白雪峰，萬曉燕,惠彩霞

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 延安716000)

心肌纖維化是多種心臟疾病進展過程中心肌組織重塑的病理過程，如不及時干預(yù)則會導(dǎo)致心肌收縮及舒張功能障礙，進而發(fā)展為心力衰竭[1-2]。炙甘草湯最早記載于《傷寒論》，具有通陽復(fù)脈的功效，主要治療脈結(jié)代、心動悸等。近年來現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，炙甘草湯可保護心肌缺血再灌注損傷后左心功能[3]，抑制擴張型心肌病患者心肌纖維化及心室重構(gòu)[4]。NF-κB通路為體內(nèi)重要的炎癥因子相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其在心肌纖維化等疾病進展過程中扮演著重要角色[5]。本實驗通過觀察炙甘草湯對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌纖維化大鼠心肌NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)作用，旨在進一步探討炙甘草湯的藥理作用，為其臨床應(yīng)用提供更多依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 雄性Wistar大鼠72只，6～8月齡，體重220～240 g，購于延安大學(xué)動物實驗中心，動物合格證號：SCXK(陜)2020-010。大鼠飼養(yǎng)于溫度22～25 ℃、晝夜節(jié)律正常的清潔級動物房內(nèi)。

1.2主要藥物及試劑 炙甘草湯組方：炙甘草15 g、生姜10 g、桂枝10 g、人參6 g、生地黃15 g、阿膠6 g、麥冬10 g、麻仁10 g、大棗15 g，中藥材飲片購自北京同仁堂股份有限公司，煎煮濃縮成生藥含量為3 g/mL的湯劑；吡咯二硫氨基甲酸酯(PDTC，北京百奧萊博科技有限公司，貨號：YT344)；異丙腎上腺素(上海禾豐制藥有限公司，規(guī)格：2 mL∶1 mg，批號：201810121)；生理鹽水(中國大冢制藥有限公司，批號：201812031)；NF-κB p65、p-NF-κB p65兔單克隆抗體(賽默飛世爾科技公司，貨號：436700和MA5-15181)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(碧云天生物技術(shù)公司，貨號：P0018M和A0208)；總RNA提取試劑盒(加拿大Norgen Biotek公司，貨號：17200)；實時熒光定量PCR試劑盒(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，貨號：EM202-200T)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：AB-4366596)及PCR引物設(shè)計及合成(美國Invitrogen公司)；HE及Masson染色試劑盒(北京索萊寶科技公司，貨號：G1120和G1340)。

1.3設(shè)備及儀器 Multiskan GO全波長酶標儀(賽默飛世爾科技公司)；VisualSonics小動物超聲儀(上海溪拓科學(xué)儀器有限公司)；DM2500光學(xué)/熒光顯微鏡(德國Leica公司)；JY-1508R輪轉(zhuǎn)式切片機(北京佳源興業(yè)科技有限公司)；Gel Doc EZ凝膠成像儀系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；CR22N高速冷凍離心機(日本Hitachi公司)。

1.4實驗方法 將72只健康雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組、心肌纖維化組、炙甘草湯低劑量組、炙甘草湯中劑量組、炙甘草湯高劑量組及吡咯二硫氨基甲酸酯組，每組12只。除正常對照組外，其余組大鼠均參照文獻[6-7]方法給予異丙腎上腺素5 mg/kg腹腔注射，1次/d，連續(xù)注射14 d后每組隨機取1只大鼠進行心肌組織病理學(xué)檢查，以大鼠心肌出現(xiàn)明顯纖維化視為造模成功。證實造模成功后第2天，炙甘草湯低、中、高劑量組參考文獻[8]給藥劑量分別給予2 mL/kg、4 mL/kg、8 mL/kg的炙甘草湯灌胃，吡咯二硫氨基甲酸酯組參考文獻[9]方法給予吡咯二硫氨基甲酸酯200 mg/kg腹腔注射，正常對照組及心肌纖維化組給予生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)21 d。

1.5檢測指標及方法

1.5.1左心室射血分數(shù)(LVEF)、心室短軸縮短率(LVFS)的測定 末次干預(yù)24 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠后，利用小動物超聲儀進行超聲心動圖檢查，記錄LVEF、LVFS。

1.5.2血流動力學(xué)的測定 超聲心動圖檢查后，經(jīng)頸動脈心室內(nèi)插管，連接壓力換能器，使用生物信息采集系統(tǒng)記錄大鼠左室收縮壓(LVSP)及左室舒張末壓(LVEDP)。

1.5.3心肌組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白水平測定 處死各組大鼠，取部分心肌組織，根據(jù)ELISA試劑盒說明書方法測定大鼠心肌組織中TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白水平。

1.5.4心肌組織病理學(xué)觀察 取部分心肌組織，固定于10%中性福爾馬林溶液中24 h，石蠟包埋后進行切片，厚度為5 μm，行常規(guī)HE及Masson染色，每只大鼠隨機取3張切片，每張切片取5個視野，采用盲法在顯微鏡下觀察。

