彭政忠 唐靖雯 潘 梅 楊 桃 潘 婷 盧禮平 王 歡

貴州威門(mén)藥業(yè)股份有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550018

金錢(qián)膽通顆粒是由貴州威門(mén)藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的全國(guó)獨(dú)家劑型專(zhuān)利品種，由連錢(qián)草、金錢(qián)草、茵陳、虎杖、柴胡、蒲公英、醋香附、丹參、決明子、烏梅10味中藥組成。具有清利濕熱、疏通肝膽、止痛排石的功效，用于膽石癥濕熱郁結(jié)于少陽(yáng)膽附之脅痛。痛在右脅，固定不移，或繼發(fā)絞痛，上引肩背、便秘尿黃，甚至身目俱黃發(fā)熱，舌質(zhì)暗紅，苔厚膩或黃膩，脈弦滑或弦緊。金錢(qián)膽通顆粒批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字Z20163050，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZ00252016[1]；現(xiàn)收載于《國(guó)家基本醫(yī)療保險(xiǎn)、工傷保險(xiǎn)和生育保險(xiǎn)藥品目錄(2019年版)》、《國(guó)家基本藥物目錄(2018版)》、《國(guó)家基本藥物臨床應(yīng)用指南(2018年版)》。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中薄層鑒別、含量測(cè)定方法專(zhuān)屬性、重復(fù)性較差，不能有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。本研究在現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，優(yōu)化了金錢(qián)草、茵陳、虎杖、決明子、丹參、柴胡薄層鑒別方法，增加了以虎杖苷為指標(biāo)性成分的含量測(cè)定方法。研究后建立的方法簡(jiǎn)便易行、專(zhuān)屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-20AD高效液相色譜儀(PDA檢測(cè)器)；ZF-2型三用紫外儀(上海市安亭電子儀器廠)；CH-250型超聲波清洗機(jī)(天津恒奧科技公司)；；AG135型電子天平(梅特勒-托利多公司)。

1.2 材料 金錢(qián)草對(duì)照藥材(批號(hào)：121187-201403)、茵陳對(duì)照藥材(批號(hào)：121555-201602)、虎杖對(duì)照藥材(批號(hào)：120980-201706)、丹酚酸B對(duì)照品(批號(hào)：111562-201716)、橙黃決明素對(duì)照品(批號(hào)：111900-201605)、虎杖苷對(duì)照品(批號(hào)：111575-201603；純度：87.3%；批號(hào)：111575-200502)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；柴胡皂苷b2對(duì)照品(批號(hào)：7383，上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司)。硅膠G板(批號(hào)：20150701，青島海洋化工廠分廠)，娃哈哈純凈水，乙腈(ACN)是色譜純，其它試劑均為分析純。

金錢(qián)膽通顆粒(批號(hào)：190302、190303、190402、190501、190801、190802、190804、190901、190902、190903)，由貴州威門(mén)藥業(yè)股份有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別 在現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)YBZ00252016的基礎(chǔ)上進(jìn)行了金錢(qián)膽通顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究，對(duì)處方中的金錢(qián)草、茵陳、虎杖、決明子、丹參、柴胡薄層鑒別進(jìn)行了修訂，優(yōu)化了金錢(qián)草薄層鑒別的供試品制備方法，采用超聲法替代冷浸法，并采用過(guò)柱除雜，既提高檢驗(yàn)效率又提高了相應(yīng)斑點(diǎn)的清晰度，如圖1A所示；優(yōu)化了茵陳薄層鑒別的供試品制備方法，并用常規(guī)試劑二氯甲烷替代易制毒試劑三氯甲烷，提高了方法的專(zhuān)屬性，如圖1B所示；優(yōu)化了虎杖的薄層鑒別方法，用虎杖對(duì)照藥材、虎杖苷為對(duì)照，建立了虎杖專(zhuān)屬鑒別項(xiàng)，如圖1C所示；優(yōu)化了決明子的薄層鑒別方法，用橙黃決明素為對(duì)照，建立了決明子專(zhuān)屬鑒別項(xiàng)，如圖1D所示；優(yōu)化了丹參的薄層鑒別方法，刪除了以原兒茶醛、丹參對(duì)照藥材為對(duì)照的丹參鑒別項(xiàng)，建立以丹酚酸B為對(duì)照的丹參薄層鑒別，提高了方法的專(zhuān)屬性，如圖1E所示；優(yōu)化了柴胡薄層鑒別的供試品制備方法，用常規(guī)試劑二氯甲烷替代易制毒試劑三氯甲烷，刪除了柴胡對(duì)照藥材，建立以柴胡皂苷b2 為對(duì)照的柴胡薄層鑒別，提高了方法的專(zhuān)屬性。如圖1F所示。

