李拂曉，李冬龍，郭燕，王暉怡，李秋鳳，劉繼棟,2*

(1.廣西大學 輕工與食品工程學院，南寧 530004；2.廣西大學廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530004)

豆醬是一類利用微生物代謝降解基質(zhì)形成獨特風味的調(diào)味醬，具有咸、鮮等滋味。豆醬生產(chǎn)分為制醬與制曲兩大工藝步驟，其中制曲工藝由微生物代謝產(chǎn)生蛋白酶，制醬工藝通過長時間發(fā)酵將基質(zhì)降解為氨基酸，同時促進風味物質(zhì)的形成[1]。當前，豆醬發(fā)酵存在環(huán)境粗放、工藝可控性差等問題，難以滿足功能性豆醬高品質(zhì)、工藝穩(wěn)定及規(guī)范化生產(chǎn)等要求?；诖耍瑢W者們在制醬工藝優(yōu)化上進行了諸多研究，如通過恒溫發(fā)酵[2]、復合發(fā)酵[3]、低鹽發(fā)酵[4]等方式優(yōu)化制醬工藝中生成的氨基酸、還原糖等常規(guī)性物質(zhì)，但鮮有利用制醬工藝富集γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)開發(fā)功能性豆醬的研究報道。

GABA作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，已發(fā)現(xiàn)降血壓[5]、抗抑郁[6]及改善睡眠[7]等諸多功能，并已列為新資源食品。前期研究表明，通過豆醬制曲工藝可富集少量GABA[8]，但制醬后熟工藝周期較長，是蛋白質(zhì)降解、累積游離氨基酸的主要階段。其中，游離氨基酸與豆醬滋味、風味形成及GABA積累均顯著相關(guān)[9-10]，較大程度決定了豆醬品質(zhì)。但在常規(guī)工藝生產(chǎn)中，豆醬的游離氨基酸含量易受環(huán)境差異影響[11]，制醬過程中添加的過高鹽含量鹽水也會導致游離氨基酸含量上下波動[12]，并且高鹽飲食易誘發(fā)高血壓、中風等疾病[13]。因此，為開發(fā)一款高品質(zhì)功能性豆醬，本研究擬對制醬發(fā)酵工藝中發(fā)酵時間、制醬溫度及鹽水鹽含量優(yōu)化以實現(xiàn)GABA與氨基酸態(tài)氮在豆醬制品中的可控調(diào)節(jié)。使用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計分析各因素及其交互作用對GABA與氨基酸態(tài)氮的影響并獲得最優(yōu)制醬發(fā)酵條件，實現(xiàn)豆醬中GABA的過量富集。同時，通過總酸含量、pH值、氨基酸態(tài)氮含量、GABA含量及色澤等多指標綜合評價GABA豆醬的品質(zhì)，為高品質(zhì)豆醬的開發(fā)提供了借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

大豆、糙米、小麥粉(73.5%淀粉、11%蛋白質(zhì))：購于廣西南寧市冠超市；米曲霉孢子粉(Aspergillusoryzae3.042)：上海佳民釀造食品有限公司；商業(yè)發(fā)酵醬樣品：均購于市場。其中，廚邦黃豆醬(S1)、李錦記黃豆醬(S2)、李錦記辣豆醬(S3)、海天辣豆醬(S4)、海天黃豆醬(S5)、欣和黃豆醬(S6)、家庭自制黃豆醬(S7)、欣和甜面醬(S8)、嘉泰甜面醬(S9)及GABA豆醬(S10)。

氫氧化鈉、蔗糖、氯化鈉：均為國產(chǎn)分析純；乙酸鈉、濃鹽酸(優(yōu)級純)；γ-氨基丁酸標準品(純度>99%)、鄰苯二甲醛、β-巰基乙醇：上海麥克林生化科技有限公司；乙腈、甲醇(色譜純)：廣東光華科技股份有限公司。

1.2 主要儀器與設備

Cenlee 16R高速冷凍離心機 湖南湘立科學儀器有限公司；安捷倫1100高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；CM-3600d分光測色計 日本柯尼卡美能達公司；BMJ-160C霉菌培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；STARTER 3100酸度計、PWN124ZH電子天平 奧豪斯儀器有限公司；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豆醬制曲、制醬工藝

使用前期研究條件制曲，將醬曲與不同鹽濃度鹽水按重量比例1∶1.1混合于發(fā)酵罐中，于霉菌培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵，每日進行一次翻醬，取樣前對發(fā)酵醬充分混合。

