王洪流，董又坤，廖志剛，張愛明

(荊州市第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 荊州 434000)

脊髓型頸椎病(cervical spondylitis myelopathy,CSM)約占頸椎病總發(fā)病人數(shù)的20%，屬于臨床頸椎病中最常見且預(yù)后較差的分型[1-2]。CSM的病理生理機制為頸椎退行性改變致脊髓壓迫引起血供不足，繼發(fā)各類脊髓功能障礙，臨床特征以進行加重性四肢癱瘓為主，早期肢體僵硬、精細動作失靈，直至出現(xiàn)四肢癱瘓，患者生活質(zhì)量顯著惡化，預(yù)后差。

有研究發(fā)現(xiàn)，退行性變的頸椎間盤通過持續(xù)釋放多種細胞因子在CSM病理生理進程中占據(jù)重要作用[1,3]。KIM等[4]研究發(fā)現(xiàn)，膝骨關(guān)節(jié)炎患者的膝關(guān)節(jié)滑膜及關(guān)節(jié)液中白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等細胞因子顯著過表達，并與膝關(guān)節(jié)軟骨破壞和炎癥過程密切關(guān)聯(lián)。黃子達[5]研究發(fā)現(xiàn)，炎癥相關(guān)細胞因子及其細胞信號通路如核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路在CSM的病理進程中可能存在調(diào)控作用。

花椒毒酚是一種從中草藥蛇床子中提取的香豆素化合物。有研究表明，花椒毒酚具有抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛等生物學(xué)作用，已在骨關(guān)節(jié)疾病中得到初步應(yīng)用[6]；但花椒毒酚在頸椎間盤軟骨組織中是否有效尚不確定。因此，本研究通過注射骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)構(gòu)建大鼠CSM模型，探討花椒毒酚在CSM動物模型中的作用及其相關(guān)作用機制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物50只無特定病原級成年Sprague Dawley大鼠購自武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心(許可證號：20191029AS)，8～10周齡、體質(zhì)量200～220 g、雌雄不拘，所有操作遵循動物護理和使用委員會批準(zhǔn)。將大鼠飼養(yǎng)于12 h明/暗交替環(huán)境，自由獲取食物和水，造模前適應(yīng)生存環(huán)境至少3 d。

1.2 主要試劑與儀器BMP購自上海齊一生物科技有限公司，花椒毒酚購自南京道斯夫生物科技有限公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液購自湖北萬業(yè)醫(yī)藥有限公司，水合氯醛購自武漢沃軒科技有限公司，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)購自南昌雨露實驗器材有限公司，大鼠白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法蛋白定量試劑盒購自上海北諾生物科技有限公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)、NF-κB p65、磷酸化核因子-κB p65(phosphorylated nuclear factor kappa-B，p-NF-κB p65)一抗和免疫印跡熒光標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)二抗購自武漢谷肽生物試劑公司，電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)顯色液購自美國Bio-Rad公司；凝膠電泳系統(tǒng)購自北京六一儀器廠，凝膠電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜購自美國Millipore公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備與分組將50只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)14 d后按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組(n=12)、模型組(n=13)、低劑量花椒毒酚組(n=12)和高劑量花椒毒酚組(n=13)。使用300 mg·kg-1水合氯醛行腹腔注射麻醉大鼠，碘伏消毒后于頸前正中偏右做縱向切口，長2～3 cm，鈍性分開椎體前肌肉組織，骨膜下剝離，顯露椎體前方及椎間隙。在X線下定位確認第4和第5頸椎椎體，將4號空針插入第4和第5頸椎椎間隙距椎體后緣約0.5 mm處，進針深度不得超過3 mm。將0.1 mL 體積分數(shù)95% BMP溶于20 mL的氯化鈣(10 g·L-1)中制成混懸液。模型組、低劑量花椒毒酚組和高劑量花椒毒酚組大鼠于第4至第5頸椎椎間隙注入0.2 mL BMP混懸液制備脊髓型頸椎病大鼠模型，假手術(shù)組大鼠注射0.2 mL生理鹽水。造模后第 3天，低劑量花椒毒酚組和高劑量花椒毒酚組大鼠分別給予腹腔注射5、10 mg·kg-1花椒毒酚溶液，假手術(shù)組和模型組大鼠給予腹腔注射等量生理鹽水，所有大鼠均隔日注射1次，連續(xù)注射7次，于造模術(shù)后2周內(nèi)完成所有注射。