A：1～3.供試品溶液；4.陰性樣品溶液；5.金錢(qián)草對(duì)照藥材溶液。B：1～3.供試品溶液；4.陰性樣品溶液；5.茵陳對(duì)照藥材溶液。C：1～3.供試品溶液；4.陰性樣品溶液；5.虎杖對(duì)照藥材溶液；6.虎杖苷對(duì)照品溶液。D：1～3.供試品溶液；4.陰性樣品溶液；5.橙黃決明素對(duì)照品溶液。E：1～3.供試品溶液；4.陰性樣品溶液；5.丹酚酸B對(duì)照品溶液。F：1～3.供試品溶液；4.陰性樣品溶液；5.柴胡皂苷b2對(duì)照品溶液。圖1 金錢(qián)膽通顆粒薄層色譜圖

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A、B分別為乙腈、0.1%磷酸溶液，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：306 nm；理論板數(shù)按虎杖苷峰計(jì)算不得低于3000。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對(duì)照品溶液 取虎杖苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加稀乙醇制成每1 mL含15 μg的溶液，即得。

2.2.2.2 供試品溶液 取金錢(qián)膽通顆粒(批號(hào)：190303)適量，混勻，研細(xì)，取約0.3 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理(功率250 W、頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.3 缺虎杖的陰性樣品溶液 按處方量稱(chēng)取缺虎杖的群藥，按照制備工藝的提取方法，制成陰性樣品，再按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、缺虎杖的陰性樣品溶液各10 μL，測(cè)定。結(jié)果顯示，陰性樣品無(wú)干擾。如圖2所示。

A.供試品溶液；B.對(duì)照品溶液；C.缺虎杖的陰性樣品圖2 金錢(qián)膽通顆粒專(zhuān)屬性試驗(yàn)HPLC圖

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取虎杖苷對(duì)照品15.34 mg(批號(hào)：111575-200502，純度以89.5%計(jì))，置于100 mL量瓶中，加稀乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.1373 mg/mL的對(duì)照品貯備液。分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液1、3、4、5、12、25 mL置于50 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別制成2.746、8.238、10.98、13.73、32.95、68.65 μg/mL系列濃度溶液，各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積。以虎杖苷進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=4194351.38x-5277.46(r=1.0000，n=6)。結(jié)果表明：虎杖苷在0.02746～0.6865 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為13.61 μg/mL的虎杖苷對(duì)照品溶液10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果：峰面積的RSD為0.1%(n=6)，表明本方法精密度較好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備的供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，分別在0、2、4、8、12、18、24 h測(cè)定，記錄色譜峰。結(jié)果：峰面積的RSD為0.3%(n=7)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品(批號(hào)：190303)6份，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算虎杖苷的含量。結(jié)果：樣品中虎杖苷平均含量為1.292 mg/g，RSD為0.1%(n=6)，表明本方法的重現(xiàn)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取虎杖苷對(duì)照品(批號(hào)：111575-200502，中國(guó)食品藥品檢定研究院)16.29 mg，置50 mL量瓶中，加稀乙醇適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.2916 mg/mL的虎杖苷對(duì)照品溶液Ⅰ。精密吸取虎杖苷對(duì)照品溶液Ⅰ15 mL，置25 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.1750 mg/mL的虎杖苷對(duì)照品溶液Ⅱ。精密量取對(duì)照品溶液Ⅰ3 mL，置10 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.08748 mg/mL的虎杖苷對(duì)照品溶液Ⅲ。

