張皓,劉雪瑩,錢銘,高鴻儒,湯超,張華,王鵬,張紹鈴,吳巨友*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院/江蘇省梨工程研究中心,江蘇 南京 210095;2.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院,上海 201699)

蛋白標簽(protein tag)是指利用DNA體外重組技術(shù),與目的蛋白一起融合表達的蛋白或多肽,主要用于目的蛋白的表達、純化、檢測和示蹤等[1]。隨著功能基因組學和蛋白質(zhì)組學的快速發(fā)展,越來越多的蛋白標簽系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn),這也極大地豐富了蛋白標簽的功能。根據(jù)試驗的不同目的可以選擇不同功能的蛋白標簽。目前常用的蛋白標簽有谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)[2]、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)[3]、綠色熒光蛋白(GFP)[4]、用于蛋白純化和檢測設(shè)計的八肽(Flag)[5]、六聚組氨酸(6×His)[6]、來源于人c-myc基因的表位標簽(Myc)[7]和流感病毒血凝素表位(HA)[8]等。根據(jù)蛋白標簽相對分子質(zhì)量的大小被分成2大類:大的蛋白質(zhì)分子(或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域及其衍生物)和小的多肽片段。前者主要有GST、MBP和GFP等,它們在使用過程中會增加目的蛋白的溶解性,但在蛋白結(jié)晶和抗體產(chǎn)生等過程中必須去除標簽;后者主要有Flag、6×His、Myc和HA等,多數(shù)情況下多肽標簽相對分子質(zhì)量相對較小,對融合蛋白結(jié)構(gòu)的影響較小,不需要從融合蛋白中切除,所以多肽標簽更為常用[9]。例如多肽標簽Flag和Myc分別由8個氨基酸(DYKDDDDK)和10個氨基酸(EQKLISEEDL)組成的小分子短肽,所以它們對目的蛋白的折疊不會造成明顯的影響[10]。6×His標簽是由6個組氨酸殘基鏈接上所組成的氨基酸序列,該標簽是純化重組蛋白的首選標簽,因為組氨酸殘基的序列可以在特定的緩沖液條件下結(jié)合到多種類型固定的離子上(比如鎳、鈷和銅),從而獲得易檢測和純化His標簽的重組蛋白[11-13]。因此,小分子多肽標簽對目的蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和生理活性的影響很小,所以在表達及純化效果方面具有顯著的優(yōu)勢。

不同的融合標簽系統(tǒng)有其相同點,但各自也有其不同的優(yōu)勢和缺點。融合標簽系統(tǒng)受到很多因素制約,例如融合標簽系統(tǒng)的純化條件、融合目的蛋白自身的性質(zhì)(如等電點和細胞定位等)、純化的基質(zhì)及試驗材料成本和融合標簽的可去除性等[14]。沒有任何單一標簽可以滿足所有試驗研究的需要。因此,開發(fā)2種甚至多種不同功能蛋白標簽的組合使用,現(xiàn)已成為融合標簽技術(shù)的發(fā)展趨勢。本研究基于同源重組連接酶反應(yīng),利用大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系得到同時含有目的基因和所需蛋白標簽的重組質(zhì)粒,為進一步研究目的蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘碭山酥梨’的花柱,取自南京農(nóng)業(yè)大學梨工程技術(shù)研究中心的江浦實驗基地。載體pCold-TF、p1300-35S-GFP和pROK2-35S-mCherry由南京農(nóng)業(yè)大學國家梨產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心保存。大腸桿菌T1(DH5α)和BL21(DE3)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;農(nóng)桿菌GV3101購自南京百思禾生物科技有限公司。限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ和BglⅡ購自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司;Phanta Max高保真DNA聚合酶、2×Rapid Taq master Mix和同源重組連接酶Exnase Ⅱ 購自南京諾唯贊生物科技有限公司;膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自愛思進生物技術(shù)(杭州)有限公司。

1.2 RNA提取和 cDNA 合成

RNA提取使用成都福際生物技術(shù)有限公司多糖多酚植物RNA 提取試劑盒。反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript?One-Step RT-PCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計