1.3.2 豆醬中氨基酸態(tài)氮及總酸含量的測定

使用甲醛滴定法測定豆醬樣品中的氨基酸態(tài)氮含量，操作參考國標GB/T 5009.40-2003《醬衛(wèi)生標準的分析方法》。

1.3.3 樣品中γ-氨基丁酸含量的測定

樣品處理：稱取豆醬樣品2.5 g，充分研磨后使用蒸餾水定容至100 mL，取稀釋樣液2 mL，使用0.22 μm針式過濾器過濾至樣品瓶中待測，測定條件同前期研究。

1.3.4 關(guān)鍵制醬條件單因素試驗

按1.3.1制曲，發(fā)酵時間對豆醬品質(zhì)的影響試驗：鹽水鹽含量設置為15%，制醬溫度設置為30 ℃，發(fā)酵時間設定為14，21，28，35，42 d；鹽水鹽含量對豆醬品質(zhì)的影響試驗：發(fā)酵時間設置為28 d，制醬溫度設置為30 ℃，鹽水鹽含量為5%、10%、15%、20%、25%；制醬溫度對豆醬品質(zhì)的影響試驗：發(fā)酵時間設置為28 d，鹽水鹽含量設置為15%，制醬溫度設置為20，25，30，35，40 ℃。

1.3.5 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計試驗

在1.3.4單因素試驗基礎(chǔ)上確定因素水平編碼范圍，見表1。選取發(fā)酵時間、鹽水鹽含量、制醬溫度3個因素，應用三因素二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計進行優(yōu)化。

表1 因素水平編碼表Table 1 The factors and levels

1.3.6 發(fā)酵醬色值的測定驗

發(fā)酵醬色值通過分光測色計測定，使用ΔE、L*、a*及b*值表述，色值ΔE的計算公式為：

式中：ΔE代表色值，L*代表亮度，a*代表紅綠差異，b*代表黃藍差異。

1.3.7 發(fā)酵醬pH的測定

準確稱取樣品5 g，使用蒸餾水定容至100 mL，通過酸度計測定pH值，結(jié)果保留兩位小數(shù)[14]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均為3次平行所得，使用SPSS 26.0和Origin 9.6.5對數(shù)據(jù)進行處理及顯著性分析，使用Design Expert 10設計二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計試驗，使用Illustrator 23.0.2軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

發(fā)酵時間、鹽水鹽含量及制醬溫度對發(fā)酵豆醬中氨基酸態(tài)氮與GABA含量的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵時間、鹽水鹽含量及制醬溫度對豆醬氨基酸態(tài)氮及GABA含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time, brine salt content and fermentation temperature on the amino acid nitrogen and GABA content of soybean paste

傳統(tǒng)豆醬的開放式發(fā)酵工藝存在晝夜溫差大且蛋白酶酶活較低等問題，導致生產(chǎn)周期較長及品質(zhì)受季節(jié)性溫度變化影響。研究表明，恒溫發(fā)酵通常在發(fā)酵28 d左右即可達到國標要求的氨基酸態(tài)氮含量0.5 g/100 g以上[15]。本研究也證實隨著發(fā)酵時間的延長，豆醬中的氨基酸態(tài)氮含量隨時間增加而逐漸增加，并且在35 d之后上升速度減緩，僅從35 d的0.97 g/100 g增加至42 d的1.00 g/100 g ，見圖1中a?？赡苁前l(fā)酵前期因基質(zhì)蛋白質(zhì)豐富及微生物代謝活躍，使得氨基酸態(tài)氮含量快速上升。在35 d后，蛋白降解速度放緩，但由于氨基酸態(tài)氮在制醬過程中是逐步累積過程，因此表現(xiàn)為緩慢上升。同時，GABA含量與氨基酸態(tài)氮呈現(xiàn)出相似的前期快速上升，35 d后緩慢上升趨勢(r=0.986)。故綜合考慮后選擇制醬時間35 d為優(yōu)化試驗的中心點。

通常，在豆醬制醬過程中會添加大比例高濃度鹽水以抑制雜菌生長，鹽水鹽含量的高低及與醬曲混配比例會較大程度影響豆醬的品質(zhì)[16]?？疾禧}水鹽含量對豆醬氨基酸態(tài)氮含量及富集GABA影響的研究結(jié)果表明，豆醬中的氨基酸態(tài)氮含量隨著鹽水鹽含量增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在鹽水鹽含量為10%時，氨基酸態(tài)氮含量達到最大(0.82 g/100 g, P<0.01)。鹽含量導致的氨基酸態(tài)氮差異可能為低鹽環(huán)境下，微生物代謝較為旺盛，蛋白質(zhì)降解形成的游離氨基酸被微生物用于機體生長。在高鹽環(huán)境下，微生物代謝受到較大程度抑制，蛋白質(zhì)降解緩慢進而導致氨基酸態(tài)氮含量較低[17]。此外，對GABA的觀測發(fā)現(xiàn)其含量也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與氨基酸態(tài)氮含量變化有一定的相似性(r=0.792)，見圖1中b。在鹽水鹽含量為10%時，GABA含量達到最大，為1.663 mg/g (P<0.01)。在綜合考慮氨基酸態(tài)氮、GABA含量后，選擇鹽水鹽含量10%為優(yōu)化試驗中心點。

