李 哲,王 衛(wèi)

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,新發(fā)再發(fā)傳染病動(dòng)物模型研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,衛(wèi)健委人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能缺陷,繼發(fā)嚴(yán)重感染或腫瘤并致命,被稱之為艾滋病(acquired imunodeficiency syndrome, AIDS)。 根據(jù) 2020 年聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署公布數(shù)據(jù),截止2019 年底,全球HIV 感染者 3800 萬人,新感染 HIV 170 萬人,因AIDS 死亡69 萬人[1]。 在過去一段時(shí)間,科研人員從HIV“精英控制者”體內(nèi)分離出能中和多種遺傳差異 HIV 病毒株的廣譜中和抗體( broadly neutralizing antibodies, bNAbs)。 基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究數(shù)據(jù),bNAbs 不僅可阻斷HIV 病毒復(fù)制,還有助于清除感染細(xì)胞及增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng),成為HIV 疫苗研究一個(gè)關(guān)鍵而重要的方向。

1 bNAbs 的分離及鑒定

1.1 bNAbs 的分離

根據(jù)中和活性和分離時(shí)間,可將bNAbs 大致分為兩代。 第一代bNAbs 在20 世紀(jì)90 年代分離,具有有限的中和能力;自2009 年以來,科研人員分離出中和活性更高的廣譜中和抗體,被稱為第二代廣譜中和抗體。

1.1.1 第一代廣譜中和抗體

1994 年,Burton 等[2]使用噬菌體展示技術(shù),從HIV-1 B 亞型患者體內(nèi)分離識(shí)別gp120 CD4bs 的廣譜中和抗體 b12。 1994 年,Buchacher 等[3]將 HIV感染者PBMC 與雜交瘤細(xì)胞CB-F7 電融合后獲得識(shí) 別 gp120 聚 糖 (2G12)、 gp41 MPER (2F5、4E10)[4-5]的 bNAbs。 盡管第一代 bNAbs 在動(dòng)物模型上取得不錯(cuò)的結(jié)果,但臨床試驗(yàn)顯示這些bNAbs并不能有效抑制人體內(nèi)的HIV-1 病毒[6]。

1.1.2 第二代廣譜中和抗體

利用特異性單個(gè)B 細(xì)胞分選技術(shù)、B 細(xì)胞受體測(cè)序技術(shù)、及高通量中和抗體檢測(cè)等新技術(shù),新一代高效廣譜bNAbs 陸續(xù)被分離,且有更顯著的中和寬度[7]。 科研人員利用B 細(xì)胞分選、高通量篩選以及微量中和實(shí)驗(yàn)從A 亞型HIV 病毒感染者PBMC中獲得針對(duì)V1/V2 區(qū)且中和廣度不同的兩個(gè)抗體PG9 和 PG16[8]。 其 他 bNAbs 如 CH01-CH04[9]、PGT141-PGT145[10]、CAP256-VRC26.01-12[11]也用類似的方法獲得。 后來Sok 等[12]使用重組HIV包膜三聚體BG505 SOSIP.664 gp140 作為釣餌蛋白分離慢性感染者PBMC,發(fā)現(xiàn)新的廣譜中和抗體PGDM1400-1412。

1.2 bNAbs 的中和作用

bNAbs 直接與Env 三聚體結(jié)合,阻斷Env-CD4受體結(jié)合或病毒與宿主細(xì)胞融合。 根據(jù)抗原-抗體復(fù)合物的序列定位和結(jié)構(gòu)分析,已確定bNAbs 7 個(gè)中和位點(diǎn):(1)針對(duì)包膜蛋白Env 三聚體的第一及第二可變區(qū)(V1/V2 variable domain)(如抗體PG9,PGT145);(2)針對(duì)第三可變區(qū)(V3 variable domain)(如抗體PGT121,10-1074);(3)針對(duì)CD4bs(如抗體VRC01,N6,3BNC117);(4)針對(duì) gp120/gp41 的交界區(qū)域(如抗體35O22,8ANC195);(5)針對(duì)融合肽(如抗體VRC34.01,ACS202);(6)針對(duì) gp120 的“沉默”面(如抗體VRC-PG05,SF12);(7)針對(duì)gp41上近膜側(cè)外部區(qū)(MPER)(如抗體10E8)。

1.2.1 針對(duì)V1/V2 的bNAbs

Env 蛋白V1/V2 區(qū)被聚糖和可變環(huán)所掩蓋[13],結(jié)構(gòu)分析顯示針對(duì) V1/V2 區(qū)的特異性抗體,如PG9、PG16、CH01-04、PGT141-145,PGDM1400-1412,和 CAP256 - VRC26.01 - 33, 利用 CDRH3(complementarity-determining region 3 loops of heavy chain, CDRH3)穿透聚糖屏障,與 V1/V2、N156/N160 聚糖形成的四元表位相互作用[8-12]。 對(duì)類似于PGT141-145 的重輕鏈序列進(jìn)行富集,克隆獲得13 個(gè) PGT145 抗體變異體,命名為 PGDM1400-1412,其中 PGDM1400 中和寬度為 83%,IC50為0.003 μg/mL[12]。

