張艷嬌 廖振中 林艾和 李蓉 黃寬 范源 朱培芳

【摘要】目的：對不同煎煮時間下的10批三果湯散進行指紋圖譜分析，評價其相似性，為其質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法：采用HPLC-DAD指紋圖譜對煎煮時間為20、30、40、50min的10批三果湯散進行檢測，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》進行相似度評價，并采用SIMCA 14.1軟件進行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）、有監(jiān)督模式正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）、Origin2019b軟件進行聚類分析（Cluster Analysis，CA）。結(jié)果：通過指紋圖譜對10批三果湯散分析發(fā)現(xiàn)，其共有14個分離度較好、峰面積較大的峰，經(jīng)對照品指認出6個峰，分別是沒食子酸（Galiic acid，GA）、柯里拉京（Corilagin）、訶黎勒酸（C heulagic acid，CHA）、1，2，3，4，6-O-五沒食子酰葡萄糖（PGG）、訶子酸（Chebulinic acid，CHI）、鞣花酸（Ellagic acid，EA）;不同煎煮時間下10批三果湯散的相似度評價結(jié)果都在0.9以上;CA、PCA分析發(fā)現(xiàn)可將不同煎煮時間下的10批三果湯聚為4類，CA可將6個化合物聚為2類，GA一類，其他5個化學(xué)成分一類，表明GA在三果湯散中的含量與其他成分存在較大差異。結(jié)論：傳統(tǒng)的中藥煎煮時間對藥物的藥效及性能存在著一定影響，本實驗可以簡便、快捷地判斷出煎煮時間對香格里拉藏醫(yī)院的10批三果湯散的影響總體差異不大，對三果湯散質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用都有重要意義。

【關(guān)鍵詞】三果湯散;指紋圖譜;煎煮時間;聚類分析;主成分分析

【中圖分類號】R283.1【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2021）18-0047-07

HPLC Fingerprint of 10 Batches of Triphala at Different Decocting TimeZHANG Yanjiao1LIAO Zhenzhong2LIN Aihe1LI Rong1HUANG Kuan1FAN Yuan1，3*ZHU Peifang1

1.Yunnan University of Chinese Medicine College of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500， China;

2.Tibetan Hospital of Diqing Tibetan Autonomous Prefecture of Yunnan，Diqing 674499，China;

3.Yunnan University of Chinese Medicine Second Affiliated Hospital，Kunming 650216，ChinaAbstract：Objective The fingerprints of 10 batches of Triphala with different decocting time were analyzed to evaluate its similarity and provide basis for its quality control and clinical application.Methods HPLC-DAD fingerprint was used to detect 10 batches of Triphala with decocting time of 20，30，40，50 min，and the similarity was evaluated by the Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprint （2012 edition），the Principal Component Analysis （PCA），supervised model of OPLS-DA of SIMCA 14.1，Cluster Analysis （CA） and Origin2019b were used to analyze the 10 batches of Triphala.Results Based on the fingerprint analysis of 10 batches of Triphala，it was found that there were 14 peaks with good resolution and large peak area，and 6 peaks were identified by the control sample，namely，Gallic acid （GA），Corilagin，Cheulagic acid （CHA），1，2，3，4，6-O-6-gallyl-glucose （PGG），Chebulinic acid （CHI），Ellagic acid （EA）. The results showed that there were 14 peaks with good resolution and large peak area in 10 batches of Triphala，and 6 peaks were identified by the control sample. The similarity evaluation results of 10 batches of Triphala under different boiling time were all above 0.9. CA analysis showed that 10 batches of Triphala under different boiling time could be grouped into 4 groups，and 6 compounds could be grouped into 2 groups. The results showed that the content of GA in Triphala was quite different from that of other components.Conclusion The Traditional Chinese Medicine decocting time has some influence on the efficacy and performance of the medicine. This experiment can judge the influence of the decocting time on 10 batches of Triphala powder in Shangri-la Tibetan Hospital is not significantly different，which is of great significance to the quality control and clinical application of Triphala decoction.

