董瓊 李姣 劉永飛 楊光旭 胡媛媛 姜玉連 劉倩

異葉茴芹(Pimpinella diversifolia DC)隸屬于傘形科(Apiaceae)芹亞科(Apioideae)茴芹屬,為中國(guó)茴芹屬中最為廣布的一個(gè)種,又名山當(dāng)歸、苦爹菜［1］。異葉茴芹作為民間常用草藥,常用于風(fēng)寒感冒咳嗽、肺結(jié)核、痢疾等疾病的治療,具有解毒消腫、活血散淤的功能,還具抗腫痛、抗結(jié)核作用和一定程度的抗炎、止血、凝血活性［2,3］。目前有關(guān)異葉茴芹藥用功效的開(kāi)發(fā)利用的研究較為少見(jiàn),作者針對(duì)異葉茴芹提取物抗炎作用展開(kāi)了實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1材料來(lái)源 TD5A-WS 離心機(jī)、RE-6000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、FLUOstar Omega 多功能熒光酶標(biāo)儀(BMG LABTECH)、FB224 電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)、地塞米松磷酸鈉注射液(山西省芮城科龍獸藥有限公司,批號(hào)：20190602)、角叉菜膠(上海伊卡生物技術(shù)有限公司,批號(hào)：20191021)、超聲清洗機(jī)(精密清洗機(jī)械有限公司)、異葉茴芹植株(采自浙江省溫州市永嘉縣楓林鎮(zhèn)高塘村),SPF 級(jí)昆明種雌性小鼠(長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司,許可證號(hào)：SCXK 2014-0011),體重35～45 g。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1異葉茴芹粗提取物的功效研究

1.2.1.1異葉茴芹粗提物的制備 取異葉茴芹植株,干燥后切斷,粉碎后過(guò)60 目篩。用電子天平稱取5 g異葉茴芹粉末放入燒杯,加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液150 ml,在常溫下浸泡3 h,溫度為60 ℃,超聲40 min,超聲2 次,取燒杯中上清液。將取得的2 次上清液分別離心,再取離心管中上清液,裝入燒杯中,用保鮮膜封住燒杯口,放入冰箱冷藏貯存。

1.2.1.2小鼠分組飼養(yǎng) 適應(yīng)性飼養(yǎng)小鼠7 d 后,選取健康小鼠42 只,隨機(jī)分為三組,標(biāo)記為異葉茴芹提取物組、生理鹽水對(duì)照組、地塞米松組,每組14 只。均飼養(yǎng)于15～20 ℃,相對(duì)濕度45%～55%的清潔環(huán)境中,使用標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由攝食和飲水。

1.2.1.3小鼠足腫脹實(shí)驗(yàn) 參考已發(fā)表的文獻(xiàn)［4,5］,小鼠分組給藥連續(xù)7 d,小鼠灌胃劑量為0.2 ml/(次·只)。最后一次給藥前禁食不禁水16 h,給藥60 min 后于每只小鼠右后足腱膜下注射1%角叉菜膠0.04 ml,以左足為正常對(duì)照,致炎4 h 后,小鼠頸椎處脫臼處死,從小鼠膝關(guān)節(jié)處剪下左右兩后足,精密電子分析天平稱重。小鼠足腫脹度=右足重量(g)-左足重量(g),腫脹抑制率(%)=(空白對(duì)照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/空白對(duì)照組平均腫脹度×100%。

1.2.1.4小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn) 參考已發(fā)表的文獻(xiàn)［4,5］,最后一次給藥后60 min,尾靜脈注射0.25%伊文思藍(lán)生理鹽水液5 ml 后,立刻腹腔注射0.6%冰乙酸5 ml,15 min 后,頸椎脫臼處死小鼠,腹腔注射6 ml 生理鹽水,輕搖小鼠腹部,剪開(kāi)腹部皮毛,收集腹腔液,于3×103r/min 離心10 min,取上清液,用酶標(biāo)儀于590 nm 處測(cè)定OD 值。

1.2.2不同藥量異葉茴芹提取物的功效研究 將“1.2.1.1”中制備的異葉茴芹提取物溶液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸到溶液量<3 ml,再將所得溶液稀釋至3、6、12 ml。生藥量(g/ml)=投藥量/溶液體積。另選56 只昆明種小鼠,隨機(jī)分為高、中、低濃度組(總黃酮生藥量分別為1.67、0.83、0.42 g/ml)和空白對(duì)照組(等體積的生理鹽水),每組14 只。

1.2.2.1常壓耐缺氧性研究 參考已發(fā)表的文獻(xiàn)［6］,連續(xù)灌胃給藥7 d,灌胃劑量為每只小鼠0.2 ml/次。把小鼠放入盛有5 g鈉石灰的250 ml廣口瓶中,加蓋密封,以呼吸停止(小鼠胸部不起伏)為指標(biāo),記錄小鼠死亡時(shí)間。

