錢守元，周澤鵬，郁彬琦，劉青，靳翠麗，周曉見

（揚(yáng)州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127）

關(guān)鍵字：布朗葡萄藻，油脂，生長，營養(yǎng)供給。

化石能源日益緊缺，生物能源作為可再生能源的重要種類，被寄予厚望。微藻光合作用捕獲固定大氣CO2，富含脂肪、蛋白、多糖、類胡蘿卜素，被認(rèn)為是第三代生物能源開發(fā)的重要種類，具有良好的綜合開發(fā)前景[1,2]。布朗葡萄藻Botryococcus braunii細(xì)胞脂肪含量高，還特別具有大量儲(chǔ)存碳?xì)浠衔铮愂蜔N類產(chǎn)物）的能力，可以不經(jīng)過酯交換反應(yīng)而直接精煉獲得石油烴，被認(rèn)為是最有開發(fā)前景的生產(chǎn)生物燃料的微藻之一[3,4]。

目前，布朗葡萄藻規(guī)?；囵B(yǎng)還面臨一些問題，主要是藻細(xì)胞生長緩慢、倍增時(shí)間長，生產(chǎn)成本高。微藻生物柴油工業(yè)化發(fā)展進(jìn)程中，高成本問題一直是普遍性的嚴(yán)重制約因素[5]。尋求合理的營養(yǎng)供給條件、提高細(xì)胞增殖速度、獲得優(yōu)良的產(chǎn)出效率，是實(shí)現(xiàn)布朗葡萄藻大規(guī)模培養(yǎng)的首要基礎(chǔ)性問題。營養(yǎng)供給條件也涉及到培養(yǎng)液配制的材料和人工成本。本文通過比較代表性的富、中、貧營養(yǎng)水平對(duì)布朗葡萄藻營養(yǎng)供給形式的效果，分析各營養(yǎng)供給方式對(duì)細(xì)胞增殖速度和物質(zhì)生產(chǎn)的影響，以期為布朗葡萄藻的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 藻種來源

試驗(yàn)用布朗葡萄藻Botryococcus braunii 購自中國科學(xué)院野生生物種質(zhì)庫淡水藻種庫，種株標(biāo)號(hào)為FACHB-1106。

1.2 培養(yǎng)條件和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

用營養(yǎng)供給水平不同的四種代表性的營養(yǎng)條件培養(yǎng)布朗葡萄藻，包括富營養(yǎng)的BG-11 培養(yǎng)基、貧營養(yǎng)的f/2 培養(yǎng)基、以及營養(yǎng)水平中等的改良Chu 培養(yǎng)基和SE 培養(yǎng)基，并按照萬晶晶等的方法，將各培養(yǎng)基中的各成分劃分為大量元素、微量元素和維生素三大類，各培養(yǎng)供給情況如表1[6]。

表1 不同營養(yǎng)條件下的營養(yǎng)供給（培養(yǎng)液中終濃度/mg·L-1）Tab.1 Nutrient supply under different nutrient conditions（final concentration in culture solution/mg·L-1）

用一次性培養(yǎng)方式（18 d）。各培養(yǎng)體系在250 mL 三角瓶中的無菌培養(yǎng)液體積均為150 mL，取對(duì)數(shù)生長期藻種接種，初始OD690均控制在0.02 左右（200 μL，透明96 孔板）。光暗比12h∶12h，光照強(qiáng)度4 000 lx；溫度：（25±2）℃；搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速100 r/min。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 細(xì)胞生長的測(cè)定

每72 h 取200 μL 搖勻的布朗葡萄，藻加入透明96 孔板，用Microplate Reader 酶標(biāo)儀測(cè)定OD690，根據(jù)OD690繪制生長曲線。計(jì)算藻的比生長速率（μ），計(jì)算方法如下：

其中，μ 是比生長速率（d-1）；（OD690）t和（OD690）0分別表示t 時(shí)刻和培養(yǎng)開始時(shí)的OD690；t 為培養(yǎng)時(shí)間[7]。

