黃小波 劉維平

(長沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004)

中國是禽蛋生產(chǎn)和消費(fèi)大國，產(chǎn)量約占全世界40%，連續(xù)多年位居世界第一；其中，雞蛋產(chǎn)量占禽蛋總量的70%以上[1]。雞蛋富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、維生素等多種營養(yǎng)要素、且價格低廉、易于獲得，是人類飲食的重要組成部分[2-3]。然而，雞蛋中檢出有機(jī)類農(nóng)藥或除草劑的情況時有發(fā)生[3-4]。長期食用農(nóng)殘超標(biāo)的雞蛋，可誘發(fā)多種慢性疾病甚至癌癥，嚴(yán)重影響了禽蛋食用安全[5]。

目前，關(guān)于有機(jī)磷、硫、氯類農(nóng)藥殘留的檢測方法主要集中于氣相色譜、液相色譜[6-7]以及氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用和液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用等[8-9]。但是，這些方法常需消耗大量昂貴試劑和(固相萃取)耗材，樣品前處理步驟繁瑣，且效果不盡如人意[10]。有研究[11]表明，采用氯化鈉鹽析輔助乙腈提取農(nóng)殘，結(jié)合無水硫酸鎂吸附脫水、乙二胺基-N-丙基(PSA)除雜的QuEChERS技術(shù)，成功地實(shí)現(xiàn)了食品基質(zhì)中農(nóng)殘的簡便、高效提取。

近年來，QuEChERS結(jié)合色譜—質(zhì)譜已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)殘的檢測，如茶油中有機(jī)磷類[10]、柑桔中毒死蜱、吡蟲啉和殘殺威[11]、高硫蔬菜中16種氨基甲酸酯類等農(nóng)藥殘留量檢測[12]。鄭容等[13]曾采用QuEChERS-氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)同時測定了雞蛋中19種有機(jī)氯及菊酯農(nóng)藥殘留；王瓊妹等[14]建立了基于QuEChERS前處理結(jié)合GC-MS，多反應(yīng)監(jiān)測(Multiple Reaction Monitoring，MRM)掃描同時鑒定雞蛋中48種農(nóng)藥殘留。而有關(guān)QuEChERS結(jié)合液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)檢測雞蛋中農(nóng)藥殘留的研究尚未見報道。

試驗(yàn)擬構(gòu)建基于QuEChERS-UHPLC-MS/MS同時多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)檢測雞蛋中19種有機(jī)磷、硫、氯類農(nóng)藥殘留的檢測方法，并進(jìn)一步運(yùn)用該方法對湖北省不同地區(qū)雞蛋樣品進(jìn)行檢測，以期提供一種快速、高效的禽蛋農(nóng)殘檢測方法。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

殺蟲或除草劑(殺蟲單、吡蟲啉、苯線磷亞砜、安硫磷、氯蟲酰胺、乙拌磷砜、烯酰嗎啉、螺旋藻胺、伏蟲脲、異菌脲、異稻瘟凈、氯芬磷、惡唑菌酮、吡嘧磷、辛硫磷、茚蟲威、毒死蜱、丙硫磷)標(biāo)準(zhǔn)品：純度95%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；

雞蛋樣品：隨機(jī)購于湖北武漢(10批次)、鄂州(12批次)、孝感(8批次)、荊門(13批次)、荊州(8批次)、黃岡(22批次)等地區(qū)的零售市場；

乙腈、甲醇和醋酸銨：色譜純，美國Tedia公司；

超純水：美國Millipore 超純水儀制備；

乙酸：色譜純，德國CNW公司；

甲酸：色譜純，美國Scientific公司；

MgSO4、NaCl等：分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀：1200 SL型，配備SB-Aq色譜柱(100 mm×3.0 mm×1.8 μm)，美國安捷倫科技有限公司；

三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：6460型，美國安捷倫科技有限公司；

電子天平：XS205DU型，梅特勒—托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；

氮吹儀：N-ECAP45型，美國Organomation公司；

渦旋混合器：SK-1型，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

(1)農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取一定量農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容至100 mL，配制成濃度約為1 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃避光保存。

(2)農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：準(zhǔn)確吸取一定體積1 g/L農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)儲備液至10 mL容量瓶中，利用乙腈適當(dāng)稀釋，制備含有10 mg/L每種農(nóng)藥或除草劑的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，并在-20 ℃下避光保存。