從梨基因組數(shù)據(jù)庫中下載目的基因S7-RNase的CDS參考序列[15],利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計目的基因和蛋白標簽的引物(表1)。

表1 本研究所用引物及用途Table 1 Primers used in the study and its application

根據(jù)同源重組連接酶的原理,將線性化載體和插入片段(插入片段的5′和3′最末端引入線性化載體兩端一致的序列15～20 bp)按一定比例混合后,在同源重組連接酶的催化下,37 ℃反應(yīng)30 min即可完成連接。因此,多標簽重組連接酶法需要在目的基因和蛋白標簽的正/反向引物5′端前添加15 bp同源臂和酶切位點,用于同源重組連接酶的連接,具體見圖1。此外也可以在蛋白標簽前添加一些不常用的酶切位點,為后續(xù)試驗更換目的基因帶來便利。設(shè)計快速添加目的基因的蛋白標簽時,分別為目的基因S7-RNase(去除信號肽)和蛋白標簽GFP設(shè)計2對引物F1/R1和F2/R2,然后在每個引物的5′端加入相應(yīng)的15 bp的同源臂和6 bp的酶切位點。例如引物R1與F2之間至少要有15 bp同源臂,引物F1和R2分別與載體pCold-TF被NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切之后兩端要有15 bp同源臂,為了同源重組連接酶的識別、切割特異的重組位點,要連接2個參與重組的分子(表1、圖2-A)。同樣,設(shè)計快速替換目的基因的蛋白標簽時,分別為目的基因S7-RNase和蛋白標簽mCherry設(shè)計2對引物F3/R3和F4/R4,然后在每個引物的5′端加入相應(yīng)的15 bp的同源臂和6 bp的酶切位點(表1、圖2-B)。

圖1 目的基因和蛋白標簽的引物設(shè)計圖Fig.1 Primer design diagram of target gene and protein tag

圖2 快速添加(A)或替換蛋白標簽(B)的流程圖Fig.2 Flow chart of the new method of rapid protein tag addition(A)or replacement(B)

1.4 基因克隆及表達載體構(gòu)建

以‘碭山酥梨’的花柱cDNA和p1300-35S-GFP載體質(zhì)粒為模板,分別用引物F1/R1和F2/R2經(jīng)PCR擴增得到目的基因S7-RNase片段1和蛋白標簽GFP片段2。pCold-TF空載體用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后,用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對片段1、2和載體pCold-TF(NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切)進行膠回收,再將片段1、2和載體pCold-TF(NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切)在重組酶反應(yīng)體系下37 ℃反應(yīng)30 min,最后將樣品置于冰上終止反應(yīng)。重組酶反應(yīng)體系20 μL:片段1xμL,片段2yμL,雙酶切載體片段zμL,5×重組酶反應(yīng)buffer 4 μL,重組酶 2 μL,用無菌ddH2O補至20 μL。其中,x=[0.04×片段1堿基對數(shù)]/片段1的濃度;y=[0.04×片段2堿基對數(shù)]/片段2的濃度;z=[0.02×載體片段堿基對數(shù)]/雙酶切載體的濃度。重組酶反應(yīng)終止后,立即進行載體轉(zhuǎn)化。從反應(yīng)體系中取20 μL樣品在冰上與100 μL大腸桿菌T1感受態(tài)混合,冰浴30 min;在42 ℃水浴鍋中熱激45 s,立即置于冰上,3 min后在體系中加入700 μL無抗LB培養(yǎng)基,在37 ℃搖床中孵育1 h;將樣品涂布于抗性氨芐青霉素(Amp)固體平板,在37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h。從上述的轉(zhuǎn)化平板中挑取10個單克隆菌落分別放入裝有200 μL Amp液體LB的2 mL的離心管,在37 ℃搖床中振搖8～10 h。取1 μL菌液為PCR模板,以F5/R5為引物對,進行菌液PCR。PCR體系20 μL:模板 1 μL,正、反向引物各1 μL,2×Rapid Taq master Mix 10 μL,用無菌ddH2O補至20 μL。PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。如有目的條帶,取100 μL菌液送公司測序。測序結(jié)果正確即可得到重組菌株,可以提取質(zhì)粒進行下一步試驗。

