王 俠，張忠新，任方龍，李瑞光，郭慶合，賀志安

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，河南省免疫與靶向藥物重點實驗室，河南省分子診斷與醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院檢驗科，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.鄭州愛微迪醫(yī)學(xué)檢驗實驗室有限公司，河南 鄭州 450019)

唑尼沙胺是一種新型廣譜抗癲癇藥物，可有效治療包括部分性發(fā)作、繼發(fā)性全身發(fā)作等多種類型的癲癇。有研究發(fā)現(xiàn)，唑尼沙胺可明顯改善帕金森病患者的臨床癥狀[1-2]，自2009年以來唑尼沙胺被推薦用于帕金森病的補充治療[3]。

唑尼沙胺在體內(nèi)吸收迅速，最大吸收時間2～6 h，生物利用度>95%。唑尼沙胺不會誘導(dǎo)自身的代謝，也不會抑制細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)；但苯妥英鈉、卡馬西平和巴比妥酸鹽會加速唑尼沙胺的代謝并降低其半衰期[4]；有研究顯示，唑尼沙胺可抑制苯妥英鈉在體內(nèi)的代謝[5]。唑尼沙胺可引起患者發(fā)生不良事件，最常見的有嗜睡(17%)、頭昏(13%)、厭食(13%)和頭痛(10%)[6]。唑尼沙胺還會影響某些癲癇患者延遲的單詞回憶、口語流利性，且具有劑量依賴性[7]。據(jù)報道，服用唑尼沙胺易致代謝性酸中毒[8]，因此，美國食品和藥物管理局要求抗癲癇藥物唑尼沙胺的生產(chǎn)廠商在其產(chǎn)品標(biāo)簽上增加有關(guān)該藥物存在代謝性酸中毒風(fēng)險的警告。另外，唑尼沙胺在不同性別、給藥次數(shù)的患者間藥物峰濃度存在差異，女性患者給藥后血藥濃度明顯高于男性，多次給藥后血藥濃度明顯大于單次給藥[9]。綜上所述，盡管唑尼沙胺利用度較高，但其藥物毒副作用可引發(fā)不良事件，與其他藥物共用時存在相互影響。因此，有必要對唑尼沙胺血藥濃度進行監(jiān)測，尤其對于女性，避免由于藥物濃度過大而引起不良反應(yīng)的增加，實現(xiàn)個體化用藥。

本研究參照國內(nèi)外相關(guān)方法，依據(jù)本實驗室條件，利用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)平臺建立了測定人血清中唑尼沙胺濃度的方法，并依據(jù)《中國藥典》2020 年版第四部通則中“生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則”[10]對該方法進行驗證，旨在為臨床上檢測唑尼沙胺血藥濃度及預(yù)防毒副作用的發(fā)生等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器純度 99.9%唑尼沙胺對照品、純度 99.3%苯代三聚氰胺對照品購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，分析純醋酸鉛購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純甲醇、乙腈購自美國Fisher公司；LC-20A HPLC儀、AUW220D十萬分之一分析天平購自日本島津公司，Centrifuge 5427R高速離心機購自德國Centrifuge Eppedorf公司，ST70-2恒溫振動器購自美國Thermo公司，PAL-CAXXBIOM2超純水機購自美國Pall corporation公司，OF1旋渦混合器購自上海琪特分析儀器有限公司，ACE UltraCore 2.5 SuperC18色譜柱(100.00 mm×3.00 mm)購自英國ACE公司。

1.2 唑尼沙胺標(biāo)液、質(zhì)控液和內(nèi)標(biāo)工作溶液配制

1.2.1 唑尼沙胺標(biāo)液的配制稱取唑尼沙胺標(biāo)準(zhǔn)品粉末125.68 mg，將其溶解于100 mL甲醇中，即可獲得1.256 8 g·L-1的唑尼沙胺儲備液。已知唑尼沙胺對照品純度為99.9%，唑尼沙胺儲備液真實質(zhì)量濃度為1.255 5 g·L-1。將唑尼沙胺儲備液使用甲醇逐級對半稀釋，連同唑尼沙胺儲備液一起，得到L6-L1系列濃度的標(biāo)液，質(zhì)量濃度分別為1 255.5、627.75、313.88、156.94、78.47、39.23 mg·L-1。