傳統(tǒng)發(fā)酵采用日曬夜露生產(chǎn)方式，制醬溫度隨晝夜更替變化。雖然有研究表明，變溫發(fā)酵能提升風味物質(zhì)的種類及豐度，但在連續(xù)化及工業(yè)化生產(chǎn)中，利用恒溫發(fā)酵技術(shù)可使產(chǎn)品品質(zhì)更加穩(wěn)定可控。本研究發(fā)現(xiàn)，豆醬中的氨基酸態(tài)氮在試驗范圍內(nèi)隨著溫度上升呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在制醬溫度為35 ℃時氨基酸態(tài)氮達到最大值1.13 g/100 g (P<0.01)。溫度導致的氨基酸態(tài)氮差異可能為較低，發(fā)酵溫度時米曲霉降解蛋白質(zhì)效率較低，導致氨基酸態(tài)氮含量較低，而在40 ℃發(fā)酵環(huán)境下，微生物的代謝及酶活受到一定抑制，導致蛋白質(zhì)降解速度降低，進而使氨基酸態(tài)氮含量出現(xiàn)差異。GABA含量則與氨基酸態(tài)氮含量呈現(xiàn)相似的變化趨勢(r=0.928)，見圖1中c，在35 ℃時達到最大值1.808 mg/g(P<0.01)。故綜合考慮后選擇35 ℃為優(yōu)化試驗中心點。

2.2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計試驗結(jié)果

2.2.1 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計試驗結(jié)果

根據(jù)圖1單因素試驗結(jié)果，選取發(fā)酵時間(A)、鹽水鹽含量(B)及制醬溫度(C)作為3個因素，以氨基酸態(tài)氮、GABA含量為響應值，試驗方案及結(jié)果見表2。

表2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計試驗結(jié)果Table 2 Quadratic regression orthogonal rotation combination design and experimental results

2.2.2 以氨基酸態(tài)氮、GABA含量為指標的回歸模型方差分析及交互作用的影響

對表2所得數(shù)據(jù)整理分析得表3，可擬合氨基酸態(tài)氮(Y1)與GABA含量(Y2)的二次回歸方程為：

Y1=0.97+0.13A+0.10B+0.08C-0.01AB+0.04AC+0.06BC-0.05A2-0.07B2-0.12C2；

Y2=1.690+0.191A+0.136B+0.206C+0.020AB+0.047AC+0.127BC-0.148A2-0.221B2-0.201C2。

表3 以氨基酸態(tài)氮、GABA含量為評價指標的回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of regression model using amino acid nitrogen and GABA content as the evaluation indexes

續(xù) 表

由表3可知，氨基酸態(tài)氮模型擬合十分顯著(P<0.01)，無顯著失擬性因素(P=0.0518>0.05)，方差分析結(jié)果顯示，A與C2對回歸方程的影響極顯著(P<0.01)，B與C對回歸方程的影響顯著(0.01

同理得GABA含量模型十分顯著(P<0.01)，但存在失擬性因素(P=0.0192>0.01)，方差分析結(jié)果顯示，A、B、C、A2、B2及C2對回歸方程的影響極顯著(P<0.01)，BC對回歸方程有顯著影響(0.01

圖2 發(fā)酵時間、鹽水鹽含量及制醬溫度對豆醬中氨基酸態(tài)氮及GABA含量的影響Fig.2 Effects of fermentation time,brine salt content and fermentation temperature on amino acid nitrogen and GABA content of soybean paste

由圖2中a可知，隨著發(fā)酵時間的延長與鹽水鹽含量的增加，氨基酸態(tài)氮呈現(xiàn)先快速上升后略微下降的趨勢，通過二維等高線圖可知兩因素交互作用較弱。由圖2中b可知，隨著發(fā)酵時間的延長，氨基酸態(tài)氮逐漸升至最高后出現(xiàn)略微下降，隨著制醬溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其二維等高線圖呈橢圓形，可知兩因素存在交互作用。由圖2中c可知，隨著鹽水鹽含量及制醬溫度逐漸增大，氨基酸態(tài)氮含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但其二維等高線圖呈橢圓形，可知兩因素間存在顯著的交互作用。綜合表3和圖2可知，3個因素對氨基酸態(tài)氮的影響力依次為：發(fā)酵時間>鹽水鹽含量>制醬溫度。

