劉金彤,蒲虹辰,葉林瑤,莫艷陽,楊紅

(南京農業(yè)大學理學院/江蘇省農藥學重點實驗室,江蘇 南京 210095)

農藥對于防控病蟲和雜草并提高農業(yè)生產力必不可少[1]。莠去津屬內吸型選擇性除草劑,由于其高效除草性能而在世界范圍內被大量使用。然而伴隨著莠去津的廣泛施用,其在水資源、土壤以及農作物中蓄積與殘留,為環(huán)境安全以及人體健康帶來了潛在的威脅[2-3]。因此,有效檢測并定量環(huán)境中殘留的莠去津對環(huán)境及污染評估至關重要。近年來,相繼發(fā)展并廣泛應用的如高效液相色譜、氣相色譜、質譜法等一系列農藥殘留分析方法,均具有較好的靈敏度和重現性,但大多耗時且樣品制備過程較為復雜[4-6]。因此,發(fā)展新型快捷、靈敏、選擇性好的農藥殘留分析方法尤為必要。隨著納米技術發(fā)展,熒光納米傳感探針因其分析快速、靈敏度高、選擇性高等特點,作為農藥檢測的新手段進入了研究者的視野[7-8]。相比于非特異性探針及蛋白功能化探針,適配體熒光納米探針利用適配體特異性識別的鎖鑰機制,顯示出對靶標識別的專一性,為識別復雜環(huán)境中的特定目標物提供了可能[9-10]。

本研究構建了適配體功能化的磁性納米熒光探針,并將其應用于莠去津的殘留分析檢測。莠去津適配體及熒光素標記的編碼DNA可形成非完全互補DNA雙鏈,將該復合物修飾于磁性納米粒子后,由于熒光共振能量轉移[11-12],熒光素的熒光被淬滅。當特異性識別莠去津時,DNA雙鏈解旋,淬滅的熒光被重新“點亮”,基于此建立定量檢測莠去津殘留方法,利用適配體結合莠去津,借助磁性特征實現對莠去津的富集,為開發(fā)新型農藥殘留檢測技術提供試驗及理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 主要儀器FluoroMax-4 熒光光譜儀(日本堀場公司),UV-3600紫外分光光度計(日本島津公司),高速冷凍離心機(日本日立公司),PCR儀(美國伯樂公司),高分辨透射電子顯微鏡(日本電子公司),萬分之一分析天平(梅特勒有限公司),VORTEX-5旋渦混合儀(海門其林貝爾有限公司)。

1.1.2 試劑莠去津由江蘇省農業(yè)科學院提供。六水合氯化鐵(FeCl3·6H2O)、六水合氯化亞鐵(FeCl2·6H2O)、高錳酸鉀(KMnO4)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)購自西格瑪奧德里奇公司。油酸(分析純)、氨水(28%)購自南京化學試劑有限公司。DNA序列購自上海生工生物工程技術有限公司。DNA序列包括:氨基化適配體(APT):5′-NH2-TGTACCGTCTGAGCGATTCGTACGAACGGCTTTGTACTGTTTGCACTGGCGGAT-TTAGCCAGTCAGTGTTAAGGAGTGC-3′;熒光素FAM標記的封閉鏈(FAM-L):5′-TGCAAACAGTACAAAG-CCGTTCGTACGAATCGCTCAGACGG-FAM-3′。

1.2 試驗方法

1.2.1 合成磁性Fe3O4納米粒子將16.2 g FeCl3·6H2O溶解在285 mL去離子水中,攪拌并加熱至70 ℃。另將8.8 g FeCl2·4H2O溶解于20 mL去離子水中形成溶液,加入FeCl3溶液中,同時快速加入36 mL氨水(28%)。反應1 min后,逐滴加入9.32 g油酸,并繼續(xù)在70 ℃反應1 h。

1.2.2 合成羧基化磁性Fe3O4納米粒子利用永磁體施加外磁場,收集黑棕色Fe3O4磁性納米粒子,乙醇洗滌2次以去除余量油酸,再用超純水洗滌直至pH值接近7。加入320 mL 10 mg·mL-1KMnO4溶液,在超聲清洗儀中超聲8 h。經永磁體進一步磁性分離后,用去離子水洗滌3次,通過表面羧基改性得到表面帶有羧基修飾的磁性納米粒子。