1.3.2 細(xì)胞物質(zhì)含量的測(cè)定

采用干重法測(cè)定最終生物量[8]，氯仿/甲醇抽提法測(cè)定藻總脂含量[9]，正己烷抽提法測(cè)定總烴含量[10]。采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定藻細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量[11]，苯酚—硫酸法測(cè)總糖含量[12]。采用丙酮提取法測(cè)定藻細(xì)胞的光合色素含量[13]。具體方法如下：

取藻液110 mL 于4 000 r/min 離心10 min，用蒸餾水洗滌，去除上清，收集沉淀的藻泥。將藻泥移入樣品瓶中，放入LABCONCO 凍干機(jī)，-40℃真空凍干24 h，再40℃真空干燥0.5 h，得干藻粉稱重，為最終生物量干重。

稱取干藻粉15 mg，加0.8 mL 蒸餾水震蕩混勻，加入1 mL 氯仿、2 mL 甲醇，震蕩混勻；超聲破碎10 min，再加入1 mL 氯仿、1 mL 純水，震蕩混勻，于4 000 r/min 速度下離心10 min，保留下層氯仿層，加入等體積蒸餾水，離心，重復(fù)兩次。將下層氯仿層轉(zhuǎn)移到試管中，常溫吹干，40℃烘箱烘干0.5 h，稱重得到總脂的重量（干重），用總脂干重占生物量干重的百分比表示總脂含量。

每個(gè)裝有總脂的試管中加入5 mL 正己烷，震蕩使其充分溶解，離心，取上清正己烷可溶組，常溫吹干，40℃烘箱烘干0.5 h，稱重得總烴的質(zhì)量，用總烴占干藻粉質(zhì)量的百分比表示總烴含量。

取藻液10 mL，于4 000 r/min 離心10 min，去除上清液，用蒸餾水定容至10 mL。冰浴超聲破碎細(xì)胞（700 w，超聲5 s，間隔3 s）。再次離心，取上清液1 mL，加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)染色液，靜置反應(yīng)5 min，在595 nm 處測(cè)定吸光值。根據(jù)同時(shí)測(cè)定的牛血清蛋白濃度和OD595的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到蛋白質(zhì)濃度，再轉(zhuǎn)換為占干重的百分比表示可溶性蛋白質(zhì)含量。

取可溶性蛋白質(zhì)測(cè)定中處理好的上清液0.5 mL，分別加入6%的苯酚300 μL 和濃硫酸1.5 mL，震蕩均勻，室溫放置20 min，在490 nm 處測(cè)定吸光值，根據(jù)同時(shí)測(cè)定的葡萄糖濃度和OD490的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到總糖濃度，再轉(zhuǎn)換為占干重的百分比表示總糖含量。

取5 mL 藻液，4 000 r/min 離心10 min，收集沉淀，加入100%丙酮5 mL 并在4℃冰箱過夜。搖勻后4 000 r/min 離心10 min，收集上清液，分別在644 nm、661 nm 和470 nm 處測(cè)量光密度，根據(jù)公式計(jì)算葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素總量，再將色素總量轉(zhuǎn)換為占干重的百分比表示色素含量[13]。計(jì)算葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素總量的公式為：

1.3.3 物質(zhì)產(chǎn)率的計(jì)算

各物質(zhì)的產(chǎn)率計(jì)算公式為：

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，數(shù)據(jù)采用IBMSPSS 22 軟件分析。用單因素ANOVA 分析四種培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果。對(duì)方差分析顯著的因素，利用最小顯著差數(shù)法（LSD 法）或者Dunnett’s T3 進(jìn)行多重比較。各分析指標(biāo)差異顯著性以P=0.05（以小寫字母標(biāo)注）或0.01（以大寫字母標(biāo)注）作為標(biāo)準(zhǔn)[14]。采用Microsoft Excel 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 營養(yǎng)條件對(duì)布朗葡萄藻生長的影響

