康造成危險(xiǎn)，在養(yǎng)殖環(huán)境中暴露及其潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，也成為不可忽視的環(huán)境問(wèn)題[14]。因此，與其他污染物產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響仍然需要被重視。下一步需加強(qiáng)對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境污染的監(jiān)測(cè)如養(yǎng)殖水、底泥，建立區(qū)域監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)，從源頭加大藥物使用管理力度，評(píng)估食物鏈中的抗生素和耐藥菌問(wèn)題，降低風(fēng)險(xiǎn)，為引導(dǎo)消費(fèi)和科學(xué)監(jiān)管提供數(shù)據(jù)參考和科學(xué)依據(jù)，也為進(jìn)一步推動(dòng)斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康綠色發(fā)展提供動(dòng)力。

表5 5個(gè)養(yǎng)殖區(qū)斑點(diǎn)叉尾中喹諾酮類和酰胺醇類EDI及EDI/ADI值Tab.5 EDI and ADI values of quinolones and amide alcohols in Ictalurus punctatus from five aquaculture areas

3 結(jié)論

根據(jù)生長(zhǎng)周期分3次(3月、7月和10月)對(duì)5個(gè)養(yǎng)殖區(qū)鮰樣品中的6類藥物(共37種)的殘留狀況進(jìn)行了全年監(jiān)控，僅有喹諾酮(恩諾沙星與環(huán)丙沙星)、酰胺醇類(甲砜霉素和氟苯尼考)檢出，其余33種藥物均未檢出，合格率91.7%。甲砜霉素檢出率8.33%，含量在ND～6.32 μg/kg；氟苯尼考含量范圍ND～269.5 μg/kg，檢出率54.2%，兩種抗生素含量均在允許使用范圍內(nèi)。兩個(gè)檢測(cè)點(diǎn)位SY1、CD2恩諾沙星與環(huán)丙沙星總量超過(guò)限量要求，其余點(diǎn)位均合格，為確保食用安全性，建議SY1點(diǎn)位需經(jīng)過(guò)20 d 以上的休藥期再上市。

通過(guò)膳食暴露評(píng)估，喹諾酮類(恩諾沙星和環(huán)丙沙星)EDI/ADI為0～1.34×10-2；甲砜霉素為0～1.07×10-4；氟苯尼考0～1.18×10-2。3種抗生素EDI/ADI值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1，認(rèn)為對(duì)人群膳食暴露評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)水平在可接受范圍內(nèi)，說(shuō)明幾個(gè)養(yǎng)殖區(qū)養(yǎng)殖人員，具有一定的科學(xué)用藥意識(shí)，風(fēng)險(xiǎn)控制在可接受水平。