1.2.2 針對(duì)V3 的bNAbs

針對(duì) V3 區(qū)的 bNAbs,如 PGT121、PGT128 抗體,通過不同角度突出環(huán)與V3 區(qū)聚糖作用[10,14]。 10-1074 對(duì)B 亞型病毒的中和寬度為67%,IC50為0.1 μg/mL[14]。

1.2.3 針對(duì)CD4bs 的bNAbs

細(xì)胞表面CD4 受體是Env gp120 的主要結(jié)合靶點(diǎn),gp120 上與CD4 結(jié)合的區(qū)域被稱為CD4 結(jié)合部位(CD4-binding site, CD4bs)。 在 HIV-1 感染中,CD4bs 在序列和結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出良好的異質(zhì)性,已誘導(dǎo)出數(shù)量最多的 bNAbs[15]。 CD4bs 抗體包括VRC01、VRC07、N6、3BNC117、N49P 可中和 90%以上的HIV-1 毒株[16-19]。 但很多毒株已對(duì)這類抗體產(chǎn)生抗性,必須克服這種耐藥性才能獲得最佳的臨床效果[20]。

1.2.4 針對(duì)MPER 的bNAbs

2012 年,Huang 等[21]分離出 MPER 特異性抗體10E8,識(shí)別 MPER 區(qū) C 端螺旋結(jié)構(gòu),中和寬度為98%,IC50值為 0.352 mg/mL。 有研 究證明 針對(duì)MPER 的免疫原刺激幼稚B 細(xì)胞可產(chǎn)生4E10、10E8樣抗體[22]。 因此,該抗體及相關(guān)的疫苗接種策略一直是研究熱點(diǎn)。

1.2.5 針對(duì)gp120/gp41 交界區(qū)的bNAbs

針對(duì) gp120/gp41 交界區(qū)的 35O22 是 Huang等[23]人于2014 年分離得到,中和寬度為62%,IC50值為0.033 mg/mL,是迄今為止針對(duì)gp120/gp41 交界區(qū)最有效力的bNAbs。

1.2.6 針對(duì)融合肽的bNAbs

gp41 亞基 N 端有15~20 個(gè)疏水殘基,稱為融合肽,是bNAbs 特異性識(shí)別的表位,融合肽序列具有高度保守性和特異性[24]。 VRC34.01、PGT151、ACS202 可以從不同的角度結(jié)合融合肽,并在融合肽多種構(gòu)象中發(fā)揮作用。 ACS202 的CDRH3 與融合肽形成的“β 鏈”相互作用,并識(shí)別gp120 N88 位保守的N-連接聚糖,中和寬度為45%[25]。

1.2.7 針對(duì)gp120 的“沉默”面的bNAbs

“沉默面”不受聚糖改變的影響,可保持對(duì)抗體識(shí)別和中和的敏感性。 VRC-PG05 是迄今為止唯一從患者體內(nèi)分離的與gp120 結(jié)合的抗體,中和寬度27%,IC50值為 0.8 μg/mL。 此外由 VRC-PG05 與gp120 復(fù)合物結(jié)合片段的共晶體結(jié)構(gòu)可看出,沉默面中心表位主要由N262、N295 和N448 位聚糖組成[26]。

1.3 bNAbs 的分子特點(diǎn)

bNAbs 具有許多共同的分子特征,首先,bNAbs要獲得中和廣度,需要發(fā)生多次體細(xì)胞高頻突變(somatic hypermutation, SHM);其次,bNAbs 通常有較長(zhǎng)的CDR3Hs[10,27],擁有更長(zhǎng)的CDR3Hs 通常被認(rèn)為與穿透Env 蛋白糖鏈屏障的能力有關(guān)[28-29];最后,HIV bNAbs 通常具有多反應(yīng)性/自身反應(yīng)性,多反應(yīng)性抗體一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)能夠與HIV-gp140 高親和力結(jié)合,此外還存在其他結(jié)合位點(diǎn)與病毒表面其他配體低親和力結(jié)合。 能夠結(jié)合不同種類的抗原,即為多反應(yīng)性。 多反應(yīng)性抗體通過異源配體結(jié)合或雜合作用增加其對(duì)病毒的整體表觀親和力[30]。