1.5.5心肌組織中NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達水平測定 取大鼠心肌組織20 mg，加入裂解液研磨裂解，提取總蛋白，取相當于50 μg蛋白的心肌組織裂解液，上樣至十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，分別經(jīng)NF-κB p65、p-NF-κB p65兔單抗(1∶1 000倍稀釋)在4 ℃下孵育過夜，然后在含吐溫磷酸鹽緩沖液中清洗30 min，經(jīng)辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶2 000倍稀釋)孵育后，滴加顯影液，采用化學(xué)發(fā)光法使用凝膠成像儀成像，使用ImageJ 1.8.0軟件對各蛋白表達水平進行量化分析。

1.5.6心肌組織中NF-κB p65 mRNA表達量測定 取大鼠心肌組織20 mg，按照說明書使用TRIzol試劑進行RNA提取，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法用于分析NF-κB p65 mRNA相對表達量。引物序列：NF-κB p65正向引物為5’-CACCACGCTCTTCTGTCTACTG-3’，反向引物為5’-GCTACGGGCTTGTCACTCG-3’；GAPDH 正向引物為5’-TCCGGTTTCCATATTACAGAAC-3’，反向引物為5’-GTGCCCTACGATATGCCCTTGC-3’。反應(yīng)體系：PCR Master Mix 10 μL，正、反向引物各0.4 μL，DNA模版2 μL，加入無菌蒸餾水至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共計40個循環(huán)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠LVEF、LVFS比較 心肌纖維化組LVEF、LVFS均顯著低于正常對照組(P均<0.05)；炙甘草湯各劑量組及吡咯二硫氨基甲酸酯組LVEF、LVFS均顯著高于心肌纖維化組(P均<0.05)，且LVEF、LVFS隨著炙甘草湯劑量的增加而逐漸升高，炙甘草湯各劑量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。

表1 正常對照組和心肌纖維化各組大鼠LVEF、LVFS比較

2.2各組大鼠血流動力學(xué)比較 與正常對照組比較，心肌纖維化組LVSP顯著降低(P<0.05)，LVEDP顯著升高(P<0.05)；與心肌纖維化組比較，炙甘草湯各劑量組及吡咯二硫氨基甲酸酯組LVSP顯著升高(P均<0.05)，LVEDP顯著降低(P均<0.05)，且隨著炙甘草湯劑量的增加，LVSP逐漸升高，LVEDP逐漸降低，炙甘草湯各劑量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

表2 正常對照組和心肌纖維化各組大鼠LVSP、LVEDP比較

2.3各組大鼠心肌組織中TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白水平比較 心肌纖維化組心肌組織中TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白水平顯著高于正常對照組(P均<0.05)；炙甘草湯各劑量組及吡咯二硫氨基甲酸酯組心肌組織中TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白水平均顯著低于心肌纖維化組(P均<0.05)，且TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白水平隨炙甘草湯劑量的增加而逐漸降低，炙甘草湯各劑量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表3。

表3 正常對照組和心肌纖維化各組大鼠心肌組織中TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白水平比較

2.4各組大鼠心肌病理學(xué)表現(xiàn) 正常對照組大鼠心肌組織未見明顯病理學(xué)變化；心肌纖維化組大鼠出現(xiàn)大量不規(guī)則膠原沉積及心肌纖維化改變；炙甘草湯各劑量組及吡咯二硫氨基甲酸酯組大鼠心肌纖維化改變較心肌纖維化組輕，膠原沉積減少。見圖1及圖2。

圖1 正常對照組和心肌纖維化各組大鼠心肌組織HE染色情況(×200)

圖2 正常對照組和心肌纖維化各組大鼠心肌組織Masson染色情況(×100)

2.5各組大鼠心肌組織中NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達水平比較 心肌纖維化組心肌組織中NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65均顯著高于正常對照組(P均<0.05)；炙甘草湯各劑量組及吡咯二硫氨基甲酸酯組心肌組織中NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65均顯著低于心肌纖維化組(P均<0.05)，且NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65隨著炙甘草湯劑量的增加而逐漸降低，炙甘草湯各劑量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖3。

圖3 正常對照組和心肌纖維化各組大鼠心肌組織中NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達情況

2.6各組大鼠心肌組織中NF-κB p65 mRNA表達量比較 正常對照組、心肌纖維化組、炙甘草湯低劑量組、炙甘草湯中劑量組、炙甘草湯高劑量組及吡咯二硫氨基甲酸酯組大鼠心肌組織中NF-κB p65 mRNA表達量分別為1.03±0.32，7.71±0.48，6.19±0.23，4.64±0.31，1.49±0.17，1.16±0.15，心肌纖維化組顯著高于正常對照組，炙甘草湯各劑量組及吡咯二硫氨基甲酸酯組均顯著低于心肌纖維化組，且炙甘草湯高劑量組顯著低于炙甘草湯中劑量組，炙甘草湯中劑量組顯著低于炙甘草湯低劑量組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

3 討 論

心肌纖維化是指冠狀動脈粥樣硬化性狹窄等原因引起的心臟長期持續(xù)性的反復(fù)缺血、缺氧等疾病因素及藥物因素導(dǎo)致的心肌組織細胞結(jié)構(gòu)及功能性病變，會引發(fā)心律失常及心力衰竭等[10]，目前尚無確切治療方法。