在培養(yǎng)的18 d 內(nèi)，布朗葡萄藻在四種營養(yǎng)條件下都能生長（圖1）。雙因素方差分析和多重比較發(fā)現(xiàn)，在0～18 d 的培養(yǎng)過程中，BG-11 培養(yǎng)效果顯著優(yōu)于其他三種培養(yǎng)基（P=0.01）。對(duì)各培養(yǎng)天數(shù)的OD 值進(jìn)行單因素方差分析和多重比較發(fā)現(xiàn)，從第9 d 后各營養(yǎng)條件下的生長情況差異逐漸顯現(xiàn)（P=0.05），12 d 時(shí)BG-11 的優(yōu)勢(shì)極顯著（P=0.01）。18 d 內(nèi)的比生長速率表明，布朗葡萄藻在BG-11 培養(yǎng)基中生長速度最快，比生長速率達(dá)到0.102（d-1），極顯著高于其他三種培養(yǎng)基（P=0.01）。四種培養(yǎng)基中藻的比生長速率從大到小的順序是：BG-11＞SE＞Chu＞f/2（圖2-I）。收獲時(shí)BG-11、Chu 和f/2 三種培養(yǎng)基中的布朗葡萄藻最終生物量干重差距不大，其中BG-11 培養(yǎng)基中布朗葡萄藻干重最高，達(dá)到329.3 mg/L，而SE 培養(yǎng)基中藻的干重最低，只有228.3 mg/L，顯著低于其他三種培養(yǎng)基（P=0.05）（圖2-II）。

圖1 營養(yǎng)條件對(duì)布朗葡萄藻生長的影響Fig.1 The effect of nutritional conditions on the growth of alga Botryococcus braunii

圖2 營養(yǎng)條件對(duì)布朗葡萄藻比生長速率（I）和干重（II）的影響Fig.2 The effect of nutritional conditions on the specific growth rate（I）and dry weight（II）of alga B.braunii

2.2 營養(yǎng)條件對(duì)布朗葡萄藻細(xì)胞物質(zhì)生產(chǎn)與積累的影響

2.2.1 細(xì)胞總脂、總烴生產(chǎn)與積累的比較

在四種不同營養(yǎng)條件供給狀態(tài)下培養(yǎng)18 d 后，布朗葡萄藻細(xì)胞生產(chǎn)和積累的總脂（P=0.05）、總烴（P=0.01）均有顯著性差異（圖3）。f/2 培養(yǎng)基總脂含量最高，達(dá)到35.6%，BG-11 培養(yǎng)基總脂含量最低，只有22.6%。四種培養(yǎng)基中藻的總脂含量從大到小依次為：f/2＞Chu＞SE＞BG-11（圖3-I）。布朗葡萄藻的總烴含量最高值也出現(xiàn)在f/2 培養(yǎng)基，達(dá)到17.6%，在BG-11 培養(yǎng)基中最低，只有5.9%。四種培養(yǎng)基中藻的總烴含量從大到小依次為：f/2＞SE＞Chu＞BG-11（圖3-II）。

圖3 營養(yǎng)條件對(duì)布朗葡萄藻的總脂（I）和總烴含量（II）的影響Fig.3 The effect of nutritional conditions on the total lipid（I）and total hydrocarbon contents（II）of alga B.braunii

2.2.2 細(xì)胞可溶性蛋白質(zhì)和總糖生產(chǎn)與積累的比較

布朗葡萄藻生產(chǎn)和積累的可溶性蛋白質(zhì)受營養(yǎng)條件的影響不大（圖4）。培養(yǎng)18 d 后，四種培養(yǎng)基中的布朗葡萄藻細(xì)胞內(nèi)積累的可溶性蛋白質(zhì)都在11.5%～13.1%之間，各組間差異性不顯著（P=0.05）（圖4-I）。而總糖積累受培養(yǎng)基的影響很明顯，BG-11 培養(yǎng)基中總糖含量顯著高于其他三種培養(yǎng)基（P=0.01），最高值達(dá)7.1%，是其他三種培養(yǎng)基總糖含量的近2 倍（圖4-II）。