但bNAbs 也有各自的特點(diǎn)。 針對(duì)V1/V2 區(qū)的bNAbs 有24~32 個(gè)氨基酸組成的CDR3Hs[31],這與穿透V1/V2 區(qū)糖基屏障有關(guān)[32]。 這類抗體 VH突變頻率為 11% ~ 18%,VK/VL突變頻率為 9% ~16%[9]。 針對(duì) V3 區(qū)的 bNAbs 有 18~24 個(gè)氨基酸組成的中等長(zhǎng)度CDRH3,VH突變頻率為15%~23%,VK/VL突變頻率為9%~24%,突變通常涉及堿基的插入或刪除[10]。 CD4bs 抗體表現(xiàn)出高親和力成熟,VH和VK基因突變頻率分別為32%和20%[33]。 針對(duì)MPER 區(qū)的bNAbs 有17~22 個(gè)氨基酸組成的中等長(zhǎng)度CDRH3s,具有中高度的親和力,VH突變頻率為13%~21%,VK/VL突變頻率為6%~14%[33]。針對(duì)gp120/gp41 交界區(qū)的抗體種系基因?yàn)镮GHV-1-18*02-和IGLV-2-14*02,VH、VL突變頻率分別為35%、24%,35O22 具有 14 個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的CDRH3[23],這類抗體的誘導(dǎo)需用與Env 結(jié)構(gòu)相似的免疫原。 針對(duì)融合肽的ACS202 具有22 個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的 CDRH3, 盡管 VRC34.01 與 ACS202 和PGT151 有相同的IgHJ 種系基因J6*02,有由13 個(gè)氨基酸組成的相對(duì)較短的CDRH3[25]。 VRC-PG05重鏈和輕鏈種系基因?yàn)镮GHV3-7*01和IGKV4-1*01,其體細(xì)胞超突變的頻率分別為9%、6%[26],SF12 的 VH、VK突變頻率分別為 17%~25%、15%~21%[34]。 其他第二代廣譜中和抗體性質(zhì)信息見表1。

2 bNAbs 產(chǎn)生機(jī)制

深入探討促進(jìn)或抑制bNAbs 進(jìn)化的機(jī)制,可對(duì)HIV 疫苗的設(shè)計(jì)開發(fā)帶來啟示。 在自然感染期間,bNAbs 有兩種不同的進(jìn)化機(jī)制。

2.1 病毒進(jìn)化驅(qū)動(dòng)機(jī)制

HIV-1 毒株多樣性的產(chǎn)生,已被證實(shí)是誘導(dǎo)bNAbs 進(jìn)化的重要因素。 例如,bNAbs VRC26,針對(duì)于V1/V2 區(qū)N160 糖基表位的中和抗體,研究發(fā)現(xiàn)VRC26 抗體的譜系是由帶有N160 聚糖的SI 病毒(superinfecting virus, SI) 所 誘 導(dǎo)[11], T/F 病 毒(transmitted-Founder virus, T/F)因無 N160 聚糖而無誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的能力。 而后SI 病毒和T/F 病毒重組促進(jìn)env多樣性增高,刺激該類抗體繼續(xù)發(fā)生體細(xì)胞高頻突變,產(chǎn)生廣譜中和抗體。

2.2 譜系協(xié)同進(jìn)化機(jī)制

T/F Env 與B 細(xì)胞未突變共同前體(unmutated common ancestor, UCA)結(jié)合誘導(dǎo)自體中和抗體。受抗體中和作用影響,病毒變異發(fā)生免疫逃逸,協(xié)同譜系選擇對(duì)bNAbs 譜系更為敏感的逃逸突變體,從而為bNAbs B 細(xì)胞前體和親和力成熟提供持續(xù)刺激[40]。 因此,通過分析病毒-抗體協(xié)同進(jìn)化過程,利用不同Env 三聚體免疫bNAbs 中間體促進(jìn)抗體親和力成熟,就可能產(chǎn)生廣譜中和抗體。

2.3 其他影響因素的作用

除上述兩種機(jī)制外,還有其他因素影響bNAbs進(jìn)化。 宿主因素(種族、HLA 亞型、性別、年齡、傳輸),抗原特異性因素(病毒載量、抗原暴露時(shí)間、env多樣性),免疫環(huán)境(免疫細(xì)胞、抗體效應(yīng)功能、免疫球蛋白亞型)等因素都可能會(huì)影響bNAbs 的產(chǎn)生[41]。