1.2.2 內(nèi)標(biāo)工作溶液的配制稱取苯代三聚氰胺對照品粉末216.09 mg，將其溶解于100 mL甲醇中，即可獲得質(zhì)量濃度為2.160 9 g·L-1的苯代三聚氰胺儲備液。吸取250 μL儲備液，用乙腈定容至100 mL，即可獲得質(zhì)量濃度為5.40 g·L-1的內(nèi)標(biāo)工作溶液。

1.2.3 不同濃度質(zhì)控液的配制取300 μL唑尼沙胺儲備液加入100 μL甲醇混勻即為高濃度質(zhì)控液；取200 μL唑尼沙胺儲備液加入200 μL甲醇混勻即為中濃度質(zhì)控液；取100 μL唑尼沙胺儲備液加入300 μL甲醇混勻，再從中取出100 μL加入甲醇300 μL 混勻即為低濃度質(zhì)控液；從低濃度質(zhì)控液中取200 μL加入200 μL甲醇混勻即為定量下限濃度質(zhì)控液。

1.3 色譜條件ACE UltraCore 2.5 SuperC18(100.00 mm×3.00 mm)色譜柱；流動相：A相為超純水，B相為純甲醇，梯度洗脫(0.01～5.00 min，18%～50%甲醇；5.00～5.50 min，50%～18%甲醇；5.50～7.50 min，18%甲醇)，流速0.6 mL·min-1，進樣量20 μL，柱溫30 ℃，檢測波長240 nm。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 方法的選擇性分別取6份未服用唑尼沙胺健康志愿者的血清為空白血清考察方法的選擇性，樣品處理方法：取100 μL空白血清，加入10 μL的400 g·L-1的醋酸鉛水溶液，再加入300 μL的乙腈，充分渦旋混勻1 min后放置10 min，25 ℃下12 000 r·min-1離心10 min。取100 μL上清液移至已加入100 μL超純水的96孔進樣板內(nèi)，25 ℃下500 r·min-1離心10 min，最后吸樣20 μL進行HPLC定量分析。以峰面積響應(yīng)值衡量干擾組分。接受標(biāo)準(zhǔn)：干擾組分響應(yīng)低于分析物定量下限響應(yīng)的20%，并低于內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%。

1.4.2 樣品殘留評價殘留的考察是通過高濃度樣品分析后即刻分析空白樣品來進行。高濃度樣品制備方法：取唑尼沙胺儲備液200 μL加入50 μL甲醇混勻，從中取10 μL加入到90 μL空白血清中，加入10 μL 400 g·L-1的醋酸鉛水溶液，再加入300 μL內(nèi)標(biāo)工作溶液，平行制備5份高濃度樣品?？瞻讟悠分苽浞椒ǎ喝?00 μL空白血清，加入10 μL 400 g·L-1的醋酸鉛水溶液，再加入300 μL乙腈。各樣品充分渦旋混勻1 min后放置10 min，25 ℃下12 000 r·min-1離心10 min。各取100 μL上清液移至已加入100 μL超純水的96孔進樣板內(nèi)，25 ℃下500 r·min-1離心10 min，最后吸樣20 μL進行HPLC定量分析。

1.4.3 線性評價精確吸取空白血清90 μL于1.5 mL EP管內(nèi)，分別加入L6-L1標(biāo)液10 μL、400 g·L-1醋酸鉛水溶液10 μL及內(nèi)標(biāo)工作溶液300 μL，充分渦旋混勻1 min后放置10 min，25 ℃下12 000 r·min-1離心10 min。取100 μL上清液移至已加入100 μL超純水的96孔進樣板內(nèi)，25 ℃下500 r·min-1離心10 min，最后吸樣20 μL進行HPLC定量分析。每份標(biāo)本重復(fù)檢測3次，評價儀器對唑尼沙胺分析物的響應(yīng)。通過已知濃度的分析物與儀器檢測分析物與內(nèi)標(biāo)面積并計算比值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 準(zhǔn)確度與精密度評價精確吸取空白血清 90 μL于1.5 mL EP管內(nèi)，分別加入各濃度質(zhì)控液10 μL、400 g·L-1醋酸鉛水溶液10 μL及 內(nèi)標(biāo)300 μL，充分渦旋混勻1 min后放置10 min，25 ℃下12 000 r·min-1離心10 min。取100 μL上清液移至已加入100 μL超純水的96孔進樣板內(nèi)，25 ℃下500 r·min-1離心10 min，最后吸樣20 μL進行HPLC定量分析。每個濃度平行5份。3個濃度質(zhì)控液每天測5次計算批內(nèi)精密度、準(zhǔn)確度，連續(xù)測定3 d計算批間精密度、準(zhǔn)確度。準(zhǔn)確度均值應(yīng)在質(zhì)控樣品標(biāo)示值的±15%范圍內(nèi)，定量下限應(yīng)在標(biāo)示值的±20%范圍內(nèi)。批內(nèi)、批間精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)不超過15%，定量下限RSD不超過20%[10]。