1.2.3 構建磁性納米熒光探針如圖1-A所示,將APT(100 μmol·L-1)和FAM-L(100 μmol·L-1)等量混合放入PCR儀中95 ℃退火5 min,隨后以5 ℃·min-1的速度冷卻至室溫,從而獲得DNA雙鏈APT-L。將10 mg EDC和20 mg NHS加入9 mL羧基化磁性納米粒子(1 mg·mL-1)中,并在室溫下振蕩40 min。隨后將1 mL雙鏈APT-L(50 μmol·L-1)加入該混合物中并在室溫下孵育3 h。將產物離心洗滌2次,并重新分散于磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4)中作磁性納米探針。

圖1 磁性納米探針的制備(A)及其應用于莠去津的熒光傳感分析(B)示意圖Fig.1 Schematic illustration of construction of magnetic nanoprobe(A)and its application in the fluorescent sensing of atrazine(B)

1.2.4 莠去津傳感分析傳感原理如圖1-B所示。分別將不同質量濃度(0、0.01、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg·mL-1)的莠去津與磁性納米探針(20 μL)于PBS(20 mmol·L-1,pH7.4)中混合,并將混合液于37 ℃避光反應30 min。測定激發(fā)波長492 nm下樣品的熒光發(fā)射光譜及其520 nm峰值處的熒光強度,繪制莠去津檢測標準工作曲線。

1.2.5 選擇性及離子干擾性驗證為了驗證所合成探針對莠去津的特異性,分別將含有特丁津、西瑪津、撲滅津、撲草凈、莠滅凈(均為1 μg·mL-1)等農藥與探針孵育,并測定其熒光強度;為了驗證莠去津檢測探針對各種陽離子的抗干擾性,將含Na+、Cu2+、Zn2+、K+、Mg2+、Ca2+(均為1 μg·mL-1)的莠去津溶液(1 μg·mL-1)與納米探針均勻混合,測定其熒光強度。

1.2.6 加標回收率測定取南京農業(yè)大學實驗基地未使用莠去津的稻田水及黃棕壤稻田土作為試樣,并添加莠去津標準溶液使水樣的添加水平分別為0.01、0.5和5 mg·L-1,土樣的添加水平為0.01、0.5和5 mg·kg-1。稻田水先后用濾紙和0.45 μm濾膜過濾,將過濾后的稻田添加水樣與探針共孵育,采用1.2.3節(jié)建立的熒光分析方法檢測。稻田土壤樣品晾干后,去除石子、植物組織等雜質,過孔徑150 μm篩網后稱取上述土樣 2 g,加入15 mL乙腈與水(體積比為2∶1),超聲提取后,再以4 000 r·min-1離心8 min,收集上清液,旋轉蒸發(fā)儀濃縮至近干。用水將燒瓶中殘留物超聲溶解,定容至1 mL,取樣進行熒光檢測,每個添加水平重復3次。

2 結果與分析

2.1 磁性納米探針表征

由透射電子顯微鏡(TEM)圖可見:所合成的羧基化磁性Fe3O4納米粒子形狀較均一,粒徑7～10 nm(圖2-A),粒徑小表明其具有較大的比表面積,有利于后續(xù)適配體的連接。同時,在羧基化磁性Fe3O4納米粒子的紫外吸收圖譜中可見一主吸收峰位于440 nm附近(圖2-B)[13]。相比于Fe3O4納米粒子,羧基化磁性Fe3O4納米粒子由于表面具有更多的負電性的-COOH,其Zeta電位由原來的33.7 mV降至-11.0 mV(圖2-C),進一步證明了羧基化磁性Fe3O4納米粒子合成成功。此外,羧基化磁性Fe3O4納米粒子具有較寬的紫外吸收峰,可淬滅修飾其上DNA鏈的熒光,為探針的設計提供可能。相比于羧基化磁性Fe3O4納米粒子,利用雙鏈APT-L功能化后,獲得的磁性納米探針在UV-vis光譜中具有新的260 nm DNA的特征峰,證明該探針合成成功。根據已知濃度APT-L溶液的熒光校準曲線(圖2-D),將合成過程中含有游離APT-L上清液的熒光強度轉化為相應的APT-L濃度,用初始APT-L濃度減去剩余濃度獲得磁性納米探針APT-L的負載率為31.7%。如圖2-B中插圖所示,合成的Fe3O4納米粒子溶液呈現均勻的黑褐色(左),而在右側施加磁場后,該納米粒子由于磁性作用引導被吸附貼于內壁(右),證明羧基化磁性Fe3O4納米粒子具有在磁性作用下可分離的特性。