炙甘草湯是治療陰血陽氣虛弱、心脈失養(yǎng)的經(jīng)典方。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)炙甘草湯對擴張型心肌病、病毒性心肌炎及心肌缺血再灌注損傷等心臟疾病均有顯著效果[11]。王慶高等[12]研究發(fā)現(xiàn)在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用炙甘草湯能夠顯著降低擴張型心肌病患者體內(nèi)透明質(zhì)酸、Ⅲ型前膠原、層黏連蛋白水平，進而改善患者心功能并抑制心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。娜幾娜·吾格提等[13]研究發(fā)現(xiàn)炙甘草湯能夠有效縮短快速起搏兔右心耳組織場電位時程，可逆轉(zhuǎn)心房顫動誘導(dǎo)的心肌纖維化。這些研究提示炙甘草湯有治療心肌纖維化的巨大潛力。

LVEF、LVFS、LVSP、LVEDP是臨床常用的反映心功能的指標，LVEF、LVFS、LVSP降低及LVEDP升高均提示心功能降低[14]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，心肌纖維化組大鼠LVEF、LVFS、LVSP降低，LVEDP升高；炙甘草湯各劑量組大鼠LVEF、LVFS、LVSP呈劑量依賴性升高，LVEDP呈劑量依賴性降低。提示炙甘草湯能夠呈劑量依賴性的顯著改善心肌纖維化大鼠的心功能。

TNF-α是一種炎癥誘導(dǎo)因子，其在心肌纖維化進展中起著重要作用[15]。沈雁等[16]研究指出TNF-α參與了心肌纖維化病理進展的調(diào)控過程，抑制TNF-α水平能夠抑制心臟成纖維細胞的增殖，進而抑制心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展。TGF-β1作為一種成纖維因子，在誘導(dǎo)膠原沉積及心肌纖維化過程中發(fā)揮重要作用。任學(xué)嬌等[17]研究發(fā)現(xiàn)在心肌纖維化大鼠心肌組織中TGF-β1水平明顯升高，而抑制TGF-β1水平則能夠改善心功能及減輕心肌纖維化程度。Ⅰ型膠原蛋白及Ⅲ型膠原蛋白水平升高可促進心肌膠原沉積，進而加重心肌纖維化程度。張志剛等[18]研究發(fā)現(xiàn)心肌纖維化大鼠Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白水平顯著升高，二者水平可隨著心肌組織纖維化程度的減輕而明顯降低。本實驗結(jié)果顯示，心肌纖維化組大鼠心肌組織中TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白水平較正常對照組顯著升高，心肌組織呈明顯纖維化改變；炙甘草湯各劑量組大鼠心肌組織中TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白水平呈劑量依賴性降低，心肌組織纖維化改變減輕。這提示炙甘草湯能夠通過降低心肌纖維化誘導(dǎo)刺激因子水平，進而逆轉(zhuǎn)心肌組織的病理性改變。

NF-κB作為細胞對體內(nèi)炎癥因子及多種刺激因子響應(yīng)的信號通路，在肝、肺等多種組織器官纖維化過程中發(fā)揮著重要作用。近年來研究表明，NF-κB信號通路激活后可誘導(dǎo)體內(nèi)炎癥因子在心肌組織聚集，進而誘導(dǎo)心肌成纖維細胞增殖，加重膠原沉積，誘導(dǎo)心肌纖維化的發(fā)生[19]。符麗娟等[20]研究發(fā)現(xiàn)，心肌纖維化大鼠體內(nèi)NF-κB通路過度激活，而抑制NF-κB通路的異常激活可明顯減輕心肌組織氧化應(yīng)激損傷程度，抑制炎癥因子的釋放，減少心肌間質(zhì)纖維。吳志雄等[21]發(fā)現(xiàn)抑制糖尿病心肌纖維化大鼠NF-κB表達能夠減少大鼠心肌組織膠原沉積及抑制纖維化進展。李博濤等[22]證實NF-κB通路參與了大鼠心肌纖維化過程，替米沙坦能夠通過降低心肌組織中NF-κB表達水平改善大鼠心功能，抑制心肌纖維化。吡咯二硫氨基甲酸酯是藥理作用機制明確的NF-κB通路抑制劑[23]，所以本實驗使用該藥作為陽性對照藥物。本實驗結(jié)果顯示，炙甘草湯各劑量組及吡咯二硫氨基甲酸酯組大鼠心肌組織中NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達水平及NF-κB p65 mRNA相對表達量均明顯低于心肌纖維化組，且各指標隨著炙甘草湯劑量的增加而逐漸降低，提示炙甘草湯可劑量依賴性的抑制大鼠心肌組織NF-κB表達，進而改善大鼠心功能并抑制纖維化進展。

綜上所述，炙甘草湯能夠改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌纖維化大鼠心功能，抑制大鼠心肌纖維化改變，其機制可能與調(diào)節(jié)NF-κB信號通路有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。