1.4.5 樣品穩(wěn)定性評價將配制好的唑尼沙胺儲備液加入到空白血清中，配成低質(zhì)量濃度(7.85 mg·L-1)和高質(zhì)量濃度(100.44 mg·L-1)血清質(zhì)控樣品。取90 μL空白血清加入1.5 mL EP管，分別加入各濃度質(zhì)控液10 μL，充分渦旋混勻1 min后放置10 min，25 ℃下12 000 r·min-1離心10 min。取100 μL上清液移至已加入100 μL超純水的96孔進樣板內(nèi)，25 ℃下500 r·min-1離心10 min，于室溫條件下放置24 h后吸樣20 μL進行HPLC定量分析，評價處理后樣本室溫放置24 h的穩(wěn)定性。將90 μL空白血清加入1.5 mL EP管內(nèi)，分別加入10 μL各濃度質(zhì)控液，混勻并密封，于室溫存放24 h后充分渦旋混勻1 min，放置10 min，25 ℃下12 000 r·min-1離心10 min。取100 μL上清液移至已加入100 μL超純水的96孔進樣板內(nèi)，25 ℃下500 r·min-1離心 10 min，最后吸樣20 μL進行HPLC定量分析。評價未經(jīng)處理樣品室溫放置24 h的穩(wěn)定性情況。取 1.5 mL EP管，加入90 μL空白血清，分別加入10 μL 各濃度質(zhì)控液，混勻并密封，于4 ℃冰箱中存放1周后充分渦旋混勻1 min，放置10 min，25 ℃下12 000 r·min-1離心10 min。取100 μL上清液移至已加入100 μL超純水的96孔進樣板內(nèi)，25 ℃下500 r·min-1離心10 min，最后吸樣20 μL進行HPLC定量分析，評價未經(jīng)處理樣品4 ℃存放1周的穩(wěn)定性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)描述。

2 結(jié)果

2.1 方法的選擇性結(jié)果見圖1。唑尼沙胺、苯代三聚氰胺的保留時間分別為3.63、4.78 min，唑尼沙胺及內(nèi)標(biāo)處干擾符合要求。

A：空白血清；B：苯代三聚氰胺；C：唑尼沙胺+苯代三聚氰胺；1：苯代三聚氰胺；2：唑尼沙胺。

2.2 樣品殘留評價各分析物在空白血清中的殘留與定量下限濃度峰面積比值均<20%，內(nèi)標(biāo)在空白中的殘留與定量下限濃度峰面積比值均<5%。殘留量均符合要求。

2.3 線性考察結(jié)果以唑尼沙胺質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x、唑尼沙胺峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)y，進行線性回歸得唑尼沙胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.024 480 4+0.011 778 5(R2=0.999)。線性考察結(jié)果，唑尼沙胺在3.92～125.55mg·L-1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.4 準(zhǔn)確度與精密度考察結(jié)果見表1。除唑尼沙胺在定量下限第2批的批內(nèi)準(zhǔn)確度為76.73%外，其余定量下限及低中高濃度的精密度與準(zhǔn)確度結(jié)果均符合要求。

表1 準(zhǔn)確度與精密度試驗結(jié)果

2.5 樣品穩(wěn)定性結(jié)果見表2。經(jīng)處理血清質(zhì)控品于室溫存放24 h，其準(zhǔn)確度穩(wěn)定；未經(jīng)處理血清質(zhì)控品樣品于室溫下存放24 h、4 ℃下放置1周，準(zhǔn)確度穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性考察結(jié)果

3 討論

近期國外有學(xué)者采用乳膠顆粒增強比濁免疫測定(latex particles enhanced turbidimetric immunoassay，LTIA)方法進行唑尼沙胺濃度的測定，結(jié)果顯示，在高濃度和低濃度下，HPLC與LTIA法定量的濃度之間無差異，但LTIA法可能無法確定血清水平維持在目標(biāo)范圍以下的患者血清唑尼沙胺的確切濃度，或者可能無法在治療藥物監(jiān)測中用于確認(rèn)依從性，當(dāng)LTIA方法顯示質(zhì)量濃度低于5 mg·L-1時，必須使用HPLC法確認(rèn)其確切的水平[11]。因此，HPLC依然是比較理想的唑尼沙胺檢測方法。