圖2 羧基化磁性Fe3O4納米粒子及磁性探針的表征Fig.2 Characterization of COOH-Fe3O4 nanoparticles and magnetic probeA. 羧基化磁性Fe3O4納米粒子TEM圖(插圖:放大TEM圖);B. 羧基化磁性Fe3O4納米粒子及磁性探針的紫外-可見光譜圖[插圖:在無(左)、有(右)磁場作用下羧基化磁性Fe3O4納米粒子溶液圖片];C. Fe3O4納米粒子與羧基化磁性Fe3O4納米粒子的Zeta電位圖;D. 不同濃度APT-L的熒光強度。A. TEM image of magnetic COOH-Fe3O4 nanoparticles(Inset:Enlarged TEM image);B. UV-visible spectrum of COOH-Fe3O4[Inset:Photograph of COOH-Fe3O4 magnetic nanoparticles suspended in water(left)and separated by an external magnet(right)];C. Zeta potentials of Fe3O4 nanoparticles and COOH-Fe3O4 nanoparticles;D. Fluorescence intensity vs. different concentrations of APT-L.

2.2 凝膠電泳試驗

為了驗證所合成的磁性熒光探針構建是否成功及其對莠去津的特異性響應,采用凝膠電泳分析,結果(圖3)顯示:相比于FAM-L(條帶b)及APT(條帶c)2條DNA單鏈,通過堿基互補配對而成的DNA雙鏈APT-L,呈現出1條單一的條帶(條帶a);同時,由于其堿基分子更多,在凝膠電泳上受電場作用遷移距離更短,證明該APT-L雙鏈DNA成功合成。

圖3 APT-L(a)、FAM-L(b)、APT(c)、探針(d)及探針+莠去津(e)的凝膠電泳分析圖Fig.3 Polyacrylamide gel electrophoresis analysis image of APT-L(a),FAM-L(b),APT(c),magnetic probe(d)and magnetic probe+atrazine(e)

將APT-L雙鏈通過共價鍵結合到羧基化磁性Fe3O4納米粒子得到納米探針后,探針由于納米粒子的阻滯作用而停留于點樣孔中,相應的APT-L雙鏈條帶消失(圖3,條帶d)。將探針與莠去津孵育后點樣,則出現與FAM-L鏈(條帶b)遷移距離類似的條帶(條帶e)。這可能是由于磁性探針內的莠去津適配體與莠去津之間具有強親和力,二者特異性結合后可釋放熒光標記的FAM-L鏈脫離探針,從而用于莠去津的識別與檢測。

2.3 探針檢測莠去津

將探針應用于莠去津傳感分析試驗中,在優(yōu)化pH(pH7.4)條件下,磁性探針熒光對莠去津的響應在30 min孵育時間達到最佳(圖4)。由磁性熒光探針的熒光光譜(圖5-A)可見:在492 nm激發(fā)光下,探針的發(fā)射光譜峰值位于520 nm處,且其熒光強度較低,這是由于磁性熒光探針內載體對FAM-L鏈熒光具有較強的淬滅作用,為莠去津檢測方法的建立提供了較低背景。將探針分別與0、0.01、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg·mL-1的莠去津共孵育后,探針熒光峰位置未發(fā)生明顯偏移,其熒光強度隨莠去津質量濃度增加而逐漸增強,并在0.01～20 μg·mL-1與質量濃度(β)的對數呈良好的線性關系(圖5-B)。線性回歸方程:F=1 559 149 lgβ+3 611 861,R2=0. 998,傳感器的最低檢測限為8.17 μg·L-1。以上結果均表明開發(fā)的熒光探針可對莠去津殘留實現傳感分析,并具有較高靈敏度。

