陳筱瑜，馮連晶，黃慶德*，馮玉天嬌

（1.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，福建 福州 350101；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

石杉堿甲（Huperzine A，Hup A）是從民間草藥蛇足石衫（Huperzia serrata）中分離得到的一種石松類生物堿，對治療阿爾茨海默癥（Alzheimer disease，AD）有比較顯著的療效［1-3］。鼻腔給藥是目前比較理想的腦靶向黏膜給藥途徑，其給藥吸收快，生物利用度高，可以避免首過效應(yīng)且使用方便［4］。 課題組將Hup A 制成鼻用二元醇質(zhì)體溫敏凝膠，既保留了醇質(zhì)體良好的透膜性，又利用溫敏凝膠隨外界溫度變化而發(fā)生相轉(zhuǎn)變，由液態(tài)轉(zhuǎn)化為非化學(xué)交聯(lián)半固體凝膠的特性［5-8］，提高制劑在鼻腔中滯留時間，減少藥物流失， 增加藥物吸收并靶向腦組織， 減小Hup A 片劑、膠囊劑和注射劑等劑型因缺乏腦選擇性而產(chǎn)生的外周膽堿能系統(tǒng)毒性。 但鼻腔給藥可能對鼻腔的纖毛產(chǎn)生不同程度的影響，某些藥物或輔料會引起鼻黏膜一系列生理結(jié)構(gòu)和功能的改變，使鼻腔不能發(fā)揮正常的生理屏障功能［9］。 本研究采用無膜溶出法和Franz 擴(kuò)散池法對Hup A 二元醇質(zhì)體溫敏凝膠的體外釋放度進(jìn)行初步考察，以探索藥物體外釋藥的機(jī)制，同時選用在體蟾蜍上顎模型法對Hup A 二元醇質(zhì)體溫敏凝膠的鼻腔纖毛毒性進(jìn)行了研究，初步評價其鼻腔用藥的安全性，為相關(guān)制劑研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-2030 高效液相色譜儀、LC-2030 UV檢測器（日本島津公司）；YU-1901 雙光束紫外分光

光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；MPLR-702 恒溫磁力攪拌器（常州市金壇大地自動化儀器廠）；STARTER3100 PH 酸度儀（美國OHAUS 公司）；FA2004N 萬分之一電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；XS205 十萬分之一電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；Franz 擴(kuò)散池；DKZ 系列電熱恒溫振蕩水槽（上海一恒科技有限公司）；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；MD34 透析袋（北京索萊寶科技有限公司）；玻璃液體溫度計(jì)；E100 生物顯微鏡（日本Nikon Eclipss 公司）。

1.2 試藥 Hup A 對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：H29D8J51963，純度≥98%）；Hup A 原料藥（西安普萊特生物工程有限公司，批號：HA2019 1102，純度：99%）；Hup A 二元醇質(zhì)體溫敏凝膠（實(shí)驗(yàn)室自制）；呋麻滴鼻液（含1%鹽酸麻黃堿，上海運(yùn)佳黃浦制藥，批號：191104）；去氧膽酸鈉（美侖生物有限公司，批號：S0802A）；生理鹽水（江西科倫藥業(yè)有限公司，批號：C20030204B）；氫氧化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20180131）；磷酸二氫鉀（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10419856）；水為超純水；甲醇、乙腈均為色譜純；其余試劑均為分析純。

1.3 動物 中華大蟾蜍，普通級，體質(zhì)量40～50 g，雌雄兼有，購自湖北省棗陽偉華蟾業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 Hup A 含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：DiamonsilC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.02 mol／mL 磷酸鹽緩沖溶液（pH 值2.5）∶乙腈（88∶12）；檢測波長：311 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL／min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 溶液制備

2.1.2.1 人工鼻液的制備 精密稱取磷酸二氫鉀13.6 g，加去離子水溶解，定容至1 000 mL 量瓶中，用0.1 mol／L 氫氧化鈉溶液調(diào)至pH＝6.8，即得。