以‘碭山酥梨’的花柱cDNA和pROK2-35S-mCherry載體質(zhì)粒為模板,分別用引物F3/R3和F4/R4經(jīng)PCR擴增得到目的基因S7-RNase片段3和蛋白標簽mCherry片段4。p1300-35S-GFP空載體用XbaⅠ和BglⅡ進行雙酶切,其余方法同上。其中菌液PCR的引物為F6/R6,菌落置于含卡那霉素(Kan)的液體LB中搖菌。試驗所需引物見表1。

1.5 目的基因S7-RNase的原核表達及亞細胞定位

將去除信號肽的目的基因S7-RNase和蛋白標簽GFP構(gòu)建到His標簽的載體pCold-TF中,并轉(zhuǎn)化BL21菌株。采用張皓等[16]的方法,將得到的上述重組表達菌株按1∶50接種到10 mL LB(含100 μg·mL-1Amp)液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜,活化重組表達菌株。將活化的重組表達菌株按 1∶50 轉(zhuǎn)至15 ml LB培養(yǎng)基(含Amp 100 μg·mL-1)中,37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)至D600為0.5時再置于15 ℃搖床中靜置40 min,最后加入終濃度為0.5 mmol·L-1的IPTG,誘導(dǎo)表達24 h。表達完成后取10 mL菌液12 000 r·min-1離心5 min,收集菌體沉淀。沉淀中加入200 μL 0.1 mg·mL-1十二烷基磺酸鈉(SDS),混勻后100 ℃水浴10 min,再置于冰上冷卻2 min,于4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min;取上清液40 μL,加入10 μL 5×蛋白上樣緩沖液混勻后,取10 μL進行12%常規(guī)SDS-PAGE,考馬斯亮藍染色、脫色后檢測重組蛋白表達情況。

將目的基因S7-RNase和蛋白標簽mCherry構(gòu)建到去除GFP標簽的載體p1300-35S-GFP上,并將p1300-35S-S7-RNase-mCherry的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(GV3101),經(jīng)PCR鑒定為陽性后置于28 ℃、200 r·min-1搖床中培養(yǎng)1～2 d。將農(nóng)桿菌液按體積比為1∶50比例擴繁后5 000 r·min-1離心10 min,收集菌液,將菌液懸浮在含有10 mmol·L-1MES、10 mmol·L-1MgCl2和100 μmol·L-1乙酰丁香酮的誘導(dǎo)劑中,置于室溫 50 r·min-1的搖床中孵育4 h。用1 mL去針頭無菌注射器吸入菌液,緩緩注射到小葉本氏煙的背面葉片中,侵染完成后置于20～25 ℃的環(huán)境下繼續(xù)生長2 d,使用ZEISS LSM800激光共聚焦顯微鏡拍照。試驗重復(fù)3次。亞細胞定位引物見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種添加或替換目的基因蛋白標簽方法用時和步驟的比較

由表2可見:T4DNA連接酶法添加或替換目的基因的1個蛋白標簽總用時為4～6 d,而多標簽重組連接酶法和融合PCR法總用時2～3 d。通過進一步比較多標簽重組連接酶法和融合PCR法,發(fā)現(xiàn)融合PCR法在基因克隆步驟上除了擴增目的基因和蛋白標簽外,還需要進行預(yù)融合PCR和正式融合PCR擴增,因此在基因克隆上融合PCR法用時是多標簽重組連接酶法的3倍,可見多標簽重組連接酶法在用時方面比融合PCR法還是具備一定的優(yōu)勢,同時這種優(yōu)勢隨著擴增片段(目的基因和蛋白標簽)長度的增加會進一步擴大。另外,多標簽重組連接酶法添加或替換目的基因的1個蛋白標簽只需1步即可,而T4DNA連接酶法則需要2步;融合PCR法雖然也只需1步,但是在基因克隆步驟上需要多個步驟。因此,多標簽重組連接酶法在用時和步驟上比融合PCR法和T4DNA連接酶法具有更簡單、快速和高效等特點。

