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基于微衛(wèi)星標(biāo)記的圖們江大麻哈魚遺傳多樣性分析

2021-11-19 05:36閆春梅鄭偉高春山韓葉李忠強(qiáng)李秀穎
水產(chǎn)學(xué)雜志 2021年5期
關(guān)鍵詞:多態(tài)圖們江雜合

閆春梅,鄭偉,高春山,韓葉,李忠強(qiáng),李秀穎

(吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院,長春 吉林 130033)

大麻哈魚Oncorhychus keta 屬鮭形目Salmoniformes 鮭科Salmonidae 太平洋鮭屬Oncorhynchus的冷水性洄游魚類[1],在中國分布于黑龍江、圖們江、烏蘇里江、松花江、琿春河、密江、綏芬河、嫩江、牡丹江以及臺(tái)灣省的大甲溪等水系。水利工程阻礙了大麻哈魚洄游通道,破環(huán)了自然產(chǎn)卵場(chǎng)和索餌場(chǎng),大麻哈魚自然種群數(shù)量急劇下降,2007 年被列入《中國國家重點(diǎn)保護(hù)經(jīng)濟(jì)水生動(dòng)植物資源名錄(第一批)》,多年來依靠人工增殖放流補(bǔ)充其自然資源量。近年來,有關(guān)大麻哈魚的群體年齡組成及生長性狀[2-4]、繁殖力[5-7]、種群結(jié)構(gòu)[8-11]、生物學(xué)性狀[12-14]及放流標(biāo)記方法[15-17]和放流效果評(píng)估[18,19]等已有研究。但人工增殖放流活動(dòng)對(duì)圖們江大麻哈魚野生自然種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的影響未見報(bào)道。

遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)的分析是評(píng)估種質(zhì)資源現(xiàn)狀的主要途徑和種質(zhì)保護(hù)的核心內(nèi)容,也是增殖放流工作的重要環(huán)節(jié),具有重要的作用[20]。用于增殖放流的群體必須具有豐富的遺傳多樣性。在群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析過程中,微衛(wèi)星標(biāo)記法的分辨率高,可以檢測(cè)共顯性遺傳,已成為有效的熱門標(biāo)記手段[21-25]。本實(shí)驗(yàn)利用已發(fā)表的10 對(duì)微衛(wèi)星引物[26],分析了2015、2016、2017 及2018 年在圖們江采捕到的大麻哈魚親魚的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu),并分析人工增殖放流是否會(huì)影響大麻哈魚群體的遺傳多樣性,可為大麻哈魚種質(zhì)資源保護(hù)、恢復(fù)大麻哈魚野生自然群體資源量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用大麻哈魚樣品采捕于中國吉林省圖們江流域,總計(jì)169 尾,其中2015 年62 尾,2016 年29 尾,2017 年28 尾,2018 年50 尾,分別取鰭條樣本置于95%乙醇中備用。

1.2 基因組DNA 提取

用超純水沖洗鰭條樣本,去除殘余乙醇。晾干后剪碎,按照DNA 提取試劑盒(鼎國昌盛生物公司)說明書提取基因組DNA。經(jīng)OD260/280分析測(cè)定DNA 濃度后,稀釋至100 ng/μL,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR 擴(kuò)增

本研究所用10 對(duì)微衛(wèi)星引物均由本實(shí)驗(yàn)室開發(fā),引物多態(tài)性良好,GenBank 登錄號(hào)為MH619620-MH619629(表1)。由上海生物工程有限公司合成熒光引物。PCR 反應(yīng)體系中含有10×PCR Buffer 1 μL,dNTP 0.2 μL,MgCl20.4 μL,引物各0.2 μL,Ex Taq 酶0.04 μL,DNA 模板1 μL,ddH2O 補(bǔ)足至10 μL。94℃2 min,(94℃30 s,Tm 30 s,72℃30 s)5 個(gè)循環(huán),(94℃30 s,50℃30 s,72℃30 s)30 個(gè)循環(huán),72℃5 min。應(yīng)用3730xl 基因分析儀檢測(cè)PCR 產(chǎn)物。

表1 引物序列Tab.1 The sequences of primer used in the experiment

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用PopGen 32 軟件處理,計(jì)算等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、香農(nóng)信息指數(shù)(I)、Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)(P)、近交系數(shù)(Fis)、分化系數(shù)(Fst)和基因流(Nm)。采用PIC-CALC 計(jì)算平均多態(tài)信息含量(PIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 基因分型結(jié)果

