丁澤昊，趙子晨，李桂華，郭偉良，3，張冬冬，周永燦

（1.海南大學南海海洋資源利用國家重點實驗室，海南 海口 570228；2.海南大學海洋學院，海南 ?？?570228；3.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223）

卵形鯧鲹（Trachinotusovatus）俗稱短鰭鯧、金鯧等，屬于鲹科（Carangidae），鯧鲹屬（Trachinotus），為中上層洄游暖水性海水魚類.其肉無刺，并且肉質(zhì)細嫩，味道鮮美，生長速度快，海南從20世紀90年代初就已經(jīng)開展了卵形鯧鲹海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖［1］，現(xiàn)在卵形鯧鲹已成為海南、廣東、廣西和福建等地區(qū)深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的主要品種之一，并且在海南已發(fā)展為當前單一養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的海水養(yǎng)殖魚類［2］，據(jù)統(tǒng)計，2016年海南省金鯧魚的產(chǎn)量達到5萬t，產(chǎn)值達10億元以上.但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，養(yǎng)殖密度的不斷提高以及近海養(yǎng)殖環(huán)境的衰退等諸多原因［3］，卵形鯧鲹的病害日趨嚴重［2-5］.刺激隱核蟲（Cryptocaryon irritans）病、諾卡氏菌（Nocardia seriolae）病、美人魚發(fā)光桿菌（Photobacterium damselae）病和鏈球菌（Streptococcussp.）病等都對其養(yǎng)殖造成了嚴重的危害.海豚鏈球菌（Streptococcusiniae）屬于鏈球菌科（Streptococcidae），鏈球菌屬（Streptococcus），它是一種常見的世界性分布的條件致病病原［6-7］，其主要感染溫水魚類.其中，卵形鯧鲹即為海豚鏈球菌易感魚類，廣東和廣西等地均有卵形鯧鲹感染海豚鏈球菌的報道［8-11］.海豚鏈球菌可通過魚體受傷部位以及消化道進入其血液循環(huán)系統(tǒng)，亦可突破其血腦屏障進入腦部，破壞腦神經(jīng)，從而導致腦部充血或出血，致使宿主出現(xiàn)異常的螺旋狀旋轉(zhuǎn)游泳，在水面做頭向上或者尾向上的轉(zhuǎn)圈游動等癥狀；此外，海豚鏈球菌還可以通過血液循環(huán)破壞卵形鯧鲹的肝、腎、脾等器官，引發(fā)其全身性出血，并伴隨腸道積水而引起的腹水癥狀［12-16］.2020年7月，在海南臨高縣橋頭鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)卵形鯧鲹的養(yǎng)殖網(wǎng)箱內(nèi)出現(xiàn)了疑似海豚鏈球菌感染癥狀的疾病，為弄清卵形鯧鲹的致病原因，本研究采集了患病卵形鯧鲹的魚樣本，并對其進行了病原菌的分離、鑒定及藥敏試驗，旨在為該疾病的防控提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1實驗材料患病卵形鯧鲹于2020年7月采集自海南臨高縣橋頭鎮(zhèn)的卵形鯧鲹養(yǎng)殖網(wǎng)箱，魚體重為（65±15）g；試驗用魚購于海南臨高縣某卵形鯧鲹養(yǎng)殖場，體重為（30±10）g，暫養(yǎng)于循環(huán)水族箱（300 L）28d，養(yǎng)殖水溫、pH、鹽度和透明度分別維持在（30.0±1.0）°C、（8.1±0.3）、（30±0.4）和0.75 m，持續(xù)充氧，每天換1/3體積的水.

1.2病原的分離與純化檢查瀕臨死亡的卵形鯧鲹的外部癥狀并進行拍照和記錄，用100μL/L丁香酚將魚麻醉后，用酒精（φ=75%）棉球擦拭病魚體表，于超凈工作臺打開病魚腹部，檢查病魚的肝臟、脾臟和腎臟，從中取樣并分別接種于硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂培養(yǎng)基（北京路橋生物有限公司）和腦心浸液肉湯（BHI）培養(yǎng)基（青島日水生物有限公司）上，于30°C倒置培養(yǎng)48 h，觀察各分離菌株的菌落形態(tài)并計數(shù)，挑取形態(tài)大小一致的優(yōu)勢菌落，進一步劃線于新配制的以上兩種瓊脂培養(yǎng)基，30°C純化培養(yǎng)48 h，于4°C保存?zhèn)溆?