續(xù)表1

3 基于bNAbs 的HIV 疫苗設(shè)計(jì)策略

3.1 聚焦保守表位的設(shè)計(jì)策略

由于部分中和抗體(antibodies that neutralize only a narrow range of viruses, nNAbs)和 bNAbs 靶向病毒包膜糖蛋白Env 相同區(qū)域,nNAbs 表位暴露可能會(huì)阻礙抗原與具有廣譜中和潛力B 細(xì)胞的結(jié)合[42],阻礙bNAb 的誘導(dǎo)。 因此驅(qū)動(dòng)抗體識(shí)別Env保守表位的一種方法是阻礙nNAbs 表位的暴露。另一種方法是將抗體應(yīng)答集中在Env 保守表位,例如CD4bs,需要優(yōu)化的免疫原方案包括選擇性去除聚糖,篩選單克隆抗體,然后再逐步恢復(fù)去除的聚糖,從而誘導(dǎo)抗體的寬度[43]。

3.2 序貫免疫設(shè)計(jì)策略

為了克服HIV-1 病毒多樣性的問題,可能需要不同的Env 抗原來引導(dǎo)體液反應(yīng)朝著高中和廣度方向發(fā)展。 基于HIV A、B 和C 進(jìn)化支序列設(shè)計(jì)的SOSIP 三聚體分別以單獨(dú)、組合雞尾酒療法以及依次順序形式給予家兔[44],結(jié)果表明,不同Env 三聚體依次順序誘導(dǎo)的情況下,中和抗體反應(yīng)得到促進(jìn)。 克服HIV-1 多樣性的另一種方法是使用鑲嵌抗原[43],通過設(shè)計(jì)針對(duì)Env 三聚體多個(gè)靶點(diǎn)的嵌合免疫原,引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng),以解決HIV 病毒遺傳多樣性的問題。

3.3 模仿自然感染的設(shè)計(jì)策略

HIV-1 T/F 病毒與HIV-1 bNAb 共進(jìn)化的研究表明,中和寬度的發(fā)展依賴于病毒env多樣性的增加[11]。 極少數(shù)慢性HIV-1 感染者會(huì)產(chǎn)生針對(duì)大多數(shù)病毒亞型廣譜和強(qiáng)效的中和抗體,這證明人類B細(xì)胞譜系可以克服HIV-1 病毒極端多樣性的問題。通過研究“精英中和者”體內(nèi)病毒抗體共進(jìn)化、bNAb的產(chǎn)生機(jī)制,尋找誘導(dǎo)產(chǎn)生bNAbs 的免疫原,可促進(jìn)HIV 疫苗的研發(fā)進(jìn)展。 由此概括出B 細(xì)胞譜系疫苗設(shè)計(jì)策略為:利用特異性B 細(xì)胞分選技術(shù)將bNAbs 和 bNAbs 前體分離,根據(jù) bNAbs 和 bNAbs 前體序列推斷 bNAbs 中間體序列(intermediate antibodies, IA)、UCA 序列,并設(shè)計(jì)出 IA、UCA 免疫原。

3.4 靶向bNAb B 細(xì)胞前體的設(shè)計(jì)策略

HIV-1 Env 和基于Env 設(shè)計(jì)的免疫原通常不會(huì)與bNAbs 的推斷種系前體相互作用,這可能是Env和基于Env 設(shè)計(jì)的免疫原無法有效誘導(dǎo)bNAbs 原因[45]。 “種系靶向”策略旨在激活表達(dá)未突變前體B 細(xì)胞,然后進(jìn)一步免疫引導(dǎo)bNAb 成熟[43]。 由于CD4bs 在HIV-1 毒株中相對(duì)保守,成為種系靶向疫苗研究的熱點(diǎn)。 此外,也開發(fā)出胚系免疫原,以誘導(dǎo)bNAbs 靶向Env 不同表位[43]。

4 總結(jié)

近來,抗體分離技術(shù)的進(jìn)步促使大量bNAbs 被發(fā)現(xiàn),隨后科研人員對(duì)于bNAbs 的功能特性進(jìn)行了諸多研究,但控制bNAbs 進(jìn)化產(chǎn)生的關(guān)鍵因素仍然未知,無法通過疫苗接種獲得bNAbs,限制了HIV疫苗研發(fā)。 目前無用于HIV bNAbs 研究的小動(dòng)物模型,SHIV 感染恒河猴是HIV 相關(guān)研究的理想模型。 但此模型在研究bNAbs 反應(yīng)生成機(jī)制存在一些缺陷:實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng),體液免疫反應(yīng)不確定等。 因此,為深入研究bNAbs 進(jìn)化生成機(jī)制,探索影響bNAbs 發(fā)生發(fā)展過程的關(guān)鍵因素,必須建立 HIV bNAbs 發(fā)生發(fā)展研究平臺(tái),特別是動(dòng)物模型平臺(tái)。因此,繼續(xù)開發(fā)和完善動(dòng)物疾病模型對(duì)于開發(fā)預(yù)防HIV 感染的有效疫苗同樣至關(guān)重要。