謝冰穎，黃景文，陳賽楠，謝麗華，李生強(qiáng)

（福建省中醫(yī)藥科學(xué)院基礎(chǔ)研究所，福建 福州 350003）

很多女性約從45 歲起，卵巢機(jī)能衰退老化，體內(nèi)雌激素水平的降低破壞了神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)的平衡，繼而引起了圍絕經(jīng)期婦女出現(xiàn)心煩、易醒、情緒易躁動(dòng)等臨床癥狀，稱(chēng)為圍絕經(jīng)期綜合征（perimenopausal syndrome，PPS）［1］。 PPS 在圍絕經(jīng)期婦女中發(fā)病率較高，對(duì)婦女身體、精神等方面都造成影響，損害了圍絕經(jīng)期婦女的身體、心理健康。 PPS 證候特征與“經(jīng)斷前后諸證”“年老經(jīng)斷復(fù)來(lái)”等癥狀相似［2］。 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為PPS 是腎氣逐漸衰弱，女性天癸即將竭盡，人體陰陽(yáng)失衡所致，故常治以補(bǔ)腎法，效果顯著［3-5］，但補(bǔ)腎法治療PPS 機(jī)制不明確。 本研究觀察左歸丸、右歸丸對(duì)PPS 大鼠性激素水平、卵巢雌激素受體alpha（ERα）及雌激素受體beta（ERβ）mRNA 相對(duì)表達(dá)量影響，探討補(bǔ)腎法治療PPS 的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24 只9 月齡SPF 級(jí)雌性SD 大鼠購(gòu)自北京維通利華公司［許可證號(hào)SCXK（京）2014-0001］，在福建省中醫(yī)藥科學(xué)院比較醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)3 個(gè)月，達(dá)12 月齡，體質(zhì)量達(dá)370～420 g；另從該公司購(gòu)買(mǎi)8 只11 周齡SD 大鼠，體質(zhì)量250～280 g，適應(yīng)飼養(yǎng)1 周后即12 周作為育齡期的對(duì)照組大鼠。

1.2 試劑和儀器 總RNA 抽提Trizol 試劑（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，批號(hào)：68304）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：AK3302）、定量PCR 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：AK7602）均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；ND2000 微量核酸測(cè)定儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；7500 fast 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI 公司）。

1.3 藥物制備 按照張介賓《景岳全書(shū)》組方，左歸丸處方：熟地黃24 g，山藥12 g，枸杞子12 g，山茱萸12 g，菟絲子12 g，鹿角膠6 g，龜甲12 g，川牛膝9 g。右歸丸處方：熟地黃24 g，山藥12 g，枸杞子9 g，山茱萸9 g，菟絲子12 g，杜仲12 g，鹿角膠12 g，當(dāng)歸9 g，肉桂6 g，制附子6 g。 中藥藥材均購(gòu)自福建省鷺燕醫(yī)藥有限公司，方藥劑量均按臨床成人劑量的6.3 倍計(jì)算。 煎煮方法參見(jiàn)文獻(xiàn)［6］，首煎加冷水沒(méi)過(guò)中藥，浸泡30 min，武火煮沸后文火繼續(xù)煮20 min；次煎再加冷水沒(méi)過(guò)中藥，武火煮沸后再文火煮20 min；分別將兩次藥液過(guò)濾、合并。 左歸丸組分中的鹿角膠、龜甲分別另外加熱溶解，加入濾液中。 采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成生藥濃度為1.39 g／mL左歸丸水煎劑、1.24 g／mL 右歸丸水煎劑。 密封，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型建立及評(píng)價(jià) 以陰道脫落細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量變化判斷大鼠動(dòng)情周期。 收集24 只9 月齡SPF級(jí)SD 大鼠陰道脫落細(xì)胞，在載玻片上作細(xì)胞涂片，酒精固定1 min，堿性美藍(lán)染色，鏡下觀察脫落細(xì)胞形態(tài)變化；連續(xù)觀察10 d（2 個(gè)動(dòng)情周期），以動(dòng)情周期紊亂、不明顯判定為PPS 模型［7］。