2.1.2.2 對照品母液的制備 精密稱取Hup A 對照品適量，置于25 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，0.45 μm 微孔濾膜濾過，制得84.4 μg／mL Hup A 對照品母液，備用。

2.1.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取Hup A 二元醇質(zhì)體溫敏凝膠0.5 g，置于5 mL 量瓶中，用人工鼻液超聲溶解，定容至刻度，0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.1.2.4 陰性對照溶液的制備 精密稱取空白二元醇質(zhì)體溫敏凝膠0.5 g，置于5 mL 量瓶中，用人工鼻液超聲溶解，定容至刻度，0.45 μm 微孔濾膜濾過，得陰性對照溶液。

2.1.3 專屬性試驗(yàn) 將供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，分別注入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖1。 由測定結(jié)果可知：在該色譜條件下，制備二元醇質(zhì)體溫敏凝膠的各輔料對Hup A 的含量測定無干擾，專屬性好。

圖1 Hup A 高效液相色譜圖

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.2.2”項(xiàng)下的對照品母液0.1、0.5、1.0、2.0、2.5 mL，將其定容于5 mL 的量瓶中，得1.688、8.44、16.88、33.76、42.2 μg／mL Hup A 對照品溶液，0.45 μm 微孔濾膜濾過，照上述色譜條件測定。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y＝1.686 2×104X－9.401 2×103，r＝0.999 0。結(jié)果表明：Hup A 在1.688～42.2 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密量取1 mL 對照品母液，置10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，0.45 μm 濾膜濾過，照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積，計(jì)算RSD 值為0.85%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6 份，按照“2.1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件下測定Hup A 的峰面積并求得其含量，計(jì)算RSD值，結(jié)果顯示RSD 值為2.72%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.7 回收率試驗(yàn) 取已知藥物濃度的Hup A 二元醇質(zhì)體溫敏凝膠0.5 g 置于25 mL 量瓶中，分別加入Hup A 對照品0.11、0.13、0.15 mg，加入人工鼻液溶解并定容至刻度，0.45 μm 微孔濾膜濾，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算平均加樣回收率和RSD 值。 結(jié)果見表1。

表1 回收率測定結(jié)果

2.2 體外釋放度試驗(yàn)

2.2.1 無膜溶出法考察凝膠體外釋放度

2.2.1.1 凝膠溶蝕行為考察 取10 mL 塑料離心管，稱重為W0，向離心管中緩慢加入約1 g Hup A 二元醇質(zhì)體溫敏凝膠，于35 ℃恒溫水浴中預(yù)熱30 min，使其完全形成凝膠，稱重為W1。 緩慢加入35 ℃已超聲脫氣人工鼻液2 mL，置35 ℃恒溫振蕩器中，振蕩頻率為200 r／min，每隔30 min 倒出上層液體，立即擦干離心管上的水珠，稱離心管重為W2。 緩慢補(bǔ)加同溫度人工鼻液2 mL，放入恒溫振蕩器中繼續(xù)上述操作，直至離心管內(nèi)溶液全部倒出。 計(jì)算各時間點(diǎn)凝膠累積溶蝕率Q，以時間（t）為橫坐標(biāo)（X），累積溶蝕率（Q）為縱坐標(biāo)（Y），繪制溶蝕曲線。 結(jié)果見圖2。 凝膠溶蝕曲線經(jīng)動力學(xué)方程擬合后得到方程：Y＝0.551 6X－2.202 7，r＝0.996 1。 凝膠溶蝕以恒定的速率進(jìn)行，與時間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖2 Hup A 二元醇質(zhì)體溫敏凝膠溶蝕曲線