表2 3種添加或替換目的基因蛋白標簽方法用時和步驟的比較Table 2 Time and steps comparison of protein tag addition or replacement of target gene in three methods

2.2 目的基因和蛋白標簽片段的克隆及融合載體構(gòu)建

利用F1/R1和F2/R2引物經(jīng)PCR擴增得到目的基因S7-RNase(去除信號肽)片段1和蛋白標簽GFP片段2。凝膠電泳結(jié)果顯示,片段1位于500～750 bp,片段2位于500～750 bp,與預(yù)期的600和714 bp基本相符(圖3-A)。將片段1、2和雙酶切載體pCold-TF片段在重組酶Exnase Ⅱ的作用下進行連接,轉(zhuǎn)化和測序。菌液PCR擴增結(jié)果可見1 300 bp左右的條帶(圖3-B),測序結(jié)果顯示目的基因S7-RNase和蛋白標簽GFP已經(jīng)連接到載體上。同樣,利用F3/R3和F4/R4兩對引物經(jīng)PCR擴增得到目的基因S7-RNase片段1和蛋白標簽mCherry片段2。凝膠電泳結(jié)果顯示,片段3位于500～750 bp,片段4位于500～750 bp,與預(yù)期的678和711 bp基本相符(圖3-C)。將片段3、4和雙酶切載體p1300-35S-GFP片段在重組酶Exnase Ⅱ的作用下進行連接,轉(zhuǎn)化和測序。菌液PCR擴增結(jié)果可見1 400 bp左右的條帶(圖3-D),測序結(jié)果顯示目的基因S7-RNase和蛋白標簽mCherry已經(jīng)連接到載體上。

圖3 基因克隆(A、C)及陽性克隆的PCR檢測(B、D)Fig.3 Gene cloning(A,C)and PCR detection of positive clones(B,D)M. DNA Marker;1～2分別為S7-RNase和GFP蛋白標簽的基因克隆;3～12為重組質(zhì)粒S7-RNase-GFP-pCold-TF轉(zhuǎn)化大腸桿菌的PCR檢測;13～14分別為S7-RNase和mCherry蛋白標簽的基因克隆;15～24為重組質(zhì)粒p1300-35S-S7-RNase-mCherry轉(zhuǎn)化大腸桿菌的PCR檢測。M. DNA Marker;1-2 indicate gene clones of S7-RNase and GFP protein tag,respectively. 3-12 indicate PCR detection of recombinant plasmid S7-RNase-GFP-pCold-TF was transformed into Escherichia coli. 13-14 indicate gene clones of S7-RNase and mCherry protein tag,respectively. 15-24 indicate PCR detection of recombinant plasmid p1300-35S-S7-RNase-mCherry was transformed into E. coli.

2.3 載體S7-RNase-GFP-pCold-TF重組蛋白的體外表達

將上述重組質(zhì)粒S7-RNase-GFP-pCold-TF(帶有2個蛋白標簽:GFP和His)轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21進行原核表達,發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒S7-RNase-GFP-pCold-TF菌液明顯呈淺綠色(圖4-A)。通過不同IPTG濃度篩選,最后發(fā)現(xiàn)在15 ℃和IPTG終濃度為0.5 mmol·L-1時,重組蛋白表達量最高。S7-RNase(除去信號肽)蛋白相對分子質(zhì)量約為22×103,帶His標簽的重組表達載體和GFP標簽相對分子質(zhì)量分別約為50×103和 27×103,所以最終表達的重組蛋白S7-RNase-GFP-His相對分子質(zhì)量約為100×103,這與SDS-PAGE檢測的結(jié)果較為一致(圖4-B)。

圖4 S7-RNase-GFP-pCold-TF在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中的表達(A)及重組蛋白誘導(dǎo)表達后的SDS-PAGE圖(B)Fig.4 Expression of S7-RNase-GFP-pCold-TF in prokaryotic system from Escherichia coli(A) and the SDS-PAGE image of recombinant protein after induced expression(B)1～3分別為IPTG誘導(dǎo)后的His、S7-RNase-His和S7-RNase-GFP-His的菌液表達;4～6分別為IPTG誘導(dǎo)后的His、S7-RNase-His和 S7-RNase-GFP-His菌體總蛋白;M. 蛋白質(zhì)標準分子量。1-3 are the expression from Escherichia coli of His,S7-RNase-His and S7-RNase-GFP-His that are induced by IPTG,respectively. 4-6 are the total protein of His,S7-RNase-His and S7-RNase-GFP-His that are induced by IPTG,respectively. M. The standard of molecular weight of protein.

