日孜萬古力·艾山 努爾古麗·熱合曼 麥日艷古·亞生 伊力米熱·熱夏提

(1.新疆師范大學生命科學學院，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆特殊環(huán)境物種保護與調(diào)控生物學實驗室，新疆 烏魯木齊 830054)

吐魯番的坎兒井已有2 000多年的歷史，是吐魯番盆地生產(chǎn)、生活的重要水源[1-2]?？矁壕揽康叵掳登斔?，不受季節(jié)風沙影響、蒸發(fā)量小、流量穩(wěn)定，結構為整個水系提供獨特的水質和穩(wěn)定的微生物菌群的自然環(huán)境的同時[3-4]，這一相對封閉的環(huán)境有利于這一寶貴的水資源遠離污染。有研究[5]表明，長期飲用坎兒井水對人體有益。

目前國內(nèi)外關于坎兒井的研究主要集中在對其水質分析[6-7]及對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[8-9]和生態(tài)環(huán)境[10-11]的影響等方面，但對坎兒井微生物多樣性方面的研究尚未見報道。阿爾菲婭[12]研究表明，用坎兒井水和面不添加酵母粉也可以烤制出具有特殊風味的馕，而且其品質顯著優(yōu)于用自來水或其他飲用水制備的。但這一特殊的味道來自于面粉中的微生物還是坎兒井水中的微生物，坎兒井水質能否影響面團發(fā)酵過程，這方面還未見相關研究報道。研究擬以新疆吐魯番坎兒井水為研究對象，通過Illumina Miseq測序分析坎兒井水中的微生物群落多樣性，為坎兒井水的合理應用及食用安全性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣本來源

于2020年9月11日，樣品分別采自阿木爾坎兒井(位于吐魯番市托克遜縣夏鄉(xiāng)喀格恰克村)，沙依坎兒井(位于吐魯番市葡萄鄉(xiāng)達甫散蓋村)，奧吾提坎兒井(位于吐魯番市葡萄鄉(xiāng)英薩村)，米依木阿吉坎兒井(位于吐魯番市亞爾鄉(xiāng)亞爾村)(樣品特點見表1)。每個樣點取10 L裝入無菌的水樣瓶內(nèi)，帶回實驗室保存于4 ℃。每個樣品做3個平行，通過抽濾法在0.22 μm的纖維濾膜上富集微生物，抽濾完成后再將濾膜裝于無菌離心管中，用封口膜緊密地包裝并立即存放在-80 ℃冰箱凍存，用于檢測微生物多樣性。

表1 樣本信息

1.1.2 主要儀器設備

離心機：Eppendorf 5430R型，合肥艾本森科學儀器有限公司；

超微量分光光度計：NanoDrop2000型，美國Thermo Fisher Scientific公司；

酶標儀：BioTek ELx800型，美國Biotek公司；

微型熒光計：QuantiFluorTM-ST型，美國Promega公司；

電泳儀：DYY-6C型，北京六一儀器廠；

PCR儀：ABI GeneAmp?9700型，美國ABI公司；

測序儀：Illumina Miseq型，美國Illumina公司。

1.2 高通量測序及分析

1.2.1 高通量測序流程

取樣→環(huán)境樣品DNA抽提→設計合成引物接頭→PCR擴增與產(chǎn)物純化→PCR產(chǎn)物定量與均一化→構建PE文庫→高通量測序

1.2.2 DNA提取、擴增 樣品總DNA提取完成后，檢測利用1%瓊脂糖凝膠電泳提取的基因組DNA。在后續(xù)操作之前，應將其貯藏在-20 ℃[13]。

采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，PCR擴增細菌16S rRNA的V3～V4區(qū)，真菌26S rRNA的ITS區(qū)，細菌和真菌所使用的正向引物和反向引物分別為338F和806R、ITS1F和ITS2R。細菌和真菌引物列表如表2所示，用ABI GeneAmp.9700型PCR儀進行擴增。PCR擴增反應程序如表3所示。