1.3.2 樣品制備(提取和凈化) 準(zhǔn)確稱取5.00 g充分混勻的雞蛋樣品至50 mL具塞離心管；隨后加入4 mL去離子水，旋渦混勻1 min，再加入10 mL(含1%乙酸)乙腈溶液，磁力攪拌20 min混勻。加入4 g MgSO4和1 g NaCl，密封旋渦震蕩1 min；4 ℃下，5 000 r/min離心5 min。準(zhǔn)確吸取400 μL上清液(乙腈層)于2 mL離心管中，同時加入5 mmol/L 醋酸銨溶液(含0.1%甲酸)200 μL，混勻，過0.2 μm微孔濾膜，備用待測。

1.3.3 UHPLC-MS/MS參數(shù)

(1)色譜條件：柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流量0.25 mL/min；流動相A：甲醇溶液，流動相B：5 mmol/L醋酸銨溶液(含0.1%甲酸)；梯度洗脫程序：0～3 min采用5% A進(jìn)行洗脫，3～5 min線性增至95%，并維持2 min；7～10 min線性降低至5% A；最后，重新平衡8 min，總運(yùn)行時間18 min。

(2)質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子(ESI+)模式；氣體溫度300 ℃；氣體流速7 L/min；離子氣壓275.8 kPa；去溶劑溫度300 ℃；保護(hù)氣體流速10 L/min；毛細(xì)管電壓3 000 V；離子噴嘴電壓500 V；駐留時間20 ms；多反應(yīng)監(jiān)測模式，其他質(zhì)譜參數(shù)見表1[15]。

1.3.4 檢出限和定量限測定 為消除(或減少)基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果所造成的影響或干擾，將空白樣品經(jīng)提取和純化(凈化)所得的溶液，作為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的溶劑。用基質(zhì)溶液將農(nóng)藥標(biāo)樣配置成2.5，5.0，10.0，20.0，50.0 μg/kg系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mL；按照1.3.3中優(yōu)化條件進(jìn)行色譜和質(zhì)譜分析，以混合標(biāo)樣溶液的濃度(X，μg/kg)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將3倍信噪比(S/N=3)作為檢出限，10倍信噪比(S/N=10)作為定量限[10,12]。

1.3.5 回收率和精密度測定 向制備的雞蛋樣液中，分別添加低濃度(1 μg/kg)、中濃度(5 μg/kg)和高濃度(20 μg/kg)待測農(nóng)藥標(biāo)樣，進(jìn)行3次重復(fù)，計算(不同濃度)各種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)構(gòu)建(考察)

2.1.1 UHPLC-MS/MS條件優(yōu)化 以流動注射方式分別對19種農(nóng)藥(單)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行正離子電噴霧母離子(ESI+)掃描，確定各目標(biāo)化合物的母離子，再對母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描(MS2)，每種農(nóng)藥選擇兩對響應(yīng)值高的特征離子對作為定性和定量離子對，并對MRM參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見表1。采用SB-Aq色譜柱分離，甲酸—醋酸銨混合溶液和甲醇梯度洗脫的分離度、靈敏度(離子響應(yīng))較好，且能在一定程度上減緩色譜峰拖尾。

表1 19種農(nóng)殘的保留時間及MRM參數(shù)

2.1.2 線性范圍、檢出限和定量限 由表2可知，除惡唑菌酮(R2=0.532 5)外，殺蟲單等18種農(nóng)藥在2.5～50.0 μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，擬合方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.965 0～0.999 5。所建方法的檢出限(LOD)為0.01～2.89 μg/kg；定量限(LOQ)為0.03～9.54 μg/kg。說明在此范圍內(nèi)，所構(gòu)建方法具有良好的線性關(guān)系；對雞蛋中氯蟲酰胺(LOD=0.01 μg/kg，LOQ=0.03 μg/kg)、吡嘧磷(LOD=0.01 μg/kg，LOQ=0.03 μg/kg)、伏蟲脲(LOD=0.02 μg/kg，LOQ=0.07 μg/kg)、毒死蜱(LOD=0.03 μg/kg，LOQ=0.10 μg/kg)等農(nóng)藥的檢測靈敏度較高；對安硫磷(LOD=2.89 μg/kg，LOQ=9.54 μg/kg)、殺蟲單(LOD=1.09 μg/kg，LOQ=3.60 μg/kg)的檢測靈敏度相對較低。

表2 19種農(nóng)藥的線性方程和相關(guān)系數(shù)(R2)、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