圖4 營養(yǎng)條件對(duì)布朗葡萄藻的可溶性蛋白質(zhì)（I）和總糖（II）積累的影響Fig.4 The effect of nutritional conditions on the accumulation of soluble protein（I）and total sugar（II）in B.braunii

2.2.3 細(xì)胞主要色素生產(chǎn)與積累的比較

布朗葡萄藻的色素積累受培養(yǎng)基營養(yǎng)水平影響較大，細(xì)胞內(nèi)的主要色素、葉綠素a 和類胡蘿卜素的生產(chǎn)和積累都有所差異。布朗葡萄藻細(xì)胞的類胡蘿卜素含量遠(yuǎn)高于葉綠素a 含量。四種培養(yǎng)基中的葉綠素a 含量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.05），但f/2 培養(yǎng)基中的葉綠素a 含量較高，能達(dá)到0.2%（圖5-I）。四種培養(yǎng)基中生長的布朗葡萄藻的類胡蘿卜素含量差異顯著（P=0.05），f/2 培養(yǎng)基最高，含量達(dá)0.21%，BG-11 和Chu 的的類胡蘿卜素含量也都接近0.14%，而SE 培養(yǎng)基中的類胡蘿卜素含量很低，只有0.12%（圖5-II）。f/2 培養(yǎng)基中的布朗葡萄藻的葉綠素a 含量、類胡蘿卜素含量都最高，SE 培養(yǎng)基中的布朗葡萄藻兩種主要色素的含量都最低（圖5）。

圖5 營養(yǎng)條件對(duì)布朗葡萄藻葉綠素a（I）和類胡蘿卜素（II）積累的影響Fig.5 The effect of nutritional conditions on the accumulation of chlorophyll a（I）and carotenoids（II）in alga B.braunii

2.3 布朗葡萄藻各物質(zhì)產(chǎn)率的比較

藻細(xì)胞的物質(zhì)產(chǎn)率取決于單位時(shí)間內(nèi)單位體積培養(yǎng)體系的生產(chǎn)和積累能力，是培養(yǎng)體系中細(xì)胞總數(shù)量以及單個(gè)細(xì)胞物質(zhì)生產(chǎn)和積累能力的綜合體現(xiàn)。在不同營養(yǎng)條件下，布朗葡萄藻各物質(zhì)產(chǎn)率的比較如表2 所示。

表2 營養(yǎng)條件對(duì)布朗葡萄藻各物質(zhì)產(chǎn)率的影響/mg·（L·d）-1Tab.2 The effect of nutritional conditions on the yield of various substances in alga B.braunii/mg·（L·d）-1

從脂類產(chǎn)率看，BG-11、Chu 和f/2 三種營養(yǎng)條件差異不大，總脂產(chǎn)率最高的是f/2 培養(yǎng)基，高達(dá)575.64 mg/（L·d），產(chǎn)率最低的是SE 培養(yǎng)基，顯著低于上述三種培養(yǎng)基（P=0.05），總脂產(chǎn)率不足f/2 培養(yǎng)基的60%。從總烴產(chǎn)率看，產(chǎn)率最高的是f/2 培養(yǎng)基，高達(dá)286.87 mg/（L·d）。產(chǎn)率最低的是BG-11 培養(yǎng)基，顯著低于上述三種培養(yǎng)基（P=0.05），總烴產(chǎn)量不足f/2 培養(yǎng)基的40%。SE 培養(yǎng)基的可溶性蛋白質(zhì)產(chǎn)率最低，只有151.10 mg/（L·d），顯著低于其他三種培養(yǎng)基（P=0.05）。最高的是BG-11 培養(yǎng)基，能夠達(dá)到234.77 mg/（L·d）。BG-11 培養(yǎng)基的總糖產(chǎn)率顯著高于其他三種培養(yǎng)基（P=0.01），能夠達(dá)到128.21 mg/（L·d）。葉綠素a 的產(chǎn)率和類胡蘿卜素產(chǎn)率相似，都是f/2 培養(yǎng)基顯著高于其他處理組，f/2 培養(yǎng)基中葉綠素a 和類胡蘿卜素的產(chǎn)率可達(dá)3.27 mg/（L·d）和3.41 mg/（L·d）。總脂、總烴、總類胡蘿卜素和葉綠素a 四種物質(zhì)的產(chǎn)率都是f/2 培養(yǎng)基最高。水溶性蛋白質(zhì)和總糖的產(chǎn)率，BG-11 培養(yǎng)基則最高。