利用10 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)169 尾大麻哈魚鰭條樣本進(jìn)行熒光PCR 反應(yīng),產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)血管電泳檢測(cè)后,根據(jù)熒光標(biāo)記的顏色,用軟件Genemapper 分析基因型,讀取單個(gè)大麻哈魚樣本在各個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型片段大?。▓D1)。

圖1 大麻哈魚微衛(wèi)星引物在個(gè)體中的等位基因峰圖Fig.1 Electropherogram peaks of microsatellite primers in chum salmon

2.2 遺傳多樣性

應(yīng)用10 對(duì)微衛(wèi)星引物估算了圖們江大麻哈魚2015、2016、2017 及2018 年4 個(gè)群體的Na、Ne、Ho、He、I 和H-W(表2)。由表2 可知,4 個(gè)年度群體中共檢測(cè)到Na 397 個(gè),Ne 為4.7853~6.1309,Ho 為0.6500~0.7200,He 為0.7663~0.8359,I 為1.8128~1.9836。利用PIC 計(jì)算軟件計(jì)算群體平均多態(tài)信息含量為0.7288~0.8017,均為高度多態(tài)(PIC>0.5)。

表2 4 個(gè)年度群體的10 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性分析Tab.2 Parameters of genetic diversity analyzed by ten loci in populations of chum salmon in four years

10 對(duì)微衛(wèi)星引物在4 個(gè)群體中進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn),所有位點(diǎn)均為多態(tài)位點(diǎn),其中符合H-W 平衡的位點(diǎn)有18 個(gè)(P>0.05),其他22 個(gè)位點(diǎn)偏離H-W 平衡(P<0.05)。

2.3 群體間遺傳結(jié)構(gòu)

2015—2018 四年的大麻哈魚群體的10 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記近交系數(shù)中,分別有8、7、9、5 個(gè)位點(diǎn)為正值,平均值為0.0298~0.1758。通過基因流(Nm)和群體間遺傳分化系數(shù)(Fst)分析可知(表3),Nm<1 的位點(diǎn)0 個(gè),1<Nm<4 的位點(diǎn)6 個(gè),其他4 個(gè)位點(diǎn)Nm>4。群體間平均遺傳分化系數(shù)為0.0755。

表3 10 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳分化系數(shù)及基因流Tab.3 Fst and gene flow of 10 polymorphic loci

這4 個(gè)年度大麻哈魚群體的遺傳相似系數(shù)為0.4505~0.8249,其中2015 年和2017 年群體遺傳相似系數(shù)最大(0.8249),2016 年和2018 年群體遺傳相似系數(shù)最?。?.4505)。遺傳距離為0.1925~0.7974,其中2016 年和2018 年群體遺傳距離最大(0.7974),2015 年和2017 年群體遺傳距離最?。?.1925)。

3 討論

3.1 圖們江大麻哈魚生殖洄游群體遺傳多樣性

本研究利用10 對(duì)已發(fā)表的高度多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)(PIC>0.5)分析了圖們江4 個(gè)年度大麻哈魚群體的遺傳結(jié)構(gòu)及多樣性。這些位點(diǎn)遺傳多樣性較豐富,適宜用于大麻哈魚群體的遺傳多樣性評(píng)估[26]。

表4 大麻哈魚4 個(gè)群體Nei 氏遺傳相似系數(shù)(上三角)及遺傳距離(下三角)Tab.4 Nei’s genetic identity(diagonal above)and genetic distance(diagonal below)in four groups of chum salmon

遺傳多樣性是種內(nèi)個(gè)體之間或一個(gè)群體內(nèi)不同個(gè)體的遺傳變異總和,是一個(gè)物種成功應(yīng)對(duì)人為干擾的決定因素。遺傳多樣性程度決定著其進(jìn)化趨勢(shì)[27]。本研究利用10 對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了圖們江大麻哈魚4 個(gè)年度生殖洄游群體的遺傳多樣性,主要分析了等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、雜合度、多態(tài)信息含量、香農(nóng)指數(shù)和Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)等。結(jié)果表明,4 個(gè)群體平均等位基因數(shù):9.7~10.6;平均有效等位基因數(shù):4.7853~6.1309;平均觀測(cè)雜合度為0.6500~0.7200,平均期望雜合度為0.7663~0.8359。雜合度是指隨機(jī)抽取的樣本中兩個(gè)等位基因不相同的可能性。期望雜合度主要是根據(jù)種群內(nèi)當(dāng)前優(yōu)勢(shì)等位基因的分布頻率來推算的。而觀測(cè)雜合度是隨機(jī)抽取的兩個(gè)樣本的等位基因不相同的概率。雜合度越高說明遺傳多樣性越豐富[28]。雖然圖們江大麻哈魚人工增殖放流活動(dòng)已開展十余年,但其群體遺傳多樣性仍較豐富,平均期望雜合度甚至略高于Chen 等[29]2005 年對(duì)圖們江流域大麻哈魚群體的評(píng)估結(jié)果。