Q＝（W1－W2）／（W1－W0）×100%

2.2.1.2 體外釋放度考察 將“2.2.1.1”項(xiàng)下各時間點(diǎn)取出的人工鼻液，置10 mL 量瓶中，用甲醇定容，照“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件測定人工鼻液中的藥物含量，并計(jì)算各時間點(diǎn)藥物累積釋放率Qn，以累積釋放率（Qn）為縱坐標(biāo)，時間（t）為橫坐標(biāo)，繪制體外釋放曲線，結(jié)果見圖3。 釋藥曲線經(jīng)動力學(xué)方程擬合后得到方程：Y＝0.556 7X－0.363 6，r＝0.999 0。由圖3 可知：藥物釋放曲線與時間呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，顯示出零級動力學(xué)特征。

圖3 無膜溶出法Hup A 二元醇質(zhì)體溫敏凝膠體外釋放曲線

2.2.1.3 f2相似因子分析藥物釋放與凝膠溶蝕行為的相關(guān)性 相似因子（f2）常用于評價溶出曲線相似性，具體公式如下：

注：Ti 為i 時間受檢樣品的釋藥量；Ri 為i 時間參比樣品的釋藥量；n 為取樣點(diǎn)個數(shù)。

本實(shí)驗(yàn)引用f2相似因子評價Hup A 二元醇質(zhì)體溫敏凝膠體外釋放曲線和體外溶蝕曲線的相似性，f2值為73.07，說明Hup A 二元醇質(zhì)體溫敏凝膠體外溶蝕和體外藥物釋放同歩。

2.2.2 Franz 擴(kuò)散池法考察凝膠體外釋放度 將活化后的透析袋（截留相對分子量6 000～8 000 U）剪成半透膜固定于供給池與接收池之間，精密稱取1 g Hup A 二元醇質(zhì)體溫敏凝膠加入擴(kuò)散池給藥池中，使其均勻分布于半透膜表面，于35 ℃水浴下放置30 min，使溫敏凝膠充分膠凝。 接收池中加入7 mL人工鼻液，擴(kuò)散池溫度保持（35±0.5）℃，磁力攪拌的速度為200 r／min。分別于0.25、0.5、0.75、1、2、4、8、12、24、48 h 取樣1 mL， 同時補(bǔ)充等溫的人工鼻液1 mL。 將取得的樣品溶液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，用HPLC 測定樣品中藥物含量，計(jì)算二元醇質(zhì)體溫敏凝膠中Hup A 的累積釋放率（Qn）。累積釋放率（Qn）的計(jì)算公式如下。 以 時間（t）為橫坐 標(biāo)（X），累積釋放率（Qn）為縱坐標(biāo)（Y），繪制釋放曲線，結(jié)果見圖4。 結(jié)果表明：Hup A 釋藥緩慢，前12 h的累積釋放率僅能達(dá)到53%，隨后可持續(xù)穩(wěn)定釋藥，釋放時間可達(dá)到48 h 以上。

圖4 Franz 擴(kuò)散池法測定Hup A 二元醇質(zhì)體溫敏凝膠體外釋放曲線

注：Q0為Hup A 總的藥物含量；V0為釋放介質(zhì)總體積（7 mL）；V 為每次取樣時的體積（1 mL）；Cn為不同取樣點(diǎn)接受液的濃度；Ci為各取樣點(diǎn)取樣液濃度（μg／mL）；i、n 為取樣次數(shù)。

2.2.3 體外釋藥行為分析 以零級動力學(xué)方程、一級動力學(xué)方程和Higuchi 動力學(xué)方程對無膜溶出法、Franz 擴(kuò)散池法測得的溫敏凝膠中Hup A 的體外釋放曲線進(jìn)行擬合分析，以探討其釋藥行為，結(jié)果見表2。 采用無膜溶出法時，Hup A 二元醇質(zhì)體溫敏凝膠體外釋放曲線符合零級動力學(xué)方程（r＝0.999 7），說明其藥物的釋放主要受凝膠溶蝕控制，基質(zhì)溶蝕對藥物釋放起決定性作用；采用Franz 擴(kuò)散池法時，Hup A 二元醇質(zhì)體溫敏凝膠體外釋放曲線符合Higuchi 動力學(xué)方程（r＝0.991 6），說明其釋藥機(jī)制為藥物擴(kuò)散和骨架溶蝕的協(xié)同作用［10］。由圖3、圖4 可知：采用無膜溶出法測得的藥物釋放速率顯著高于Franz 擴(kuò)散池法。 采用無膜溶出法時，3 h藥物釋放率達(dá)到100%；采用Franz 擴(kuò)散池法時，Hup A 釋藥緩慢，前12 h 其累積釋放率僅能達(dá)到53%，隨后可持續(xù)穩(wěn)定釋藥，釋放時間可持續(xù)48 h 以上。說明鼻腔給藥時，藥物的釋放受鼻液對溫敏凝膠基質(zhì)溶蝕及藥物從溫敏凝膠基質(zhì)中向外擴(kuò)散兩個因素的影響。