2.4 營養(yǎng)供給對(duì)布朗葡萄藻生產(chǎn)的投入產(chǎn)出的比較

BG11 培養(yǎng)基提供的營養(yǎng)成分總濃度最高，達(dá)到1689.4100mg/L，而f/2 培養(yǎng)基最低，僅85.9911mg/L，二者相差近19.65 倍。SE 培養(yǎng)基和Chu 培養(yǎng)基的外加營養(yǎng)成分總濃度居中，分別為635.4670 mg/L 和394.0615 mg/L（表1）。所獲得的總細(xì)胞干重（mg/L）/營養(yǎng)成分總投入（mg/L）（圖6-I）和總脂產(chǎn)量（mg/L）/營養(yǎng)成分總供給（mg/L）（圖6-II）表明，f/2 培養(yǎng)基的細(xì)胞干重產(chǎn)出/營養(yǎng)投入的比值顯著高于其他三種培養(yǎng)基（P=0.01），達(dá)到3.387，是最低的BG11 組（比值為0.195）的17.37 倍。同樣，f/2 組的總脂產(chǎn)出/營養(yǎng)投入的比值為1.205，也顯著高于其他三種培養(yǎng)基（P=0.01），是最低組BG11（比值為0.045）的26.78倍。

圖6 營養(yǎng)成分供給對(duì)布朗葡萄藻細(xì)胞干重（I）和總脂（II）投入產(chǎn)出效率的影響Fig.6 The effect of nutrient supply on the input-output efficiency of cell dry weight（I）and total lipid（II）in alga B.braunii

3 討論

微藻的生長與培養(yǎng)體系的營養(yǎng)元素供給密切相關(guān)，每種藻類對(duì)營養(yǎng)的需求也不同[2]。本文研究了基于BG-11、Chu、f/2 和SE 四種配方的營養(yǎng)供給條件下，布朗葡萄藻的生長。按照大量元素、微量元素和維生素的含量，這四種培養(yǎng)基大致可分為三類：富營養(yǎng)（BG-11）、中營養(yǎng)（Chu 和SE）和貧營養(yǎng)（f/2）三類。其中BG-11 的N、P、Fe、微量元素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他三種培養(yǎng)基，尤其是N 分別為Chu、SE 和f/2的7.5 倍、6 倍和20 倍；它還含有獨(dú)有的無機(jī)C 源（Na2CO3），可能促進(jìn)藻細(xì)胞迅速繁殖[14]。因此，將BG-11 劃分為富營養(yǎng)培養(yǎng)基，其總營養(yǎng)成分約為1.69 g/L，也是成本較高的培養(yǎng)基。Chu 和SE 的大量元素含量居中，總營養(yǎng)成分分別約為0.39 g/L 和0.64 g/L，是中營養(yǎng)培養(yǎng)基。f/2 培養(yǎng)基的大量元素含量最低，不僅N 只有BG-11 的1/20，P 和Fe 的含量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他培養(yǎng)基，總營養(yǎng)成分添加量僅0.09 g/L，是貧營養(yǎng)培養(yǎng)基。選用的四種培養(yǎng)基都廣泛用于藻類培養(yǎng)，也常用于培養(yǎng)布朗葡萄藻[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基營養(yǎng)元素在本實(shí)驗(yàn)使用的濃度范圍內(nèi)的貧富程度決定了布朗葡萄藻的生長速度。富營養(yǎng)培養(yǎng)基如BG-11 比生長速率大，貧營養(yǎng)培養(yǎng)基如f/2，比生長速率小，中營養(yǎng)培養(yǎng)基的比生長速率居中。單個(gè)藻細(xì)胞中的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)性物質(zhì)如蛋白質(zhì)的生產(chǎn)和積累受營養(yǎng)供給的影響小，而總脂、總烴、總糖和類胡蘿卜素等儲(chǔ)存性物質(zhì)的含量受影響顯著。貧營養(yǎng)培養(yǎng)基f/2 更有利于布朗葡萄藻積累儲(chǔ)存性物質(zhì)，其總脂、總烴和類胡蘿卜素含量都最高。富營養(yǎng)培養(yǎng)基BG-11 不利于總脂和總烴的積累，但總糖含量卻最高。碳水化合物與油脂是生物體內(nèi)兩種不同形式的儲(chǔ)能物質(zhì)。大多數(shù)微藻細(xì)胞處于營養(yǎng)脅迫狀態(tài)下，會(huì)將光合作用合成的碳源更多地向脂肪酸或中性脂方向轉(zhuǎn)化，原因是脂肪的能量要高于碳水化合物[16]。營養(yǎng)供給的不足改變?cè)孱惖拇x通路，加強(qiáng)脂類合成和積累，可以增加藻類細(xì)胞中的甘油三酯（TAG）等油脂占比[17,18]。所以，貧營養(yǎng)供給有利于儲(chǔ)存性脂類積累。相反，在營養(yǎng)充分的條件下，藻類將合成的有機(jī)碳偏向消耗性糖類[16]。