圖4 不同孵育時間(A)和pH(B)條件下磁性探針對莠去津(1 μg·mL-1)響應的熒光強度Fig.4 Fluorescence intensity of magnetic probe in response to atrazine(1 μg·mL-1) at the incubation time(A)and pH(B)

圖5 磁性探針測定莠去津Fig.5 Determination of atrazine by magnetic probeA. 磁性探針對0、0.01、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg·mL-1莠去津的熒光響應譜圖(從下到上);B. 磁性探針熒光強度與莠去津濃度對數值的標準工作曲線。A. Fluorescence response of magnetic probe to atrazine at the concentrations of 0,0.01,0.1,0.2,0.5,1,2,5,10 and 20 μg·mL-1(from bottom to top);B. The calibration curve of fluorescence intensity of magnetic probe vs. logarithmic value of atrazine concentration.

將本文構建的傳感器和文獻報道[14-19]的莠去津檢測方法進行比較,結果(表1)顯示:本試驗制備的傳感器的檢測限比大多數已報道的傳統方法低,而且具有較寬的線性范圍,以上結果證明了DNA修飾熒光納米探針的高負載效率及熒光方法的靈敏性。

表1 莠去津不同檢測方法的比較Table 1 Comparison of various detection methods for atrazine

2.4 探針檢測莠去津的選擇性及抗離子干擾性驗證

為驗證檢測體系測定實際樣品中莠去津殘留濃度的可行性與特異性,研究了此體系對一些常見農藥的響應情況。由圖6-A可見:相比于莠去津引發(fā)的強信號,探針對含有特丁津、西瑪津、撲滅津、撲草凈、莠滅凈等農藥幾乎沒有響應,說明修飾于探針的適配體對莠去津具有良好的特異性。為驗證方法的抗離子干擾性,在檢測莠去津體系中分別加入各種陽離子,并測定體系熒光強度。由圖6-B可知:相比于僅加入莠去津(1 μg·mL-1)的對照組,共存離子Na+、Cu2+、Zn2+、K+、Mg2+和Ca2+(均為1 μg·mL-1)對探針檢測莠去津的干擾幅度均不超過對照組的4%?？梢?納米探針的熒光強度不受該濃度下陽離子的影響,具有一定抗離子干擾能力。

圖6 常用農藥(A)或共存離子(B)對磁性探針熒光強度的影響Fig.6 Effect of common pesticides(A)or coexisting ions(B)on the fluorescence intensity of magnetic probe in the presence

2.5 實際樣品測定

為考察本方法的可行性,我們通過標準加入回收試驗進行稻田水及稻田土實際樣品中莠去津含量的測定。如表2所示:稻田水中添加0.01、0.5和5 mg·L-1莠去津時,其平均添加回收率為95.48%～102.03%,RSD為2.17%～3.14%;當稻田土中莠去津的添加水平為0.01、0.5和5 mg·kg-1時,其平均添加回收率為94.79%～100.66%,RSD為3.40%～4.72%。上述結果表明本檢測方法均滿足農藥殘留定量分析要求,檢測限低于國家食品中農藥最大殘留限量標準(0.02 mg·kg-1)[20]。表明,基于磁性探針的莠去津殘留檢測方法具有較好的重現性及應用于實際樣品檢測的潛力。

表2 莠去津在不同樣品中的添加回收率及相對標準偏差(n=3)Table 2 Recoveries and the relative standard deviations(RSD)of atrazine in real samples including paddy water and soil(n=3)

3 結論

本研究開發(fā)了基于磁性納米材料的熒光探針,通過適配體修飾及DNA設計,將所開發(fā)探針應用于莠去津殘留量的熒光傳感分析。結果表明:所建立的莠去津殘留熒光定量方法簡單、高效,具有較高的靈敏度和較好的重現性,符合農藥殘留分析要求,并可應用于稻田水及稻田土中莠去津的定量檢測。