表2 Hup A 二元醇質(zhì)體溫敏凝膠體外釋放曲線擬合結(jié)果

2.3 鼻纖毛毒性試驗(yàn)

2.3.1 鼻纖毛毒性試驗(yàn) 將20 只健康蟾蜍按體質(zhì)量分成4 組，每組5 只，即呋麻滴鼻液組（含1%鹽酸麻黃堿）、1%去氧膽酸鈉組、生理鹽水組、Hup A二元醇質(zhì)體溫敏凝膠組。

將蟾蜍用探針破壞脊髓后，仰臥固定于蛙板上，用止血鉗將其口腔撐開并固定。 各組分別于口腔黏膜表面滴加0.5 mL 呋麻滴鼻液、1%去氧膽酸鈉溶液、生理鹽水以及Hup A 二元醇質(zhì)體溫敏凝膠，使其完全浸沒上顎；30 min 后分離上腭黏膜，用生理鹽水沖洗干凈，剪取適當(dāng)黏膜平鋪于載玻片上，蓋上蓋玻片，于40×100 倍生物數(shù)碼顯微鏡下觀察纖毛運(yùn)動情況；隨后將載玻片置于生理鹽水飽和的層析缸中，每隔30 min 取出觀察纖毛運(yùn)動情況，直至纖毛停止擺動為止。 記錄纖毛持續(xù)運(yùn)動時間（PVD），計(jì)算纖毛持續(xù)運(yùn)動時間百分率（PPV），PPV＝PVD藥物組／PVD生理鹽水組×100%，并用IBM SPSS Statistics 21 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。 結(jié)果表明：Hup A以及各種輔料對纖毛運(yùn)動影響很小，無明顯纖毛毒性，可用于鼻腔給藥。

表3 4 組PVD 與PPV 比較結(jié)果（±s）

表3 4 組PVD 與PPV 比較結(jié)果（±s）

注：與1%去氧膽酸鈉組比較，1） P＜0.01。

n5555 PVD／min 639±171）630±111）40±4 603±51）組別生理鹽水組呋麻滴鼻液組1%去氧膽酸鈉組Hup A 二元醇質(zhì)體溫敏凝膠組PPV／%100.01）98.61）6.3 94.41）

2.3.2 鼻纖毛形態(tài) 采用具有拍照功能的生物數(shù)碼顯微鏡觀察各組蟾蜍上顎纖毛的運(yùn)動形態(tài)。 由圖5 可知：1%去氧膽酸鈉組的纖毛邊緣基本脫落，黏膜受損，對纖毛運(yùn)動有不可逆的抑制作用；生理鹽水組、呋麻滴鼻液組、Hup A 二元醇質(zhì)體溫敏凝膠組的纖毛清晰完整，排列整齊，而且有一定規(guī)律和頻率的向同一方向擺動。以上結(jié)果說明Hup A 以及各種輔料對纖毛形態(tài)影響很小，無明顯纖毛毒性，可用于鼻腔給藥。