1.3.2 頸椎間盤滑膜組織和關(guān)節(jié)液及血清取材和保存造模后第4周，4組大鼠經(jīng)尾靜脈采血1 mL，1 500 r·min-1離心15 min，收集上層血清保存?zhèn)溆谩２捎美i脫臼法處死所有大鼠，取頸椎間盤滑膜組織，應(yīng)用40 g·L-1多聚甲醛固定，用于大鼠頸椎間盤滑膜組織病理學(xué)觀察；其余頸椎間盤滑膜組織置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ａ硗馊〈笫箢i椎間盤關(guān)節(jié)液，1 500 r·min-1離心15 min，收集上清液，置于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 HE染色觀察4組大鼠頸椎間盤滑膜組織病理學(xué)情況取多聚甲醛固定的大鼠頸椎間盤組織，剝離大鼠頸椎間盤關(guān)節(jié)腔，取滑膜，常規(guī)乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片(片厚5 mm)，HE染色，脫水透明后中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠椎間盤滑膜組織病理學(xué)情況。

1.3.4 改良Rivlin斜板實驗觀察4組大鼠運動功能分別于造模前及造模后第4周，將大鼠置于可調(diào)節(jié)傾斜角度的橡膠面板，不斷增加面板傾斜角度，觀測大鼠在面板之上維持位置不變至少5 s的最大傾斜角度，調(diào)整頭尾方向再測1次。實驗重復(fù)2次，取平均值。最大傾斜角度越大表示大鼠運動功能越好。

1.3.5 ELISA法檢測4組大鼠血清及頸椎間盤關(guān)節(jié)液中IL-6、IL-1β、TNF-α表達水平取保存的血清和頸椎間盤關(guān)節(jié)液上清，室溫解凍，采用ELISA法檢測，嚴格按照大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒說明書進行操作；使用酶標(biāo)儀檢測波長450 nm處的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算大鼠血清及頸椎間盤關(guān)節(jié)液上清中IL-6、IL-1β、TNF-α表達水平。

1.3.6 Western blot法檢測4組大鼠頸椎間盤滑膜組織中NLRP3、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白相對表達量取4組大鼠-80 ℃冰箱保存的頸椎間盤滑膜組織，于勻漿器中盡量剪碎，加入裂解液于冰上裂解，采用BCA法測定蛋白濃度。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，加入脫脂牛奶封閉1 h；加入NLRP3(11 000)、p-NF-κB p65(11 000)、NF-κB p65(11 000)一抗，4 ℃孵育過夜。加入免疫印跡熒光標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(13 000)，37 ℃孵育 40 min。滴加ECL顯色液，暗室中曝光、顯影，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行圖像采集，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值比值表示目的蛋白相對表達量，并計算p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白相對表達量比值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠造模后一般情況造模后第4周時，共3只大鼠死亡(假手術(shù)組1只、低劑量花椒毒酚組2只)，其余大鼠的總體生長狀態(tài)良好，毛發(fā)密實、光亮順滑。模型組大鼠活動量略少，動作不如其他3組敏捷，呼吸幅度略顯急促。

2.2 4組大鼠頸椎間盤滑膜組織病理學(xué)變化結(jié)果見圖1。假手術(shù)組大鼠的椎間盤滑膜組織結(jié)構(gòu)完整，滑膜細胞排列整齊，未見顯著炎癥細胞浸潤、充血及水腫；模型組大鼠可見滑膜組織結(jié)構(gòu)顯著增生、腫脹，表層細胞呈柵欄樣排列，廣泛存在炎癥細胞浸潤及脂肪組織填充；低劑量花椒毒酚組大鼠可見滑膜組織內(nèi)炎癥細胞浸潤，程度較模型組顯著減輕，可見纖維化改變，間質(zhì)內(nèi)可見脂肪組織填充；高劑量花椒毒酚組未見明顯炎癥細胞浸潤，增生及腫脹程度較低劑量花椒毒酚組緩解，纖維化不明顯，間質(zhì)內(nèi)填充脂肪組織減少。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：低劑量花椒毒酚組；D：高劑量花椒毒酚組。