1.3分離菌的人工感染試驗將分離的優(yōu)勢菌株接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基上，30°C倒置培養(yǎng)36 h，接著用φ=0.7%的無菌生理鹽水沖洗菌苔，制成菌懸液，然后以麥氏比濁法調(diào)整菌液稠密度至1×109CFU/mL.將40尾暫養(yǎng)28 d的卵形鯧鲹［體重為（60±10）g］隨機分至4個水族箱（300 L），每個水族箱10尾魚，每2個水族箱一組，分別為對照組和人工感染組，人工感染組的每尾魚腹腔注射0.1 mL菌懸液，對照組的魚則注射相同體積的無菌生理鹽水.實驗期間保持24 h持續(xù)充氧，每日觀察魚的癥狀與死亡數(shù)量，連續(xù)觀察72 h，并將發(fā)病魚按1.2的方法進行病原菌分離.

1.4病原菌對卵形鯧鲹半致死濃度（LC50）的測定將1.3中獲得的致病菌株用φ=0.7%的無菌生理鹽水制成菌懸液，用麥氏比濁法測其稠密度，然后用φ=0.7%的無菌生理鹽水分別梯度稀釋至1×108、1×107、1×106、1×105和1×104CFU/mL，制成菌懸液樣品，接著將100尾暫養(yǎng)14 d的卵形鯧鲹隨機分至10個水族箱（300 L），每2個水族箱為一組，共五組.每尾魚以腹腔注射的方式注射0.1 mL以上制備的不同稠密度的菌懸液，對照組則注射無菌生理鹽水.每日記錄魚的癥狀與死亡數(shù)量，連續(xù)觀察14 d.

1.5病原菌的鑒定

1.5.1病原菌菌落的形態(tài)觀察將1.3中所分離的病原菌劃線于羊血平板（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）上，于30°C倒置培養(yǎng)36 h，觀察其菌落形態(tài)和溶血圈.

1.5.216SrRNA基因序列分析取對數(shù)生長期的新鮮菌液，利用細菌基因組試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取所分離的病原菌DNA.以細菌16SrRNA基因的通用引物（上游引物：5′?AGAGTTT?GATCCTGGCTCAG?3′；下游引物：5′?TACGGCTACCTTGTTACGAC?3′）作為引物，以1μL DNA為模板，進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件如下：94°C 3 min；94°C 3 min，55°C 1 min，72°C 1 min，30個循環(huán)；72°C 5 min.PCR產(chǎn)物在ω=1%的瓊脂糖凝膠于180 V電泳15 min，用回收試劑盒（Biomed公司）切膠回收目標條帶，回收產(chǎn)物送至華大基因公司測序.將測序所得序列在GenBank中進行Blast分析，然后利用Mega 7.0.26軟件對與該序列相關(guān)性較高的核酸序列進行序列比對，并進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建.

1.5.3生理生化鑒定參照《伯杰氏細菌鑒定學手冊》（第8版）的標準進行鑒定.

1.6藥敏實驗采用K?B紙片瓊脂擴散法對所分離的病原菌進行30種抗生素（杭州微生物試劑有限公司）的藥敏試驗.對于經(jīng)30°C純化培養(yǎng)36 h的病原菌菌液，用比濁法和稀釋涂布平板法測定其稠密度，并使菌液稠密度為1×107CFU/mL，在30°C孵育24 h后，測量細菌在BHI平板上的抑菌圈直徑，以確定其對藥物的敏感情況：敏感性（S）、中等敏感性（I）和耐藥性（R）.