本實驗室利用HPLC平臺，建立了測定人血清中唑尼沙胺濃度的方法，并參照《中國藥典》2020 年版第四部通則中“9012 生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則”，對該方法進行了驗證。苯代三聚氰胺與唑尼沙胺結(jié)構(gòu)相似，分子量接近，其性質(zhì)穩(wěn)定、保留時間適當(dāng)，與唑尼沙胺峰無干擾，適用于唑尼沙胺色譜分析的內(nèi)標(biāo)。經(jīng)篩選，唑尼沙胺與苯代三聚氰胺在240 nm紫外吸收波長下響應(yīng)最強，無內(nèi)源性干擾。

本研究所用HPLC色譜為二元泵系統(tǒng)，具備梯度系統(tǒng)條件。筆者曾嘗試等度洗脫，峰寬和峰形皆不理想；采用梯度洗脫可改善峰寬和峰形拖尾，提高分析方法的靈敏度。因此實驗過程采用梯度洗脫法。據(jù)報道流動相多采用乙腈-磷酸二氫鈉溶液[12]、甲醇-水[13]、甲醇-乙腈-三氟乙酸水溶液[5]等，本實驗中流動相選擇A相為超純水和B相為純甲醇(18%～50%)，方法優(yōu)化中嘗試過不同組成的流動相(加改性劑如甲酸、加乙酸銨等，不同比例甲醇水以及乙腈水等)，但分離效果均不理想。使用純水-甲醇作為流動相的分離效果最佳且保留時間重復(fù)性高、峰寬小且對稱性好，并且與宣貴達(dá)等[13]所采用的甲醇水(8020)相比，降低了有機溶劑用量、試劑成本，可延長色譜柱壽命。

HPLC測定唑尼沙胺血藥濃度對于蛋白沉淀有乙腈[11]、甲醇[5]、硫酸鋅甲醇沉淀蛋白法[12]，其操作繁瑣或耗時。本研究采用兩步法，即乙腈和醋酸鉛沉淀蛋白法。將內(nèi)標(biāo)溶液與乙腈混合后獲得內(nèi)標(biāo)工作溶液，此過程同時添加了內(nèi)標(biāo)和蛋白沉淀劑，使操作步驟簡化，且相同體積的乙腈沉淀蛋白效果明顯優(yōu)于甲醇，因此，經(jīng)少量(300 μL)內(nèi)標(biāo)工作液處理后，蛋白沉淀效果即可滿足實驗需求。醋酸鉛作為沉淀蛋白沉淀劑，不僅可降低有機溶劑的使用量，提高分析方法的靈敏度，而且相比其他重金屬溶劑沉淀蛋白，醋酸鉛的污染輕，且與蛋白形成復(fù)合物可作為醫(yī)療垃圾處理。筆者曾嘗試硫酸銨等鹽溶液輔助沉淀蛋白，但效果均不理想。因此，加入醋酸鉛后蛋白沉淀更加完全，干擾少，離心后即可上機檢測，完成1個標(biāo)本的檢測僅需7.5 min，較韋斯軍等[12]的9.1 min更迅速。另外本法樣本用量少，使用超純水稀釋后進行分析，降低了樣品的揮發(fā)，同時改善了峰形。因此，本方法具有簡單、快速、結(jié)果準(zhǔn)確的特點，可實現(xiàn)高通量樣本的快速測定。

綜上所述，本研究建立了測定唑尼沙胺血藥濃度的HPLC分析方法，其干擾少、低殘留，準(zhǔn)確度高、精密度好，線性關(guān)系良好，滿足臨床檢測需求。本法樣本適應(yīng)性好，穩(wěn)定性高，分析物處理后室溫可放置24 h，未處理樣品可穩(wěn)定存放于室溫24 h、4 ℃ 1周。因此，在規(guī)定時間內(nèi)可保證檢測結(jié)果能準(zhǔn)確地反映患者采樣時的藥物濃度，從而滿足實驗室因標(biāo)本量大需分批檢測的要求。本法操作簡便，所需血清僅100 μL，可小樣本送檢，適宜唑尼沙胺藥物濃度常規(guī)監(jiān)測，便于樣本集中處理。