2.2 動(dòng)物分組及干預(yù) 將24 只PPS 模型大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、左歸丸組、右歸丸組，每組8 只；12 周齡、體質(zhì)量250～280 g 的SD 大鼠作為對(duì)照組［7］。 左歸丸組、右歸丸組分別采用左歸丸水煎劑、右歸丸水煎劑1 mL／100 g 灌胃；對(duì)照組、模型組灌胃等體積生理鹽水。 每日上午灌胃1 次，連續(xù)給藥21 d。

2.3 組織標(biāo)本的采集 干預(yù)結(jié)束后第2 天上午9：00-10：00 采用戊巴比妥（1 mL／100 g）麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血；后打開(kāi)腹腔，剝離卵巢，剔除卵巢旁脂肪，置凍存管并立即投入液氮中速冷，后存于-80 ℃超低溫冰箱備用。 獲取的新鮮血液于4 ℃冰箱靜置2 h 后，在4 ℃條件下，以3 000 r／min 離心機(jī)離心20 min，取血清，置-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血清雌二醇（E2）、促卵泡激素（FSH）、促黃體生成素（LH）檢測(cè) 委托北京301 醫(yī)院采用放射性免疫技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。 將標(biāo)準(zhǔn)品和受檢標(biāo)本、標(biāo)記抗原和抗血清按順序定量加入小試管中，在一定溫度下反應(yīng)一定時(shí)間，使競(jìng)爭(zhēng)抑制反應(yīng)達(dá)到平衡；采用第二抗體法進(jìn)行沉淀，離心分離，然后進(jìn)行放射性強(qiáng)度的測(cè)定。

2.5 卵巢總RNA 提取 將剪碎的卵巢組織以Trizol裂解法沉淀，溶解在一定量水即得到大鼠卵巢總RNA。 總RNA 的濃度測(cè)定采用微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)OD260、OD280，根據(jù)公式計(jì)算總RNA 濃度，通過(guò)OD260／OD280比值分析總RNA 純度。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)卵巢ERα mRNA 及ERβ mRNA 相對(duì)表達(dá)量 逆轉(zhuǎn)錄mRNA獲得cDNA 后，按照定量PCR 試劑盒說(shuō)明操作。 采用不同管同時(shí)擴(kuò)增管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參基因，每個(gè)基因同時(shí)擴(kuò)增3 個(gè)重復(fù)管，進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)。 大鼠ERα、ERβ 基因引物上下游堿基序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。

表1 定量PCR 引物序列

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。 計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以（±s）表示，采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的采用秩和檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠給藥前后體質(zhì)量變化比較 給藥后各組大鼠體質(zhì)量較同組給藥前有增加趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠給藥前后體質(zhì)量變化比較（±s）g

表2 各組大鼠給藥前后體質(zhì)量變化比較（±s）g

組別對(duì) 照 組模 型 組左歸丸組右歸丸組n8888給藥前277.5±11.4 379.3±17.0 384.5±16.0 383.1±15.3給藥后286.9±18.5 386.5±19.1 390.1±17.3 389.8±13.1

3.2 各組大鼠血清激素水平比較 見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清激素水平比較（±s）

表3 各組大鼠血清激素水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與模型組比較，3） P＜0.05，4） P＜0.01。

組別對(duì) 照 組模 型 組左歸丸組右歸丸組LH／（mIU／mL）6.42±0.63 8.52±0.682）7.11±0.433）6.89±0.523）n8888 E2／（pg／mL）84.68±8.92 54.45±5.202）68.72±4.873）72.37±5.484）FSH／（mIU／mL）4.54±0.56 5.66±0.571）4.37±0.424）4.42±0.344）

3.3 各組大鼠卵巢ERα mRNA、ERβ mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠卵巢ERα mRNA、ERβ mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表4 各組大鼠卵巢ERα mRNA、ERβ mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.01。

ERβ mRNA 0.95±0.27 1.78±0.481）2.30±0.68 2.37±0.78組別對(duì) 照 組模 型 組左歸丸組右歸丸組n8888 ERα mRNA 0.91±0.30 2.08±0.521）4.04±1.002）2.92±0.85