表2 細菌、真菌特異性引物列表

表3 PCR擴增反應程序

PCR擴增完成后，全部PCR產(chǎn)物采用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒進行回收，用Tris-HCl洗脫，QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混勻后完成文庫制備，將文庫進行測序。文庫的構建與上機測序流程均由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.2.2 生物信息分析 使用fastp(https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0)軟件對原始測序序列進行質控，使用FLASH(http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7)軟件對每個樣品的Reads進行拼接，得到的序列為原始Tags數(shù)據(jù)；拼接得到的原始Tags數(shù)據(jù)，經(jīng)過過濾得到高質量的Tags數(shù)據(jù)(Clean Tags)。參照Qiime(V1.9.0，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)的Tags質量控制流程，進行Tags截取、長度過濾后進行去除嵌合體序列的處理，使用UPARSE軟件(http://drive5.com/uparse/，version 7.1)，根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU 聚類并剔除嵌合體。

利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/，version 2.2)對每條序列進行物種分類注釋，通過Mothor方法比對Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(設置比對閾值為70%)，獲得在各個分類水平上的信息。通過Qiime軟件計算Sobs、Chao、Shannon、Simpson、coverage等多樣性指數(shù)，用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線及Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析。通過Qiime軟件(Version 3.3.1)計算Unifrac，并通過R軟件進行物種組成分析及Beta多樣性指數(shù)組間差異分析。

2 結果與分析

2.1 細菌和真菌序列豐度及多樣性分析

通過測序，對原始測序序列進行拼接、質控、優(yōu)化后共獲得細菌16S rRNA和真菌26S rRNA有效基因序列。無抽平得到的細菌原始序列為細菌583 710條，真菌716 621條。原始序列進行過濾、優(yōu)化、拼接后總共獲得有效序列為細菌446 700條，真菌407 376條。基于97%一致性對OTUs進行注釋，共得到2 586個OTUs。其中細菌1 456個OTUs、真菌1 130個OTUs。稀釋曲線趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)量合理，再增加測序量已不太可能檢測到新的微生物種[14]。如圖1所示，隨著樣本量的增加，細菌和真菌sobs曲線急劇上升，說明樣品群落中大量的物種被檢測到，隨后曲線逐漸平穩(wěn)，說明可以進行以后的數(shù)據(jù)分析。

圖1 Sobs稀釋曲線

如圖2(a)所示，樣品T在橫坐標上的寬度要比其他組寬度較寬，橫坐標上的范圍也大，表明樣品T物種豐度高；其他樣品的垂直曲線逐漸平坦，表明物種分布均勻。如圖2(b)所示，樣品T的物種多樣性高，而其他樣品中優(yōu)勢菌群的所占比例很高，多樣性較低。

圖2 Rank-Abundance曲線

如表4所示，細菌的測序深度遠高于真菌。細菌和真菌樣品A和M 的Sobs指數(shù)與Chao指數(shù)最低，說明樣品A和樣品M 的微生物群落豐富度最低。樣品T的Sobs指數(shù)與Chao指數(shù)最高，說明該樣品的微生物群落豐富度最高，多樣性也高。但是各樣品之間微生物群落多樣性無顯著性差異。Coverage指數(shù)對所有樣本的覆蓋率均在0.99以上，表明該測序水平可識別各樣本中所有的細菌和真菌系統(tǒng)類型，所得數(shù)據(jù)可靠。

表4 Alpha多樣性指數(shù)

2.2 物種組成分析

由圖3(a)可知，細菌4組樣品共有173個核心OTUs，樣品A獨有105個OTUs、樣品S獨有91個OTUs、樣品M獨有45個OTUs、樣品T獨有487個OTUs。表明樣品T中細菌微生物群落較其余組豐富。

由圖3(b)可知，真菌4組樣品共有13個核心OTUs，樣品A獨有48個OTUs、樣品S獨有56個OTUs、樣品M獨有52個OTUs、樣品T獨有868個OTUs。表明樣品T中真菌微生物群落較其余組豐富。

圖3 OTU水平上的Venn圖分析

2.3 不同樣品在細菌和真菌屬水平上的差異性分析

由圖4(a)可知，4組樣品細菌物種豐度均獨立，各樣品組內(nèi)聚在一起，組外距離較遠，未出現(xiàn)重疊現(xiàn)象，表明這些樣品在細菌群落結構上具有顯著差異。