Keywords：Triphala; Fingerprint; HPLC; Decocting Time; CA; PCA; Chemical Composition

三果湯散由余甘子（Phyllanthus emblica Linn.）、訶子（Terminalia chebula Retz.）和毛訶子[Terminalia bellirica （Gaertn.） Roxb.]三味藥材磨成細粉，按比例為1∶1∶1組成，是藏醫(yī)最常見的基礎(chǔ)方，有研究表明[1]三種藥物比例相等時，存在正相互作用，又稱“哲布松湯”，在印度阿育吠陀醫(yī)學(xué)中應(yīng)用也較為廣泛。三果湯散具有抗氧化[2]、抗紅細胞增多癥[3]、抗糖尿病[4]的作用;最新研究[6]表明三果湯具有調(diào)節(jié)腸道微生物[5]、治療口腔疾病如牙周炎、抗微生物感染[7]、影響腫瘤血管生成[8]等作用。其中，酚酸鞣質(zhì)類成分是三果湯的主要化學(xué)成分，較多研究者對其單一成分如沒食子酸（Galiic acid，GA）進行質(zhì)量控制研究，或者分別測定余甘子、訶子、毛訶子三種藥物中GA的含量[9-11]。李斌等[12]對三果湯中的GA、柯里拉京（Corilagin）、鞣花酸（Ellagic acid，EA）進行含量測定，張海偉等[13]采用HPLC法對不同批次藏藥三果湯中主要酚酸類成分GA、EA進行含量測定。目前相關(guān)報道對三果湯散質(zhì)量控制研究都不全面，測定時因其特征成分不統(tǒng)一，專屬性差，難以實現(xiàn)質(zhì)量控制標準化[14]。故增加指標性成分檢測及指紋圖譜的建立可更好地為三果湯的質(zhì)量控制研究提供依據(jù)。

傳統(tǒng)中藥的煎劑具有悠久的歷史，現(xiàn)代中醫(yī)臨床仍應(yīng)用廣泛[15]。中藥所含的化學(xué)成分會隨煎煮時間不同發(fā)生變化，根據(jù)疾病的不同，中藥的煎煮時間的確立具有重要意義。指紋圖譜分析是近代藥物尤其是組方中藥用得最普遍的一種質(zhì)控研究方法，其是評價中藥質(zhì)量一致性、真實性、產(chǎn)品穩(wěn)定性的一種可行性模式分析[16]。本實驗采用HPLC法指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式分析不同煎煮時間下的10批三果湯散的穩(wěn)定性，以期為三果湯散的質(zhì)量控制研究及臨床應(yīng)用提供參考。

1實驗材料

1.1儀器KDM調(diào)溫電熱套，常州國華電器有限公司;EYEL4型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司;YL-080ST型超聲清洗機，深圳市語路清洗設(shè)備有限公司;FA1004N型萬分之一電子分析天平，上海菁海儀器有限公司;Agilent 1200 系列高效液相色譜儀（VWD紫外檢測器），美國安捷倫公司。

1.2試藥及試劑訶子酸（批號wkq20032707，含量≥98%;購于四川維克奇生物科技有限公司）;訶黎勒酸（批號wkq20042206，含量≥98%;購于四川維克奇生物科技有限公司）;1，2，3，4，6-O-五沒食子酰葡萄糖（批號14937-32-7，含量≥98%;購于成都普法瑞科技有限公司）;沒食子酸對照品（批號wkq16081904，含量≥98%;購于四川維克奇生物科技有限公司）;柯里拉京對照品（批號wkq20032604，含量≥98%;購于四川維克奇生物科技有限公司）;鞣花酸對照品（批號MO104AS，含量≥98%;購于美倫生物）;純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司），其余試劑均為分析純;10批三果湯散由香格里拉藏醫(yī)院制備，詳細情況見表1。

2方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1混合對照品溶液的制備分別精密稱取對照品GA、Corilagin、EA、CHI、CHA、PGG置于容量瓶中，用70%的甲醇溶解并定容至刻度，配置成濃度為0.43、0.32、0.23、0.58、0.23、0.58mg/mL的標準品溶液;取以上標準品溶液超聲混勻，過0.45μm微孔濾膜，制備混合對照品溶液。

2.1.2樣品溶液制備分別取10.0g不同批次的三果湯散，加入150mL水，浸泡30min，于電熱套上回流加熱20、30、40、50min，過濾，至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干，溫度為75℃，加入70%的甲醇30mL溶解樣品，至于50mL離心管中，超聲20min，離心3000r，離心5min，取上清液過0.45μ微孔濾膜，即得40個樣品溶液。

2.1.3色譜條件采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相為磷酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫，檢測波長273nm，柱溫25℃，流速1.0mL/min。梯度見表2。表2洗脫程序時間/min甲醇/%0557103035404545

2.2方法學(xué)考察以樣品S1為測試樣品，按“3.1.2”煎煮30min，進行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實驗，考察該分析方法的可靠性。