2.3 4組大鼠運動功能比較結(jié)果見表1。造模前，4組大鼠的改良Rivlin實驗最大傾斜角度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.785,P>0.05)。造模后第4周，假手術(shù)組大鼠的改良Rivlin斜板實驗最大傾斜角度與造模前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模后第4周，模型組、低劑量花椒毒酚組、高劑量花椒毒酚組大鼠的改良Rivlin斜板實驗最大傾斜角度均顯著低于造模前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。造模后第4周，4組大鼠的改良Rivlin斜板實驗最大傾斜角度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=26.055,P<0.05)。造模后第4周，模型組、低劑量花椒毒酚組、高劑量花椒毒酚組大鼠的改良Rivlin斜板實驗最大傾斜角度均顯著低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；低劑量花椒毒酚組、高劑量花椒毒酚組大鼠的改良Rivlin斜板實驗最大傾斜角度均顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；低劑量花椒毒酚組與高劑量花椒毒酚組大鼠的改良Rivlin實驗最大傾斜角度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 4組大鼠造模前后改良Rivlin斜板實驗最大傾斜角度比較

2.4 4組大鼠血清及頸椎間盤關(guān)節(jié)液中IL-6、IL-1β、TNF-α水平比較結(jié)果見表2。模型組、低劑量花椒毒酚組、高劑量花椒毒酚組大鼠血清及頸椎間盤關(guān)節(jié)液中IL-6水平均顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 4組大鼠血清及頸椎間盤關(guān)節(jié)液中IL-6、IL-1β、TNF-α水平比較

模型組、低劑量花椒毒酚組大鼠血清及頸椎間盤關(guān)節(jié)液中IL-1β水平均顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。低劑量花椒毒酚組大鼠血清中IL-1β水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。低劑量花椒毒酚組大鼠關(guān)節(jié)液中IL-1β水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。高劑量花椒毒酚組大鼠血清及頸椎間盤關(guān)節(jié)液中IL-1β水平均顯著低于低劑量花椒毒酚組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。高劑量花椒毒酚組大鼠血清及頸椎間盤關(guān)節(jié)液中IL-1β水平與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

模型組大鼠血清及頸椎間盤關(guān)節(jié)液中TNF-α水平均顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。低劑量花椒毒酚組大鼠頸椎間盤關(guān)節(jié)液中TNF-α水平顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。高劑量花椒毒酚組大鼠椎間盤關(guān)節(jié)液中TNF-α水平顯著低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。低劑量花椒毒酚組、高劑量花椒毒酚組大鼠血清及頸椎間盤關(guān)節(jié)液中TNF-α水平均顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。高劑量花椒毒酚組大鼠頸椎間盤關(guān)節(jié)液中TNF-α水平顯著低于低劑量花椒毒酚組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。低劑量花椒毒酚組、高劑量花椒毒酚組大鼠血清中TNF-α水平與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。高劑量花椒毒酚組大鼠血清中TNF-α水平與低劑量花椒毒酚組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 4組大鼠頸椎間盤滑膜組織中NLRP3蛋白相對表達量及p-NF-κB p65/NF-κB p65比較結(jié)果見圖2和表3。與假手術(shù)組比較，模型組和低劑量花椒毒酚組大鼠頸椎間盤滑膜組織中NLRP3蛋白相對表達量、p-NF-κB p65/NF-κB p65均顯著升高，高劑量花椒毒酚組大鼠頸椎間盤滑膜組織中NLRP3蛋白相對表達量、p-NF-κB p65/NF-κB p65顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。低劑量花椒毒酚組和高劑量花椒毒酚組大鼠頸椎間盤滑膜組織中NLRP3蛋白相對表達量、p-NF-κB p65/NF-κB p65均顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。高劑量花椒毒酚組大鼠頸椎間盤滑膜組織中NLRP3蛋白相對表達量顯著低于低劑量花椒毒酚組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。高劑量花椒毒酚組大鼠頸椎間盤滑膜組織中p-NF-κB p65/NF-κB p65與低劑量花椒毒酚組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：低劑量花椒量酚組；D：高劑花椒毒酚組。