2 結(jié) 果

2.1自然發(fā)病的卵形鯧鲹的臨床癥狀患病卵形鯧鲹的主要癥狀為：體色變黑，鰭基、肛門或身軀出血（圖1-A、圖1-B）；并且鰓部呈現(xiàn)出明顯的出血和充血（圖1-C）.解剖后的器官病變包括：脾臟和肝臟腫大并有出血；膽囊腫大，腹腔積水（圖1-D、圖1-E）；腸道內(nèi)有積水或黃色粘液（圖1-E）.

圖1 自然發(fā)病的卵形鯧鲹的臨床癥狀

2.2病原的分離純化及形態(tài)學觀察利用BHI瓊脂平板對病魚進行病原分離，結(jié)果顯示：病魚腦部、肝臟、腎臟等部分均可分離出1株優(yōu)勢菌，優(yōu)勢菌占所在培養(yǎng)基平板上細菌總量的95%以上.菌落呈乳白色、圓形、表面光滑、邊緣整齊、約0.6 mm（圖2-A）；該優(yōu)勢菌在血平板（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）上于30°C培養(yǎng)18 h后，其菌落呈乳白色，菌落周圍為透明的β溶血圈（圖2-B）.

圖2 病原菌的菌落形態(tài)

2.3人工感染的試驗結(jié)果人工感染的試驗結(jié)果顯示，將0.1 mL分離到的優(yōu)勢菌菌懸液（菌液稠密度為1×109CFU/mL）以腹腔注射的方式注射到卵形鯧鲹后，人工感染組的卵形鯧鲹于72 h內(nèi)全部死亡，而對照組則無卵形鯧鲹死亡.病魚主要呈現(xiàn)出缺氧、體色發(fā)黑、鰭條基部出血等癥狀，解剖后發(fā)現(xiàn)其腹腔有積液，其癥狀與自然發(fā)病的癥狀基本一致，從瀕死魚體中所分離的菌株與初次分離的菌株在形態(tài)和特征上是一致的.

2.4所分離的病原菌對卵形鯧鲹的LC50利用腹腔注射的方式感染卵形鯧鲹，其死亡主要發(fā)生在前4 d內(nèi)，對照組則未出現(xiàn)死亡，其實驗結(jié)果見圖3，采用寇氏法［17］計算出病原菌的半致死濃度為6.863×105CFU/mL.

圖3 海豚鏈球菌感染健康卵形鯧鲹的試驗結(jié)果

2.5病原菌的鑒定

2.5.1病原菌16SrRNA基因序列及其系統(tǒng)發(fā)育分析將所分離到的菌株的16SrRNA基因序列與NCBI網(wǎng)站已有序列進行Blast比對，結(jié)果顯示，所分離到的菌株與海豚鏈球菌的同源性最高，故選取同源性高的鏈球菌屬的16SrRNA序列，利用Mega 7.0.26軟件進行序列同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建（圖4），結(jié)果顯示，所分離到的卵形鯧鲹致病菌株與海豚鏈球菌聚為一支，同源性最高為98%；同時，結(jié)合生理生化特性將所分離到的病原菌株判定為海豚鏈球菌.

圖4 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5.2生理生化特性用細菌生化鑒定管進行生理生化鑒定，其結(jié)果見表1，分離菌的生理生化特征與海豚鏈球菌的生化特性基本吻合.

表1 試驗菌株的生化反應(yīng)分析

2.6采用K?B紙片瓊脂擴散法的藥敏試驗對所分離的菌株進行藥敏試驗，測量其抑菌圈大小，以產(chǎn)品說明書判斷病原菌對各種藥物的敏感性.實驗結(jié)果如表2所示，試驗菌株對青霉素類，如羧芐西林、苯唑西林、哌拉西林；頭孢類，如頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢哌酮；氨基糖苷類，如丁胺卡那、慶大霉素、卡那霉素、新霉素；四環(huán)素類，如四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素；大環(huán)內(nèi)酯類，如紅霉素、麥迪霉素等25種藥品高度敏感；對氨芐西林、環(huán)丙沙星、頭孢他啶、多粘菌素B則中度敏感；僅對青霉素耐藥.