圖5 顯微鏡下蟾蜍上顎黏膜纖毛組織形態(tài)（×200）

3 討 論

3.1 體外釋放模型的選擇 對于溫敏凝膠的體外釋放研究尚沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和方法，主要基于2 種模型，即無膜溶出和有膜溶出模型［11］。 為探討Hup A 二元醇質(zhì)體溫敏凝膠的體外釋藥機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用無膜溶出法和有膜的Franz 擴(kuò)散池法進(jìn)行體外釋放度研究。采用Franz 擴(kuò)散池法時，凝膠通過半透膜與少量的釋放介質(zhì)接觸，凝膠基質(zhì)的溶蝕較慢，藥物需從凝膠中擴(kuò)散至少量的釋放介質(zhì)后，再通過半透膜擴(kuò)散至大量釋放介質(zhì)中。 由于半透膜兩側(cè)的藥物濃度梯度較小，使得釋藥速率偏慢，藥物的釋放主要為藥物擴(kuò)散和骨架溶蝕的協(xié)同作用，這與釋放曲線擬合符合Higuchi 方程的結(jié)果是一致的。 采用無膜溶出法時，凝膠直接浸沒在釋放介質(zhì)中，藥物則隨著凝膠溶蝕而釋放。通過f2相似因子對藥物釋放與凝膠溶蝕行為的相關(guān)性分析， f2值越大，表明兩種制劑的體外釋藥曲線差異越小。 若50≤f2≤100，表示兩制劑的溶出曲線相似，即受試制劑與參比制劑釋藥無差別［12］。Hup A 二元醇質(zhì)體溫敏凝膠體外釋放曲線和體外溶蝕曲線的f2＝73.07，說明藥物的釋放主要受凝膠基質(zhì)溶蝕的影響，這與Hup A體外釋放曲線擬合符合零級釋藥模型的結(jié)果是一致的。 鼻腔給藥時，藥物從凝膠基質(zhì)中釋放要受鼻液對溫敏凝膠溶蝕的影響，Hup A 二元醇質(zhì)體溫敏凝膠藥物的釋放機(jī)制應(yīng)為藥物擴(kuò)散與凝膠基質(zhì)溶蝕的協(xié)同作用。

3.2 鼻腔纖毛毒性方法的選擇 鼻腔給藥時，由于鼻腔制劑中藥物與輔料的影響，鼻纖毛運(yùn)動常會受到不同程度的損害，甚至可使纖毛運(yùn)動發(fā)生不可逆的停止，影響鼻纖毛的清除功能，故對鼻纖毛毒性的影響是鼻腔制劑的重要研究內(nèi)容之一。 考察鼻纖毛持續(xù)運(yùn)動時間的方法有在體法和離體法。 由于混懸顆?；蚰z劑容易粘附在離體黏膜的表面和背面，很難用生理鹽水清洗干凈，同時殘留顆粒的存在和劇烈淋洗本身對纖毛運(yùn)動就會產(chǎn)生較大影響，離體法難以正確評價混懸型或者黏稠性藥物制劑的纖毛毒性，因此離體法不適宜評價本制劑對鼻腔纖毛毒性的影響。 在體法是將藥物在蟾蜍上作用一段時間，用生理鹽水洗凈后分離黏膜，觀察纖毛運(yùn)動情況。 在體法的優(yōu)點(diǎn)是更接近藥物在鼻腔的實(shí)際作用情況，尤其適用于混懸劑、凝膠劑等難以淋洗干凈的劑型，因此，本實(shí)驗(yàn)采用在體蟾蜍上顎模型法評價溫敏凝膠對鼻腔纖毛的毒性，以生理鹽水及市售呋麻滴鼻液作陰性對照，對鼻纖毛有明顯毒性的去氧膽酸鈉作陽性對照。 結(jié)果表明：Hup A 二元醇質(zhì)體溫敏凝膠給藥后鼻纖毛持續(xù)運(yùn)動時間與生理鹽水組和呋麻滴鼻液組比較無顯著性差異（P＞0.05），與1%去氧膽酸鈉組比較有非常顯著性差異（P＜0.01），說明其對蟾蜍上顎黏膜纖毛運(yùn)動影響不大，制劑的纖毛毒性較小，可以用于鼻腔給藥。