2.1.3 加標(biāo)回收率和精密度 由表3可知，當(dāng)農(nóng)藥混標(biāo)濃度為1 μg/kg時，其加標(biāo)回收率在50.5%～126.0%(惡唑菌酮未檢出)，相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)為4.5%～27.0%；當(dāng)濃度為5 μg/kg時，其加標(biāo)回收率在79.7%～129.0%，RSD為1.5%～21.0%；當(dāng)濃度為20 μg/kg時，其加標(biāo)回收率在57.4%～111.0%，RSD為1.3%～17.0%。說明當(dāng)?shù)皹又修r(nóng)藥殘留量較低(<1 μg/kg)時，所建方法加標(biāo)回收率稍弱(1 μg/kg，79.25%)，相對標(biāo)準(zhǔn)差較高(19.54%)；而當(dāng)(雞蛋)樣品中農(nóng)藥殘留量稍高(>5 μg/kg)時，所構(gòu)建方法的加標(biāo)回收率接近100%(5 μg/kg，102.14%；20 μg/kg，92.66%)，相對標(biāo)準(zhǔn)差較低(5 μg/kg，11.27%；20 μg/kg，9.34%)。試驗(yàn)所建方法的回收率和RSD與其他研究結(jié)果較為吻合[13,15-16]，且基本符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》(GB/T 27404—2008)對回收率和精密度的要求。說明試驗(yàn)所構(gòu)建的方法能夠滿足正常檢測需要，可用于實(shí)際雞蛋樣品中相關(guān)農(nóng)殘的痕量檢測。

表3 不同濃度農(nóng)藥的加標(biāo)回收率和精密度

2.2 雞蛋樣品中農(nóng)藥殘留量檢測

運(yùn)用試驗(yàn)所構(gòu)建方法對隨機(jī)采購于湖北省境內(nèi)不同地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場的73批次雞蛋進(jìn)行檢測。73批次雞蛋中19種農(nóng)藥總檢出頻率為2.82%。其中，辛硫磷和毒死蜱的檢出率分別為22%，15%；兩者檢出量分別為2.08～729.74，0.81～46.89 μg/kg；丙硫磷在所有雞蛋中均未檢出；其他農(nóng)殘?jiān)陔u蛋中檢出頻率均低于0.41%。武漢、鄂州、孝感、荊門、荊州、黃崗地區(qū)雞蛋中農(nóng)殘檢出頻率分別為5.56%，4.17%，2.78%，5.13%，11.11%，1.77%。

具體來說，武漢雞蛋中辛硫磷、毒死蜱含量分別為(197.35±237.98)μg/kg(檢出頻率為4/10)和(4.96±3.79)μg/kg(檢出頻率為3/10)；鄂州雞蛋中辛硫磷、毒死蜱含量分別為(136.51±296.93)μg/kg(檢出頻率為5/12)和9.72 μg/kg(檢出頻率為1/12)；荊門雞蛋中辛硫磷、毒死蜱含量分別為(53.92±87.91)μg/kg(檢出頻率為3/13)和(17.67±25.32)μg/kg(檢出頻率為3/13)；荊州雞蛋中辛硫磷、毒死蜱含量分別為(354.63±393.70)μg/kg(檢出頻率為4/8)和(13.72±12.05)μg/kg(檢出頻率為3/8)；黃崗雞蛋中毒死蜱含量為0.92 μg/kg(檢出頻率為1/22)；孝感雞蛋中未檢出辛硫磷和毒死蜱。綜上，不同產(chǎn)地雞蛋中農(nóng)藥殘留量和同一個雞蛋中不同農(nóng)藥殘留量均存在較大差異，究其原因可能為母雞所用飼料、外出覓食和生活環(huán)境等多種因素綜合所致[13]。

3 結(jié)論

(1)研究成功構(gòu)建了一種基于QuEChERS(前處理)結(jié)合UHPLC-MS/MS(MRM掃描)同時檢測雞蛋中多種農(nóng)藥殘留量的方法。該方法所耗溶劑少，操作便捷，加標(biāo)回收率高(79.25%～102.14%)，且具有較好的線性及較高的準(zhǔn)確度(檢出限為0.01%～2.89%)和精密度(相對標(biāo)準(zhǔn)差為9.34%～16.72%)，基本符合和適用于禽蛋中19種農(nóng)藥殘留的同時和快速定性、定量分析。

(2)湖北省境內(nèi)雞蛋中農(nóng)殘問題主要涉及辛硫磷(檢出率為22%)和毒死蜱(檢出率為15%)兩種。但是總體來說，檢出總頻率(2.82%)和含量較低，潛在安全風(fēng)險較小。