2.2.1精密度實驗取S1樣品，按“3.1.2”煎煮30min處理樣品，按“3.1.3”色譜條件連續(xù)進樣6次，以4號峰（沒食子酸）為參照峰，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果14個共有峰的相對保留時間RSD小于0.2%，相對峰面積小于0.7%，表明儀器精密度良好。

2.2.2重復(fù)性實驗取S1樣品，按“3.1.2”煎煮30min，制備樣品6份，按“3.1.3”色譜條件分別進樣，以4號峰（沒食子酸）為參照峰，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果14個共有峰的相對保留時間RSD小于0.21%，相對峰面積RSD小于0.55%，表明樣品重復(fù)性較好。

2.2.3穩(wěn)定性實驗取S1樣品，按“3.1.2”煎煮30min制備樣品，分別在0、2、4、6、8、10、12h進樣，以4號峰（沒食子酸）為參照峰，結(jié)果14個共有峰的相對保留時間RSD小于0.6%，相對峰面積RSD小于0.8%，表明穩(wěn)定性較好。

2.3不同煎煮時間下10個批次的三果湯散指紋圖譜結(jié)果分析

2.3.1相似度評價對不同批次的三果湯散進行指紋圖譜分析，將圖譜以“AIA”的格式導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012A（國家藥典委員會）”軟件，進行數(shù)據(jù)分析。以N1為參照圖譜，時間窗寬度為0.1min采用多點校正進行全譜峰匹配。選擇5min以后、文獻報道較多的主要成分以及分離度較好的峰共14個共有峰。10批三果湯散指紋圖譜匹配，計算相似度。見表3。

各批次的藥物相似度都在0.9以上，說明該方劑品質(zhì)均一穩(wěn)定，差異不大，其中煎煮20、30min時都以S8的相似度最低，40、50min時以S7的最低，S1較好。

不同煎煮時間的三果湯對照圖譜及疊加圖譜如圖1所示，其中N1～N10為煎煮20min，N11～N20為煎煮30min，N21～N30為煎煮40min，N31～N40為煎煮50min;混合對照品如圖2所示，采用對照品指認了6個共有峰，分別是沒食子酸酸（4）、柯里拉京（8）、訶黎勒酸（10）、1，2，3，4，6-O-五沒食子酰葡萄糖（12）、訶子酸（13）、鞣花酸（14）。

2.3.2聚類分析將10批三果湯散樣品的14個共有峰峰面積導(dǎo)入Origin2019b中的Cluster analysis中進行分析，CA顯示可將樣品分為四大類，N2、N6、N7、N8、N9、N10、N21、N22、N23、N28、N29、N32、N36、N37、N38、N39、N40共17個樣品為第Ⅰ類，N13、N14、N15、N16、N17、N19、N20共7個樣品為第Ⅱ類，N1、N3、N4、N5、N24、N25、N26、N27、N30、N31、N33、N34、N35共13個樣品為第Ⅲ類，N11、N12、N18共3個樣品為第Ⅳ類;如圖3所示，其中從N1～N40為10批藥材分別煎煮20～50min，按序排。

2.3.3主成分分析以14個共有峰為變量，將40個樣品導(dǎo)入SIMCA-P 14.1 軟件進行主成分（principal components analysis，PCA）分析。由圖可知，得分矩陣圖[R2X（cum）=0.992，Q2（cum）=0.967]，表明該模型預(yù)測較好，可將40個樣品區(qū)分為4類，該結(jié)果與CA一致。如圖4所示。

2.3.4正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）為了進一步檢驗樣本是否有效或者樣本間是否存在差異，找出對組分貢獻較大的變量，將不同煎煮時間下10個批次樣本共有的14個峰面積作為變量，導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件，采用OPLS-DA分析，觀察樣本聚集情況。其中R2X（cum）、R2Y（cum）和Q2（cum）分別是0.991、0.358、0.185，表明模型具有較好的預(yù)測性和穩(wěn)定性，且其分類結(jié)果與PCA分析結(jié)果基本一致。

圖5不同煎煮時間下10批樣品的OPLS-DA 得分圖載荷圖（LoadingBi plot，如圖6所示），峰1、3、4、6、12、14在第三類樣品（N1、N3、N4、N5、N24、N25、N26、N27、N30、N31、N33、N34、N35）等樣品周圍，因此這些峰在第三類樣品中貢獻較大;剩下的峰8個峰與第四類樣品（N11、N12、N18）樣品最接近，因此剩下的8個峰對第四類樣品聚類貢獻較大，而第一類及第二類樣品周圍無共有峰分布，說明這兩組樣品中各組分的含量差異較小。