取已知含量的樣品(批號(hào)：190303，虎杖苷含量：1.292 mg/g)約0.15 g(共9份，分3組)，精密稱(chēng)定，置25 mL容量瓶中，分別精密加入虎杖苷對(duì)照品溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ1 mL各3份，再分別加入稀乙醇定容至刻度，依照“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算虎杖苷的回收率。結(jié)果：虎杖苷的平均回收率為102.8%，RSD為0.5%(n=9)。見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.2.9 樣品含量測(cè)定 取10批樣品，依照“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品的含量，共計(jì)10批。見(jiàn)表3。

表3 10批樣品虎杖苷含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 TLC色譜分析 原標(biāo)準(zhǔn)中金錢(qián)草薄層鑒別采用冷浸處理耗時(shí)較長(zhǎng)，檢驗(yàn)效率低。經(jīng)摸索，采用超聲處理，再經(jīng)氧化鋁柱洗脫除雜后，斑點(diǎn)清晰且檢驗(yàn)效率提高。因此，以樣品超聲后經(jīng)氧化鋁柱洗脫除雜作為金錢(qián)草薄層鑒別供試品制備方法。

原標(biāo)準(zhǔn)中采用大黃素、大黃酚為對(duì)照作為虎杖和決明子鑒別項(xiàng)，專(zhuān)屬性較差。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，虎杖中主要含有二苯乙烯類(lèi)、蒽醌類(lèi)及黃酮類(lèi)等成分，其中二苯乙烯類(lèi)中的虎杖苷和白藜蘆醇是虎杖的主要活性成分[2]，故選擇虎杖苷對(duì)照品作為虎杖的專(zhuān)屬性鑒別項(xiàng)。決明子的主要活性成分為蒽醌類(lèi)成分，且含量較高。蒽醌類(lèi)成分有大黃酚、大黃素甲醚、美決明子素、黃決明素、決明素、橙黃決明素、大黃素、蘆薈大黃素、意大利鼠李蒽醌-1-O-葡萄糖苷、1-去甲基橙黃決明素、黃決明素、2-O-β-D葡萄糖苷等[3]，且都有明顯的藥理活性，故選擇橙黃決明素對(duì)照品作為決明子的專(zhuān)屬性鑒別項(xiàng)。

原標(biāo)準(zhǔn)中丹參薄層鑒別以丹參對(duì)照藥材、原兒茶醛、丹酚酸B作為對(duì)照。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，丹參化學(xué)成分主要包括脂溶性成分和水溶性成分，水溶性成分主要是酚酸類(lèi)物質(zhì)，主要包含丹參素、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、原兒茶醛、紫草酸等，其中，丹酚酸A、丹酚酸B是水溶性成分中重要的活性單體[4]。由于丹參對(duì)照藥材所含成分較多，各斑點(diǎn)分離不完全；原兒茶醛非丹參專(zhuān)屬性成分，故取消以丹參對(duì)照藥材、原兒茶醛為對(duì)照的鑒別。此外，樣品中丹酚酸B鑒別色帶較重，斑點(diǎn)分離度較差，故優(yōu)化以丹酚酸B為對(duì)照的鑒別，選用熱水超聲提取、乙醚萃取代原標(biāo)準(zhǔn)中采取的甲醇超聲提取、過(guò)D101大孔吸附樹(shù)脂柱、再用水飽和乙酸乙酯萃取的繁瑣操作，優(yōu)化后的方法操作簡(jiǎn)單，色譜斑點(diǎn)清晰且Rf值較好，達(dá)到定性鑒別目的。