由圖2中d可知，隨著發(fā)酵時間的延長與鹽水鹽含量的升高，GABA含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，二維等高線圖表明兩因素間存在一定交互作用。由圖2中e可知，隨著發(fā)酵時間的延長和制醬溫度的增加，GABA含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，二維等高線圖表明兩因素間存在較弱的交互作用。由圖2中f可知，隨著鹽水鹽含量的增加與制醬溫度的升高，GABA含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且二維等高線圖呈現(xiàn)橢圓形(交互項BC，P<0.05)，可知兩因素間存在顯著的交互作用。綜合圖2和表3可知，3個因素對GABA含量的影響力依次為：制醬溫度>發(fā)酵時間>鹽水鹽含量。

2.2.3 最佳工藝點驗證性實驗

根據(jù)氨基酸態(tài)氮與GABA回歸模型分別可得出最優(yōu)組合：發(fā)酵時間38 d、鹽水鹽含量18%及制醬溫度38 ℃時，預測氨基酸態(tài)氮含量為1.157 g/100 g，GABA含量為1.775 mg/g。以GABA含量模型可得出：發(fā)酵時間34 d、鹽水鹽含量17%及制醬溫度37 ℃時，預測氨基酸態(tài)氮含量為1.117 g/100 g，GABA含量為1.888 mg/g。兩個回歸模型的最佳預測條件較為接近，與單因素試驗中GABA含量與氨基酸態(tài)氮含量呈現(xiàn)相似變化趨勢相吻合。

綜合考慮實際操作后，選擇發(fā)酵時間35 d、鹽水鹽含量17%及制醬溫度37 ℃為優(yōu)選條件，此時，模型預測氨基酸態(tài)氮含量為1.136 g/100 g，GABA含量為1.876 mg/g。驗證性試驗得氨基酸態(tài)氮含量為(1.126±0.048) g/100 g，GABA含量為(1.868±0.093) mg/g。驗證結(jié)果與回歸模型預測值基本一致，顯著高于Xu等[18]在豆醬成品中測得的0.260～1.130 mg/g，證明通過制曲、制醬工藝優(yōu)化可有效提升豆醬中的GABA含量[19]。

2.3 GABA豆醬與市售發(fā)酵醬的游離氨基酸組成對比

2.3.1 不同發(fā)酵醬的游離氨基酸組成

發(fā)酵醬中的游離氨基酸主要由酶催化蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生，與各項品質(zhì)指標均存在相關(guān)性，是評價發(fā)酵醬品質(zhì)的重要指標[20]。游離氨基酸作為重要的呈味物質(zhì)，如天冬氨酸及谷氨酸等是發(fā)酵醬中主要的鮮味來源，根據(jù)呈現(xiàn)的味道大致可將表4中的18種氨基酸分為鮮味、甜味、苦味和不呈味氨基酸。此外，游離氨基酸還會參與色澤及風味的形成，因此，探明發(fā)酵醬的游離氨基酸組成對評價鑒定發(fā)酵醬品質(zhì)具有重要意義。

表4 10種發(fā)酵醬樣品的游離氨基酸含量Table 4 The content of free amino acids of ten kinds of fermented soybean paste samples mg/g

因發(fā)酵醬生產(chǎn)工藝及原料差異，不同樣品的游離氨基酸組成有一定差異(見表4)。10種發(fā)酵醬的游離氨基酸總量由高到低依次為：S2>S5>S3>S4>S1>S10>S7>S6>S8>S9，其中S2的游離氨基酸總量最高為13.55 mg/g，與S5差異較小(P>0.05)，與其余8個樣品的差異明顯(P<0.01)。S10作為優(yōu)化后的GABA豆醬，其游離氨基酸總含量較高，達11.70 mg/g，與樣品S4、S1和S7相比無顯著性差異(P=0.73>0.05)，顯著高于S6、S8及S9(P<0.01)。谷氨酸及天冬氨酸作為發(fā)酵醬中主要的呈鮮氨基酸，S1～S6 6種商業(yè)豆醬中的鮮味氨基酸總百分比顯著高于其余樣品(P<0.01)，可能是因為商業(yè)豆醬呈現(xiàn)更加濃郁的鮮味，在后期調(diào)配加入谷氨酸鈉調(diào)味導致。S7除甲硫氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、脯氨酸及谷氨酸外，其余13種氨基酸含量均較高(見圖3)，可能因S7發(fā)酵周期較長(12個月)，蛋白質(zhì)降解較充分導致。此外，在S7和S10中存在較高含量的第一限制性必需氨基酸賴氨酸(見表4和圖3)，兩者的必需氨基酸總量也分別達到4.38 mg/g (37.46%)和2.96 mg/g (25.31%)，在10個樣品中處于較高水平。同時，S10中可作為豆醬主要評價指標的脯氨酸也顯著高于其余樣品，達4.42 mg/g (P<0.01)。綜上，S10作為快速發(fā)酵產(chǎn)品，已有較高的游離氨基酸含量呈現(xiàn)較好品質(zhì)。