1.2.2.2免疫效果研究 于最后一次給藥后24 h 對(duì)小鼠進(jìn)行脫頸處死,稱重記錄后環(huán)切摘除小鼠的胸腺及脾臟,稱重并記錄,按照如下公式計(jì)算小鼠的脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/小鼠稱重(g)。胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/小鼠稱重(g)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t 檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1異葉茴芹粗提物對(duì)角叉菜膠致小鼠足腫脹抑制率的影響 異葉茴芹提取物組和生理鹽水組的腫脹度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；地塞米松組的腫脹度顯著低于生理鹽水組和異葉茴芹提取物組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；異葉茴芹提取物組腫脹抑制率顯著低于地塞米松組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明異葉茴芹粗提物具有輕微的抗炎效果,但其有效成分濃度并不高,有待進(jìn)一步純化。見(jiàn)表1。

表1 異葉茴芹粗提物對(duì)角叉菜膠致小鼠足腫脹抑制率的影響(,%)

表1 異葉茴芹粗提物對(duì)角叉菜膠致小鼠足腫脹抑制率的影響(,%)

注：與地塞米松組比較,aP<0.05

2.2異葉茴芹粗提物對(duì)冰乙酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響 地塞米松組OD 值低于生理鹽水組,但比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；異葉茴芹提取物組OD值高于生理鹽水組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明地塞米松對(duì)于冰乙酸所引起的小鼠腹腔毛血管通透性具有一定的抑制作用,而異葉茴芹粗提物未有抑制作用,且提高了冰乙酸所引起的毛細(xì)血管通透性,可能是異葉茴芹粗提物中某種成分具有一定的毒性。見(jiàn)表2。

表2 異葉茴芹粗提物對(duì)冰乙酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響()

表2 異葉茴芹粗提物對(duì)冰乙酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響()

注：與生理鹽水組比較,aP<0.05

2.3異葉茴芹提取物對(duì)小鼠耐缺氧性的影響 中濃度組、低濃度組的死亡時(shí)間與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高濃度組的死亡時(shí)間略高于空白對(duì)照組,但比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示異葉茴芹中、低濃度劑量對(duì)提高小鼠的耐缺氧性均無(wú)明顯效果,僅異葉茴芹高濃度有效,但效果甚微,可能是其含有的有效成分含量不高。見(jiàn)表3。

表3 異葉茴芹粗提物對(duì)小鼠耐缺氧性的影響(,min)

表3 異葉茴芹粗提物對(duì)小鼠耐缺氧性的影響(,min)

注：與空白對(duì)照組比較,aP>0.05

2.4異葉茴芹提取物對(duì)小鼠免疫功能的影響 中濃度組脾臟指數(shù)顯著高于空白對(duì)照組、高濃度組、低濃度組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),可能是因?yàn)樵陲曫B(yǎng)過(guò)程中有小鼠打架受傷,導(dǎo)致脾臟指數(shù)增高?？瞻讓?duì)照組脾臟指數(shù)顯著低于高濃度組、中濃度組、低濃度組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明異葉茴芹提取物對(duì)小鼠脾臟指數(shù)有一定的影響。在胸腺指數(shù)中,高濃度組小鼠的胸腺指數(shù)最高,其次為低濃度組、空白對(duì)照組,中濃度最低,但組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明不同濃度的異葉茴芹提取物對(duì)小鼠免疫功能的影響有所不同。見(jiàn)表4。

表4 異葉茴芹提取物對(duì)小鼠免疫功能的影響()

表4 異葉茴芹提取物對(duì)小鼠免疫功能的影響()

注：與空白對(duì)照組比較,aP<0.05；與中濃度組比較,bP<0.05

3 討論

由本研究結(jié)果可知,異葉茴芹提取物在抑制角叉菜膠引起的小鼠足腫脹、提高小鼠耐缺氧性、提高小鼠免疫功能方面有一定的作用,但效果不顯著。在冰乙酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)中異葉茴芹提取物未見(jiàn)有抑制效果,且產(chǎn)生了反作用,說(shuō)明直接灌胃異葉茴芹提取物可能對(duì)小鼠的某些部位產(chǎn)生了不良影響,而引起了腹腔毛細(xì)血管通透性提高。因此,對(duì)于如何安全、有效地進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用異葉茴芹仍有待深入研究。

趙良輝等［7］研究發(fā)現(xiàn),異葉茴芹總黃酮具有較好的體外抗氧化活性,在羥基自由基的清除上,異葉茴芹總黃酮優(yōu)于同等濃度的Vc,在較低pH 值、一定的濃度和時(shí)間內(nèi),能夠有效地清除亞硝酸鈉,在pH 值=3.0時(shí),異葉茴芹總黃酮在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),能有效地抑制亞硝胺的合成。本研究在此基礎(chǔ)上,展開(kāi)了小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn),但結(jié)果表明異葉茴芹提取物對(duì)小鼠耐缺氧能力的改善效果并不明顯。黃酮類化合物在增強(qiáng)免疫功能等方面的作用有效［8］,灌胃給藥異葉茴芹提取物的小鼠,其脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)并未出現(xiàn)顯著變化,可能緣于給藥時(shí)間需要進(jìn)一步延長(zhǎng)。已有的研究工作中［3］,異葉茴芹醇提物和異葉茴芹水提物均對(duì)二甲苯所致小鼠的耳廓腫脹度具有極為明顯的影響,可以降低二甲苯致小鼠耳廓腫脹的程度。

綜上所述,異葉茴芹提取物對(duì)角叉菜膠所引起的足腫脹有一定的抑制,但可能由于粗提物中化學(xué)成分復(fù)雜,有效的抗炎成分占比低,有必要提純精制后再進(jìn)行利用。