平均多態(tài)信息含量(PIC)表示一個(gè)后代所獲得某個(gè)等位標(biāo)記來自其親本的同一個(gè)等位標(biāo)記的可能性,分為低度(<0.25)、中度(介于0.25~0.5 之間)和高度多態(tài)位點(diǎn)(>0.5)[30],通常用來評(píng)估遺傳多樣性豐度。據(jù)此,本研究中10 個(gè)微衛(wèi)星分析4 個(gè)圖們江大麻哈魚群體的平均多態(tài)信息含量為0.7288~0.8017,均大于0.5,屬于高度多態(tài)性群體。

Hardy-Weinberg 平衡條件是:無限大的群體;隨機(jī)婚配;沒有突變;沒有選擇;沒有遷移;沒有遺傳漂變(小群體內(nèi)基因頻率隨機(jī)波動(dòng))[31]。但實(shí)際應(yīng)用中,一般沒有完全符合理想情況的群體。用P 值衡量群體的基因型分布與H-W 平衡偏差的程度,P值越低表示偏差越大。本研究中可能樣本量不足、分型有誤或樣本選取偏差,40 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中僅29個(gè)符合H-W 平衡[32]。

3.2 圖們江大麻哈魚生殖洄游群體間遺傳結(jié)構(gòu)

基因流(Nm)和群體間遺傳分化系數(shù)(Fst)是用來分析群體間遺傳分化程度的兩個(gè)重要參數(shù)。Slatkin[33]和Hamrick[34]認(rèn)為,Nm 越小群體分化程度越大。本研究中10 個(gè)位點(diǎn)的平均Nm 值為3.0598,介于1~4 之間,表明群體間發(fā)生了一般程度的基因交流。

通常用Fst(Fixation index)來衡量群體之間的遺傳分化。Fst 為1 說明兩個(gè)群體完全獨(dú)立;0 說明兩個(gè)群體之間自由雜交。Fst 值越大,說明遺傳距離越遠(yuǎn);值越低,說明大多數(shù)的遺傳變異發(fā)生在同一個(gè)群體內(nèi)。Wright[35]建議,實(shí)際研究中,F(xiàn)st 小于0.05,可以忽略不計(jì);Fst 介于0.05~0.15 之間,表明遺傳分化程度中等;Fst 高于0.15 則遺傳分化程度較大。本實(shí)驗(yàn)Fst 為0.0755,說明約有92.45%的遺傳變異存在于種群內(nèi),7.55%的遺傳變異存在于種群間,屬中等程度的遺傳分化。群體內(nèi)近交系數(shù)為正值,表明群體內(nèi)近交明顯。

遺傳相似性和遺傳距離能夠衡量出群體間的遺傳關(guān)系[36]。本研究中,2015 年和2017 年群體遺傳相似系數(shù)最大(0.8249),遺傳距離最小(0.1925),親緣關(guān)系最近。相反,2016 年和2018 年群體遺傳相似系數(shù)最?。?.4505)。遺傳距離最大(0.7974),親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

為補(bǔ)充大麻哈魚種質(zhì)資源量,每年都開展大麻哈魚人工增殖放流活動(dòng),但由于放流群體和自然群體之間存在遺傳差異,勢(shì)必會(huì)對(duì)自然種群產(chǎn)生負(fù)面影響[37],必須建立科學(xué)合理的人工增殖放流體系,檢測(cè)人工增殖親本的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu),這對(duì)保障人工增殖放流效果具有重要意義。本研究表明:中國圖們江大麻哈魚生殖群體遺傳多樣性較高,具有一定的遺傳潛力,可作為選育群體。建議不同增殖群體可在不同流域交叉放流,使群體遺傳多樣性更加豐富,最大限度減少人工增殖放流對(duì)野生群體遺傳結(jié)構(gòu)及多樣性的影響[38]。

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