表3 4組大鼠頸椎間盤滑膜組織中NLRP3蛋白相對表達量及p-NF-κB p65/NF-κB p65比較

3 討論

脊髓約70%的血液由脊髓前動脈及相應(yīng)溝動脈供給，脊髓前動脈位于髓體前正中，呈縱行走向，易受椎體骨突及退行性椎間盤壓迫，導(dǎo)致脊髓前動脈內(nèi)皮細胞受損，基底膜外露、血小板黏附，形成微小血栓阻塞管腔，造成脊髓內(nèi)微循環(huán)障礙[5,7]。隨著脊髓微血管循環(huán)障礙加重，脊髓功能受影響直至出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，這是CSM的主要發(fā)病機制。

BMP及其受體在頸椎間盤組織中呈特異性高表達，BMP可充分調(diào)節(jié)成骨細胞、成軟骨細胞、成纖維細胞等間充質(zhì)細胞的形成和凋亡，具有強大的異位骨化能力[8-9]。本研究通過在大鼠頸椎間盤后緣注射BMP促進增生骨化，從而模擬CSM的病理進程。造模后第4周，假手術(shù)組大鼠改良Rivlin斜板實驗最大傾斜角度與造模前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；模型組、低劑量花椒毒酚組、高劑量花椒毒酚組大鼠改良Rivlin斜板實驗最大傾斜角度均顯著低于造模前；提示注射BMP的模型組、低劑量花椒毒酚組、高劑量花椒毒酚組大鼠運動功能均顯著下降，表明該動物模型確實模擬了CSM所致的運動功能障礙。此外，低劑量花椒毒酚組、高劑量花椒毒酚組大鼠改良Rivlin斜板實驗最大傾斜角度均顯著高于模型組，低劑量花椒毒酚組與高劑量花椒毒酚組大鼠改良Rivlin斜板實驗最大傾斜角度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；表明花椒毒酚對于CSM所致運動功能障礙存在一定緩解作用，但并未發(fā)現(xiàn)花椒毒酚對運動功能的緩解作用存在劑量效應(yīng)。

炎癥因子活化是關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生炎癥浸潤反應(yīng)的主要原因，例如IL-1β不僅促進關(guān)節(jié)滑膜炎癥細胞浸潤，還能參與調(diào)節(jié)IL-6和TNF-α等炎癥因子水平；炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α可參與并激活白細胞附壁、血管通透性增加、滲出等炎癥反應(yīng)，顯著影響機體組織破壞、水腫、異常分化等多重病理進程[10]，在CSM病理進程中表現(xiàn)為促進炎癥細胞聚集并加速頸椎間盤退變[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血液及頸椎間盤關(guān)節(jié)液中的IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著高于假手術(shù)組，再次證實本研究動物模型造模成功。模型組、低劑量花椒毒酚組、高劑量花椒毒酚組大鼠血清及頸椎間盤關(guān)節(jié)液中IL-6水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；低劑量花椒毒酚組大鼠血清中IL-1β水平顯著低于模型組，高劑量花椒毒酚組大鼠血清及頸椎間盤關(guān)節(jié)液中IL-1β水平均顯著低于模型組和低劑量花椒毒酚組；低劑量花椒毒酚組、高劑量花椒毒酚組大鼠血清及頸椎間盤關(guān)節(jié)液中TNF-α水平均顯著低于模型組，高劑量花椒毒酚組大鼠頸椎間盤關(guān)節(jié)液中TNF-α水平顯著低于低劑量花椒毒酚組；提示予以不同劑量的花椒毒酚干預(yù)后，大鼠血液及關(guān)節(jié)液中的IL-1β和TNF-α水平均呈現(xiàn)不同程度的降低，且呈劑量依賴性，花椒毒酚可能通過抑制頸椎間盤軟骨釋放炎癥因子IL-1β和TNF-α，對大鼠CSM病理進程發(fā)揮一定的緩解作用。