2.4 目的基因S7-RNase的亞細胞定位分析

如圖5所示:GFP空載可在整個煙草葉片的細胞中表達,而S7-RNase-GFP或S7-RNase-mCherry的綠色或紅色熒光主要在細胞膜與細胞壁之間有明顯積累的趨勢;同時在細胞核周圍的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上也發(fā)現(xiàn)了綠色和紅色熒光。表明S7-RNase蛋白可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生并由細胞質(zhì)運輸?shù)桨狻?/p>

圖5 S7-RNase-GFP和S7-RNase-mCherry蛋白的亞細胞定位Fig.5 Subcellular localizations of S7-RNase-GFP and S7-RNase-mCherry proteinDAPI:4′,6-二脒基-2-苯基吲哚4′,6-diamidino-2-phenylindole. Bar=20 μm.

3 討論與結(jié)論

隨著蛋白組學和功能基因組學的興起,如何獲取大量高純度的蛋白成為一個亟須解決的難題,這也極大促進了融合標簽技術(shù)和蛋白純化技術(shù)的快速發(fā)展。最近,Lu等[17]提出“水稻全基因組蛋白標簽計劃(RPTP)”的倡議,該計劃旨在全基因組范圍內(nèi)讓水稻的每一個蛋白編碼基因原位標記一個蛋白標簽,將極大推動水稻和其他物種的蛋白組學和功能基因組學的發(fā)展。此外,通過基因工程技術(shù)將具有一定生物學意義的功能基因連接到表達載體中,進行重組蛋白的表達和純化,有利于進一步研究其具體功能、在細胞內(nèi)的定位以及與其他蛋白互作等[18]。目前,利用融合標簽技術(shù)進行目的蛋白的表達、純化、檢測和示蹤等方法已得到普遍使用,但其仍然存在一些缺點,如蛋白標簽可能干擾與其融合目的蛋白的折疊,從而影響目的蛋白的可溶性和活性,導(dǎo)致其在細胞中不能正常表達和發(fā)揮作用[18-19]。因此,合理使用某種蛋白標簽對目的蛋白的表達和純化及其重組蛋白的活性同樣也至關(guān)重要。

原核表達技術(shù)是獲得目的蛋白最經(jīng)濟實用的方法之一[20-21]。大腸桿菌因其遺傳背景清楚、擴繁周期短、技術(shù)操作和培養(yǎng)條件簡單等特點,常作為外源蛋白表達的宿主[21]。而GFP作為融合蛋白的表達標簽,是一種應(yīng)用方便、檢測手段簡單,對融合的目的蛋白產(chǎn)生較少干擾的報告蛋白質(zhì)[18]。目前在大腸桿菌中利用GFP標簽表達外源蛋白是一種常見的技術(shù)手段,但T4DNA連接酶法在構(gòu)建添加或替換目的基因的蛋白標簽時存在試驗環(huán)節(jié)多、操作繁雜且轉(zhuǎn)化效率和目的蛋白表達量偏低等問題。盡管融合PCR法為不同來源的任意DNA片段體外連接提供了快速簡捷的途徑[22],但在基因克隆等步驟上環(huán)節(jié)較多,因此應(yīng)用過程也存在一些問題。本研究基于同源重組連接酶反應(yīng),利用大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系將一個蛋白標簽與目的基因同時進行連接從而一步獲得試驗所需的重組表達載體,同時還可以一步添加多個蛋白標簽或替換原有載體上的蛋白標簽。該方法具有簡單、快速和高效等特點,為進一步研究蛋白結(jié)構(gòu)、功能以及蛋白之間的互相作用等提供了一定的技術(shù)支持。