由圖4(b)可知，來自吐魯番市內(nèi)的3組樣品交叉聚集在一起，來自托克遜縣的樣品與其余組存在一定的差異。樣品A與其他3組樣本雖距離較近，但未相互重疊，群落組成相互獨立。4組樣品的群落組成結構可以分為2種類型：樣品M、T、S 3組相互重疊，表明3組樣品的真菌群落組成較相似。這3種樣品都有大豐富度油壺菌屬(Olpidium)分別占31.84%，16.38%，15.77%為主導優(yōu)勢，真菌的菌群組成和豐富度的區(qū)別較小。此外樣品A分布相互獨立，未出現(xiàn)重疊現(xiàn)象，組內(nèi)分布較散，表明該組的真菌群落組成結構差異較大。

圖4 基于加權 Uni Frac 距離的不同樣品 PCoA圖

2.4 微生物群落結構分析及優(yōu)勢菌屬

2.4.1 不同樣品中細菌群落結構分析及優(yōu)勢菌屬 為了研究樣品的物種組成多樣性信息，對所有樣品有效序列進行聚類，以97%的序列相似性將序列聚類成為OTU(可操作分類單元，相當于種水平)再深度分析。結果顯示，4種樣品細菌16S rRNA共涉及到40個門，變形菌門(Proteobacteria)是絕對優(yōu)勢菌門，占據(jù)87.48%～94.90%，其次是擬桿菌門(Bacteroidota)占據(jù)0.49%～3.70%，詳見表5。

表5 門水平上各樣品細菌相對含量(序列所占比例)

基于16S rRNA分析，從4種樣品中共測出537個細菌屬，其中嗜氫菌屬(Hydrogenophaga)為優(yōu)勢菌屬，其次是未鑒定的絲毛單胞菌屬(unclassified_f_Comamonadaceae)、曲桿菌屬(Curvibacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)(詳見圖5)。

圖5 細菌屬水平群落Bar圖

樣品A中特有的優(yōu)勢菌屬為嗜氫菌屬(Hydrogenophaga)占34.31%；樣品S中特有的優(yōu)勢菌屬為曲桿菌屬(Curvibacter)占36.33%；樣品M中特有的優(yōu)勢菌屬為未鑒定的絲毛單胞菌屬(unclassified_f_Comamonadaceae)占34.84%；樣品T中特有的優(yōu)勢菌屬為嗜氫菌屬(Hydrogenophaga)占57.66%。優(yōu)勢菌可能來自地下坎兒井水附近的土壤中的微生物，其成為優(yōu)勢的原因可能是坎兒井依靠地下暗渠輸水環(huán)境相對封閉，不受外界及四季變化的影響，其溫度常年幾乎是恒定的，這些優(yōu)良自然特征仍待進一步研究。

對4種坎兒井水中的細菌進行分析結果表明，在16S rRNA門水平上，樣品A、S、M、T中的優(yōu)勢菌門均為變形菌門(Proteobacteria)，分別占87.48%，94.90%，94.87%，93.22%。在屬水平上，樣品A、T中優(yōu)勢菌屬是嗜氫菌屬(Hydrogenophaga)，分別占34.31%，57.66%；樣品S中優(yōu)勢菌屬是曲桿菌屬(Curvibacter)，占36.33%；樣品M中優(yōu)勢菌屬是不可鑒定的絲毛單胞菌屬(unclassified_f_Comamonadaceae)，占34.84%。在種水平上，樣品A、S、T中優(yōu)勢菌種是不可鑒定的嗜氫菌種(unclassified_g_Hydrogenophaga)，分別占32.02%，23.69%，57.53%；樣品M中優(yōu)勢菌種是未鑒定的絲毛單胞菌種(unclassified_f_Comamonadaceae)，占34.84%。

2.4.2 不同樣品中真菌群落結構分析及優(yōu)勢菌屬 基于ITS測序門水平，4種樣品共涉及12個門，子囊菌門(Ascomycota)是主要優(yōu)勢菌門，占據(jù)44.59%～61.07%，其次是油壺菌門(Olpidiomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、未鑒定的真菌門(unclassified_k_fungi)、其他真菌門豐富度<5%(詳見表6)。

表6 門水平上各樣品真菌相對含量(序列所占比例)

基于ITS分析，4種樣品共涉及568個真菌屬，其中油壺菌屬(Olpidium)為優(yōu)勢菌屬，其次是未鑒定的真菌屬(unclassified_k_fungi)、枝孢屬(Cladosporium)(詳見圖6)。