炎癥反應(yīng)的典型表現(xiàn)為組織損傷及炎癥小體誘導(dǎo)的炎癥因子局部浸潤。炎癥小體是以NLRP3蛋白為主要成分的細胞質(zhì)多蛋白復(fù)合物，NLRP3蛋白不僅可誘導(dǎo)促炎細胞因子的生成，其異常激活可促使大量炎癥因子局部浸潤，導(dǎo)致組織損傷、軟骨破壞及異常分化[4,12]。因此，NLRP3蛋白水平與炎癥因子的浸潤程度密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠頸椎間盤滑膜組織中NLRP3蛋白相對表達量顯著高于假手術(shù)組，低劑量花椒毒酚組和高劑量花椒毒酚組大鼠頸椎間盤滑膜組織中NLRP3蛋白相對表達量均顯著低于模型組，高劑量花椒毒酚組大鼠頸椎間盤滑膜組織中NLRP3蛋白相對表達量顯著低于低劑量花椒毒酚組，提示花椒毒酚可通過抑制NLRP3蛋白水平，對大鼠CSM病理進程發(fā)揮一定的緩解作用，且呈劑量依賴性。

NF-κB通路作為調(diào)節(jié)機體多種生理過程的重要信號通路，不僅調(diào)節(jié)機體免疫、炎癥反應(yīng)及腫瘤等生理病理進程,還廣泛參與細胞周期調(diào)控、細胞分化及感染。NF-κB是一種常見的轉(zhuǎn)錄因子，由2類亞基形成同源或異源二聚體，最常見的NF-κB亞基組成形式為p65。NF-κB p65蛋白可通過磷酸化上調(diào)炎癥因子表達，活化炎癥進程，繼而在下游調(diào)節(jié)IL相關(guān)基因、凋亡抑制因子等表達介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組、低劑量花椒毒酚組、高劑量花椒毒酚組大鼠頸椎間盤滑膜組織中p-NF-κB p65/NF-κB p65均顯著低于假手術(shù)組，低劑量花椒毒酚組和高劑量花椒毒酚組大鼠頸椎間盤滑膜組織中p-NF-κB p65/NF-κB p65均顯著低于模型組，高劑量花椒毒酚組大鼠頸椎間盤滑膜組織中p-NF-κB p65/NF-κB p65與低劑量花椒毒酚組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示NF-κB信號通路激活可能促進CSM病理進程，花椒毒酚通過抑制NF-κB信號通路發(fā)揮其抗炎作用，但并未發(fā)現(xiàn)花椒毒酚對于NF-κB p65蛋白磷酸化存在劑量依賴性效應(yīng)。

有研究顯示，NF-κB與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路關(guān)系密切，均具有廣泛調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的分化作用[14]。NF-κB信號通路位于MAPK信號通路的下游，活化p38 MAPK激酶可促進炎癥細胞因子的表達，進而活化NF-κB，是MAPK信號途徑下游的重要位點之一。本研究顯示，花椒毒酚通過抑制NLRP3蛋白及下調(diào)NF-κB信號通路活性，發(fā)揮對頸椎間盤的保護作用，提示花椒毒酚發(fā)揮對CSM的緩解作用可能與MAPK信號通路有關(guān)，后期將進一步研究證實。

綜上所述，花椒毒酚可通過抑制大鼠血清及頸椎間盤關(guān)節(jié)液中的炎癥因子IL-1β、TNF-α水平緩解CSM病理進程，其機制可能與抑制大鼠頸椎間盤滑膜組織中NLRP3蛋白水平及下調(diào)NF-κB信號通路磷酸化有關(guān)。本實驗為今后CSM動物模型的深入研究及花椒毒酚的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。花椒毒酚對治療CSM是否存在確切劑量效應(yīng)仍需下階段進一步探尋。