原標(biāo)準(zhǔn)中柴胡薄層鑒別以柴胡對(duì)照藥材為對(duì)照，對(duì)照藥材色譜中斑點(diǎn)較多，供試品色譜與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上僅顯一個(gè)相同顏色熒光斑點(diǎn)，故對(duì)柴胡薄層鑒別進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，柴胡中柴胡皂苷主要有柴胡皂苷a、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷d等[5]。采用柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷d對(duì)照品為對(duì)照進(jìn)行研究，結(jié)果：供試品中，在與柴胡皂苷b2對(duì)照品相應(yīng)的位置上，斑點(diǎn)清晰，Rf值較好。故選擇柴胡皂苷b2對(duì)照品作為柴胡的專(zhuān)屬性鑒別項(xiàng)。

3.2 HPLC色譜分析

3.2.1 指標(biāo)成分選擇 原標(biāo)準(zhǔn)以大黃素為含量測(cè)定指標(biāo)，考慮大黃素為虎杖和決明子共有成分，專(zhuān)屬性不強(qiáng)，該試驗(yàn)旨在增加本品專(zhuān)屬性強(qiáng)的含量測(cè)定方法。連錢(qián)草、金錢(qián)草為雙君藥，連錢(qián)草主要含萜類(lèi)、黃酮和黃酮苷類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)等[6]，金錢(qián)草的主要化學(xué)成分是黃酮和酚酸類(lèi)化合物[7]，這兩味藥化學(xué)成分相似，經(jīng)對(duì)兩味藥中主要成分蘆丁、木犀草素、槲皮素、山柰素進(jìn)行含量測(cè)定探索性研究，所測(cè)成分含量均較低，且專(zhuān)屬性差，不宜作為本品含量測(cè)定的指標(biāo)性成分。處方中虎杖為臣藥，其主要成分虎杖苷在處方中專(zhuān)屬性強(qiáng)、含量高，故增加虎杖中虎杖苷作為含量測(cè)定指標(biāo)。

3.2.2 流動(dòng)相選擇 本試驗(yàn)條件參考了《中國(guó)藥典》2015年版一部[8]“虎杖”項(xiàng)下虎杖苷含量測(cè)定，流動(dòng)相為乙腈-水(23∶77)。結(jié)果，虎杖苷色譜峰純度、重現(xiàn)性較差。根據(jù)參考文獻(xiàn)，試驗(yàn)考察比較了乙腈-水(18∶82)[9]、乙腈-0.1%磷酸溶液系統(tǒng)梯度洗脫。結(jié)果，乙腈-0.1%磷酸溶液條件下峰純度符合要求，無(wú)拖尾現(xiàn)象。故以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按照表1規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫。

3.2.3 前處理方法選擇 考察了甲醇、乙醇和稀乙醇對(duì)提取效果的影響，結(jié)果以稀乙醇為提取溶劑提取的虎杖苷含量最高；超聲處理、加熱回流、振搖提取效果無(wú)明顯差異，為了方便操作，故選超聲提取方法；超聲15、30、45 min，虎杖苷含量基本一致。綜合考慮，以稀乙醇超聲處理30min作為虎杖苷的提取條件。

3.2.4 HPLC法耐用性考察 本研究考察了色譜柱[ Ultimate XB-C18( 250 mm×4.6 mm)、Ultimate LP-C18( 250 mm×4.6 mm)、Ultimate AQ-C18( 250 mm×4.6 mm)]，柱溫(30 ℃、35 ℃、40 ℃)，流動(dòng)相酸度(乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸)，流速( 0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min)，考察發(fā)現(xiàn)，不同條件所得檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異，RSD值均在3.0%以下，色譜圖所示虎杖苷峰型具備對(duì)稱(chēng)性，且尖銳，呈現(xiàn)出良好的分離度，表明此法在不同色譜柱、不同柱溫、不同磷酸濃度、不同流速耐用性良好。

綜上所述，本研究制定的金錢(qián)膽通顆粒質(zhì)量控制方法準(zhǔn)確可靠、專(zhuān)屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，可以作為控制金錢(qián)膽通顆粒質(zhì)量的有效方法。