圖6 真菌屬水平群落Bar圖

樣品A特有的優(yōu)勢菌屬為未鑒定的真菌屬(unclassified_k_fungi)占27.68%；樣品S特有的優(yōu)勢菌屬為油壺菌屬(Olpidium)占15.77%；樣品M特有的優(yōu)勢菌屬為油壺菌屬(Olpidium)占31.84%；樣品T特有的優(yōu)勢菌屬為油壺菌屬(Olpidium)占16.38%?？矁壕嬘盟淖晕覂艋芰Α⒚耖g流傳的助于消化、消除疲勞等功能等科學問題，仍待通過進一步研究水質分析、分離鑒定其中可培養(yǎng)的微生物菌株及其產(chǎn)酶活性檢測等研究結果才能得到解析。

對4種坎兒井水中的真菌進行分析結果表明，在26S rRNA 門水平上，樣品A、S、M、T中優(yōu)勢菌門均為子囊菌門(Ascomycota)，分別占56.76%，61.07%，46.92%，44.59%。在屬水平上，樣品A中優(yōu)勢菌屬為未鑒定的真菌屬(unclassified_k_fungi)，占27.68%；樣品S、M、T中優(yōu)勢菌屬為油壺菌屬(Olpidium)，分別占15.77%，31.84%，16.38%。在種水平上，樣品A中優(yōu)勢菌種是未鑒定的真菌種(unclassified_k_fungi)，占27.68%；樣品S、M、T中優(yōu)勢菌種是油壺菌種(Olpidiumsp)，分別占15.77%，31.49%，16.38%。此外還檢出Candida、Pichia、Mortierella、Aspergillus、Alternaria等菌屬，以上屬的占比雖少，但它們能影響傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶風味的形成及成熟過程[15-16]。Candida、Pichia等屬還參與傳統(tǒng)發(fā)酵飲料博扎的發(fā)酵過程，而且是博扎發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌屬[17-18]。Candida也是發(fā)酵飲料開菲爾中的酵母之一，它給開菲爾帶來醇味、脂香和CO2的同時起到改善開菲爾口感的作用[19]。

阿爾菲亞等[12,20]曾采用阿木爾坎兒井水(試驗中的樣品A)制成的傳統(tǒng)馕餅酸面團進行微生物多樣性分析，結果顯示其優(yōu)勢菌門為Firmicutes、Ascomycota。該結果與試驗中的相比較，雖然在門水平有共同點，但是在屬水平存在很大的差距。與吐魯番傳統(tǒng)馕餅面團相比，用坎兒井水和的面團芳香類物質種類豐富，相對百分含量較高[20]。因此推測：坎兒井水中微生物并非是新疆馕餅傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團中優(yōu)勢微生物直接來源，可能是坎兒井水中某些成分影響面團發(fā)酵過程中優(yōu)勢微生物變化趨勢，影響了酸面團揮發(fā)性物質的種類及其變化，從而改善了馕餅風味。

變性菌門是細菌中最大的一個門，包括很多病原菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、幽門螺桿菌等。試驗過程中未從坎兒井水中檢測出對人體有毒有害的微生物信息，符合GB 8537—2018《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水》和GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》對食品加工用水微生物的要求。

3 結論

采用高通量測序技術對新疆吐魯番4種不同坎兒井飲用水進行微生物群落組成及多樣性分析。結果表明：細菌在屬水平，嗜氫菌屬占優(yōu)勢，其次為不可鑒定的絲毛單胞菌屬、曲桿菌屬、單胞菌屬；在種水平，不可鑒定的嗜氫菌種占優(yōu)勢，其次是不可鑒定的絲毛單胞菌種。關于真菌多樣性方面在屬水平上，油壺菌屬占優(yōu)勢，其次是不可鑒定的真菌屬；在種水平，油壺菌種占優(yōu)勢，其次是不可鑒定的真菌種。但關于坎兒井水質的物理化學等其他指標能否符合國家標準、當?shù)鼐用衲芊癜残娘嬘?、能否滿足于食品加工用水的要求、坎兒井水對飲食文化及人類健康的貢獻等方面之后再進一步深度研究。