圖3 不同發(fā)酵醬的18種游離氨基酸熱力圖Fig.3 Thermogram of 18 free amino acids in different fermented soybean paste

2.3.2 不同發(fā)酵醬的游離氨基酸主成分分析

以18種游離氨基酸含量構(gòu)成10×18矩陣進行主成分分析，得到各主成分的特征值、方差貢獻率及累計貢獻率。根據(jù)主成分分析法提取累計貢獻率≥80%主成分的原則，共提取出5個主成分(見圖4)。其中，前5個主成分的特征值均大于1，累計方差貢獻率為96.394%，包含10個發(fā)酵醬氨基酸含量的大部分信息，能有效代替18種游離氨基酸對發(fā)酵醬品質(zhì)進行評價。

圖4 不同發(fā)酵醬第1，2主成分因子得分圖及載荷圖Fig.4 The scoring diagram and loading diagram of the first and second principal component factors of different fermented soybean paste

2.3.3 不同發(fā)酵醬的游離氨基酸的綜合評價及聚類分析

由主成分分析可知，使用前5個主成分可以有效解釋游離氨基酸含量與品質(zhì)的關(guān)系，因此綜合得分公式為：F=0.526PC1+0.173PC2+0.118PC3+0.085PC4+0.062PC5。10個樣品以綜合得分大小對樣品進行排序，依次為：S7>S5>S8>S4>S2>S9>S10>S3>S6>S1。結(jié)合圖3可知，S7因未添加谷氨酸鈉調(diào)味導致谷氨酸含量及總游離氨基酸含量均小于部分商業(yè)化產(chǎn)品，但發(fā)酵周期較長，使多數(shù)氨基酸含量均相對較高，因此在主成分評價體系中得分最高。而S5的各類氨基酸含量也相對均衡，在綜合得分中排名第二。S10作為快速發(fā)酵產(chǎn)品，基質(zhì)的降解程度較低，使游離氨基酸含量偏低，但在綜合評價中仍為中等水平(見表5)。

表5 因子綜合得分表Table 5 The comprehensive scoring table of factors

對10種發(fā)酵醬的綜合得分進行聚類分析，由圖5可知，S7因多種游離氨基酸含量較高，獲得了較高的綜合得分單獨成類。S2、S4、S5及S8則歸為第二大類，S10、S1、S3、S6及S9歸為第三大類，其中S10的綜合得分已優(yōu)于部分商業(yè)發(fā)酵醬(見表5)。綜上，經(jīng)優(yōu)化后的發(fā)酵醬S10樣品，通過快速發(fā)酵雖品質(zhì)不及長周期發(fā)酵樣品S7，但品質(zhì)已接近甚至優(yōu)于部分商業(yè)發(fā)酵醬。

圖5 10種發(fā)酵醬的游離氨基酸綜合得分聚類圖Fig.5 The cluster diagram of comprehensive scores of free amino acids of 10 fermented soybean paste

3 結(jié)論

通過試驗建立發(fā)酵時間、鹽水鹽含量制醬溫度3種影響因素對豆醬中氨基酸態(tài)氮含量及GABA含量的相互作用模型，得出在發(fā)酵時間35 d、鹽水鹽含量17%及制醬溫度37 ℃的條件下，氨基酸態(tài)氮含量為(1.126±0.048) g/100 g，GABA含量為(1.868±0.093) mg/g，與回歸模型預測值基本一致。研究結(jié)果表明，本研究中所制得的GABA豆醬具有高氨基酸態(tài)氮、GABA含量等特點，相比市售產(chǎn)品分別提高了28%～103%與46%～244%。綜上，通過本試驗優(yōu)化后，可有效提升豆醬中的氨基酸態(tài)氮及GABA含量，提供了一種穩(wěn)定生產(chǎn)高品質(zhì)GABA豆醬的規(guī)范化方法。