從物質(zhì)產(chǎn)率而言，除了細(xì)胞干重主要取決于生長速度。其他的物質(zhì)產(chǎn)率均取決于生長速度和物質(zhì)含量兩方面的綜合效益。富營養(yǎng)的BG-11 有利于積累生物量，但不利于積累儲(chǔ)存性物質(zhì)；貧營養(yǎng)的f/2雖然生物量低，但細(xì)胞積累的儲(chǔ)存性物質(zhì)含量很高。而最終物質(zhì)產(chǎn)率的高低取決于細(xì)胞干重和物質(zhì)含量的乘積。所以，雖然富營養(yǎng)的BG-11 獲得的細(xì)胞干重顯著高于貧營養(yǎng)的f/2，但其總脂含量、總烴含量、總類胡蘿卜素含量分別僅為后者的0.63、0.34和0.71 倍，導(dǎo)致BG-11 培養(yǎng)的藻細(xì)胞總脂產(chǎn)率最低。從色素含量上看，f/2 培養(yǎng)基中布朗葡萄藻的葉綠素a 和總類胡蘿卜素含量都最高，其光合潛力也高于其他處理[16]，導(dǎo)致貧營養(yǎng)培養(yǎng)基f/2 更適合于布朗葡萄藻儲(chǔ)存性物質(zhì)的生產(chǎn)。由圖6 可知，單位質(zhì)量的營養(yǎng)投入，所獲得的最終細(xì)胞干重和總脂的產(chǎn)出都是f/2 最高。所以，從營養(yǎng)物質(zhì)供給的投入產(chǎn)出效率上來講，f/2 也是最優(yōu)的選擇。

為了獲得大量生物質(zhì)油脂產(chǎn)出，需要使微藻處于低營養(yǎng)的脅迫環(huán)境，促使細(xì)胞積累油脂，但不可避免地引起細(xì)胞生長速度受限。為解決這類矛盾，二段培養(yǎng)可能是解決途徑，第一階段為微藻提供最佳的生長條件，專注于獲得最大生物量；第二階段把充分生長的微藻轉(zhuǎn)移到寡營養(yǎng)條件下，專注于油脂生產(chǎn)[1]。在布朗葡萄藻二段培養(yǎng)中，建議第一階段選擇如BG-11 的富營養(yǎng)培養(yǎng)基，第二階段選擇如f/2 的貧營養(yǎng)培養(yǎng)基。