4 討 論

圍絕經(jīng)期綜合征確切的發(fā)病機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，多數(shù)認(rèn)為與卵巢功能減退，雌激素合成下降密切相關(guān)［8］。 近年的研究也發(fā)現(xiàn)：無(wú)論是PPS 患者還是PPS 動(dòng)物模型，都有低雌激素水平及高FSH和高LH 的現(xiàn)象［3，9］。 此前，西方醫(yī)學(xué)采取激素替代療法（HRT）來(lái)治療圍絕經(jīng)期綜合征，療效顯著，但由于HRT 存在致癌的風(fēng)險(xiǎn)，因此臨床治療受到很大限制［9］，而中醫(yī)藥辨證施治因毒副作用小逐漸被臨床所重視。

本研究中各組大鼠體質(zhì)量在治療后有一定增加，與治療前比較，均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與給藥時(shí)間較短有關(guān)。 經(jīng)左歸丸、右歸丸水煎劑分別灌胃21 d 之后，本研究發(fā)現(xiàn)大鼠外周血的雌激素水平顯著提升。 究其原因，一方面，與補(bǔ)腎中藥改善卵巢功能有關(guān)，比如增加卵巢顆粒細(xì)胞及黃體的雌激素合成能力［10-11］；另一方面，也與補(bǔ)腎中藥提高卵巢外其他組織芳香轉(zhuǎn)化相關(guān)，即提高腎上腺皮質(zhì)、肝、皮下脂肪等組織的芳香轉(zhuǎn)化能力，從而提高雌激素水平。

雌激素需要與其受體相結(jié)合起作用，并以此激活下游激素受體，從而傳遞給下丘腦-垂體-卵巢軸。機(jī)體內(nèi)的雌激素受體水平在整個(gè)生命過(guò)程中是變化的。ERα、ERβ 是雌激素結(jié)合的兩個(gè)靶點(diǎn)，分別由不同的基因編碼組成，在體內(nèi)的生物學(xué)特性上存在許多的差異，在調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸中占據(jù)重要地位［12］。 本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠卵巢中ERα mRNA、ERβ mRNA 相對(duì)表達(dá)量均比對(duì)照組大鼠高，分析其原因，可能是雌性大鼠在圍絕經(jīng)期時(shí)，雌激素水平較低，而較高的ERα mRNA、ERβ mRNA 表達(dá)水平保證雌激素受體蛋白的水平，從而在一定程度上維持雌激素效應(yīng)［13-14］。

左歸丸、右歸丸治療PPS 對(duì)大鼠卵巢雌激素受體的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，但對(duì)于阿爾茨海默?。ˋD）細(xì)胞模型，左歸丸含藥血清可以提高雌激素受體表達(dá)［15］。 本實(shí)驗(yàn)中左歸丸組大鼠卵巢ERα mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著增高，與益腎更寧合劑［16］、補(bǔ)腎壯骨顆粒［17］報(bào)道的作用基本一致。 左歸丸、右歸丸組大鼠卵巢ERβ mRNA 相對(duì)表達(dá)量雖然有所提高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 因細(xì)胞、組織類(lèi)型的不同，ERα mRNA和ERβ mRNA 表達(dá)水平存在一定差異。 本研究中，圍絕經(jīng)期大鼠經(jīng)左歸丸、右歸丸灌胃后，隨著血液雌激素水平的提高以及卵巢ERα mRNA 表達(dá)的增強(qiáng)，雌激素的生物效應(yīng)也得以維持。

本研究也發(fā)現(xiàn)：與右歸丸組比較，左歸丸組ERα mRNA 相對(duì)表達(dá)量更高，但并沒(méi)有達(dá)到顯著性差異。本研究建立的PPS 大鼠模型并沒(méi)有涉及中醫(yī)證型，對(duì)于左歸丸和右歸丸藥效的發(fā)揮可能有影響。 今后如果能建立腎陰虛或腎陽(yáng)虛P(yáng)PS 大鼠模型，對(duì)于探討左歸丸或右歸丸的作用機(jī)制將更有意義。

本研究以補(bǔ)腎法治療圍絕經(jīng)期模型大鼠，結(jié)果證實(shí)了補(bǔ)腎法對(duì)調(diào)節(jié)圍絕經(jīng)期綜合征大鼠的外周血雌激素及卵巢ERα mRNA 表達(dá)具有重要影響。通過(guò)提高血液雌激素及卵巢ERα mRNA 水平進(jìn)而提高雌激素效應(yīng)可能是補(bǔ)腎法治療PPS 的內(nèi)在機(jī)制。