在OPLS-DA模型中，為了篩選出樣品中差異性較大的成分，使用變量權(quán)重值（Variableimportanceinprojection，VIP）評價方法，VIP>1.00的變量對組間分類貢獻較大，具有統(tǒng)計學(xué)意義[17]。VIP>1.00的峰有5個：3號峰、5號峰、7號峰、10號峰（CHA）、13號峰（CHI）的VIP值分別為1.65、1.57、1.15、1.13、1.09，說明這幾個峰對組間分類貢獻較大。如圖7所示。

3討論

3.1色譜條件的選擇本實驗先后考察了乙腈與磷酸水溶液、乙腈醋酸水溶液、甲醇甲酸水溶液的比例，最后選擇了甲醇和0.1%的磷酸水溶液梯度洗脫可使標準品和樣品達到較好的分離效果，酚酸鞣質(zhì)類化合物在在273nm時有較強的紫外吸收，因此選擇273nm作為指紋圖譜的檢測波長。

3.2模式識別的分析本實驗建立不同煎煮時間對香格里拉藏醫(yī)院的10批三果湯散的指紋圖譜進行分析，顯示樣品都具有較高的相似性，在0.985～1之間。選擇分離度較高，峰面積較大的色譜峰共14個，經(jīng)對照品指認共有6個成分被分辨出來。不同煎煮時間的10批藥材從直觀結(jié)果分析顯示，其樣品含量較單一，藥材質(zhì)量無明顯差異。CA與PCA分析結(jié)果顯示可將不同煎煮時間下的10批三果湯散聚為4類，其分類情況存在一定的差異。并且通過OPLS-DA模型的載荷圖、VIP值分析，判斷14個峰對于樣品分類的具體作用，從而判斷出貢獻最大的峰。

3.3對不同煎煮時間下10批三果湯中6個化合物的相對峰面積變化的分析由聚類分析發(fā)現(xiàn)，40個樣本中的6個化合物可聚為兩大類，說明GA的含量與其他5個成分差異較大。如圖8所示。

圖86個化學(xué)成分峰面積聚類分析圖以4號峰（沒食子酸為對照），計算6個化合物的相對峰面積，并繪制曲線觀察可知，在煎煮20、30、40、50min時間內(nèi)，6個化合物的相對峰面積變化如圖9所示：S1～S10中的Corilagin、EA、PGG的趨勢基本一致，相對峰面積的大小也較穩(wěn)定，CHA在S1～S6、S8、S10中先增后降，以30min達到最大值，其中又以S1和S8中最高，且CHI與CHA在S8中趨勢一致，相對峰面積大小相當(dāng);CHI在S1～S7、S9～S10中都呈下降趨勢，以20min達到最大值，其中又以S1、S9中最高。

通過查閱文獻分析可知，三果湯散的組成方藥余甘子、訶子、毛訶子中都含有大量的酚酸鞣質(zhì)化合物，尤其是如GA、CHI、CHA、PGG、1，3，6-三-O-沒食子酰基葡萄糖等可水解鞣質(zhì)[18]。水解鞣質(zhì)在煎煮過程中，加熱的時間可能會使某些化合物分解成GA。本實驗將40個樣品中的6個已知的化合物峰面積進行CA分析發(fā)現(xiàn)，GA與其他5個化合物存在較大差異，在所有樣品中的聚集都是最明顯的，因此隨煎煮時間的增加，其他化合物可能會分解合成GA。峰面積折線圖比顯示10批三果湯散中以GA為參照，其他峰的峰面積比都小于1，差異變化較明顯的峰是10號（CHA）與峰13號（CHI），除CHA外，其他5個化學(xué)成分都在20min最高，綜上可考慮選擇20min或30min的煎煮時間為佳，但是不同煎煮時間下各成分的含量變化的相關(guān)性還需進一步研究。

目前三果湯指紋圖譜全方位的質(zhì)控研究報道較少，本實驗建立不同煎煮時間10批三果湯散指紋圖譜并結(jié)合化學(xué)模式分析的方法，操作便捷、方法穩(wěn)定，可為三果湯散的質(zhì)量控制及臨床使用提供參考，但其臨床應(yīng)用還需后期藥效學(xué)實驗進一步研究。

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基金項目：云南省高校重點實驗室項目。

作者簡介：張艷嬌（1995-），女，漢族，碩士，研究方向為中藥藥理學(xué)研究。E-mail：2531484362@qq.com

通信作者：范源（1966-），男，漢族，博士，教授，研究方向為中藥藥理。E-mail：1647909799@qq.com