表2 菌株對藥物的敏感性

3 討 論

本研究對2020年7月在海南臨高縣橋頭鎮(zhèn)卵形鯧鲹養(yǎng)殖區(qū)爆發(fā)的細菌性疾病進行了病原菌的分離，通過人工感染試驗觀察到，實驗魚的發(fā)病癥狀與自然發(fā)病個體的癥狀基本一致，同時也證實了所分離的優(yōu)勢菌為該病的主要病原菌.其主要發(fā)病癥狀符合海豚鏈球菌病的發(fā)病癥狀［18］，通過對所分離菌株的形態(tài)學特征的觀察和生理生化特性的分析，初步鑒定其病原菌為海豚鏈球菌；在進一步采用16SrRNA基因序列進行鑒定后，確定其與S.iniae（ATCC29178）的同源性最高，故該致病菌亦被初步鑒定為海豚鏈球菌，因此對于本次卵形鯧鲹所爆發(fā)的疾病，其主要病原可能為海豚鏈球菌.1976年，陸英杰等從患皮膚膿腫的亞馬遜淡水海豚中首次分離出海豚鏈球菌，此后在養(yǎng)殖虹鱒中發(fā)現(xiàn)鏈球菌?。?9］，再以后鏈球菌感染魚體的情況呈全球性分布.近年來，在我國不同養(yǎng)殖區(qū)域相繼有關(guān)于海豚鏈球菌感染魚類并造成嚴重損失的報道［19-22］.陸英杰等［19］報道了在廣州佛山某羅非魚魚場爆發(fā)海豚鏈球菌病的病例；鄭李平［20］等報道了在四川彭州養(yǎng)殖鱘魚上發(fā)生的以神經(jīng)和出血癥狀為臨床特征的病魚，其體內(nèi)分離到的病原菌為海豚鏈球菌；楊移斌［21］等報道了福建漳州地區(qū)養(yǎng)殖黃顙魚上出現(xiàn)海豚鏈球菌病的癥狀.本研究也發(fā)現(xiàn)在海南省臨高縣橋頭鎮(zhèn)的養(yǎng)殖基地，卵形鯧鲹的體表及其重要組織器官亦出現(xiàn)符合海豚鏈球菌感染魚類的癥狀［18］.由此表明，海豚鏈球菌對我國水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的危害日趨嚴重，應(yīng)給予高度關(guān)注.據(jù)文獻報道，在海豚鏈球菌感染的不同種類宿主中，其主要癥狀具有一定的差異［23］.在感染哺乳動物時宿主主要呈現(xiàn)蜂窩組織炎、腦膜炎及皮下膿腫等，而在魚類中宿主主要呈現(xiàn)眼球突出、全身性敗血及腦膜炎等癥狀［24］.此外，不同水生動物（宿主）的發(fā)病表現(xiàn)也有所不同，如在海豚上其表現(xiàn)為皮膚膿腫［9］；鱘魚則主要表現(xiàn)為全身性多組織和器官變性、壞死和出血等［20］；羅非魚卻主要表現(xiàn)為眼球突出或單邊混濁發(fā)白、眼眶充血和肛門紅腫等，且在解剖病魚后可見其膽汁稀薄和色淺［19］.本研究還發(fā)現(xiàn)，卵形鯧鲹感染海豚鏈球菌后其主要癥狀為體色變黑、鰭基和肛門出血，并且鰓部呈現(xiàn)出明顯的出血和充血；解剖后還可發(fā)現(xiàn)，其脾臟和肝臟腫大并有出血.這是與魚的種屬特異性還是與病原菌的生物學特性有關(guān)還有待進一步的研究.

本研究中的藥敏實驗結(jié)果顯示，自卵形鯧鲹分離出的海豚鏈球菌對大部分四環(huán)素類、頭孢類和氨基糖苷類等藥物呈高度敏感，但對青霉素有耐藥性；武沛文等［8］的研究發(fā)現(xiàn)，從湛江市太平鎮(zhèn)網(wǎng)箱養(yǎng)殖場的卵形鯧鲹魚體中分離到的海豚鏈球菌對四環(huán)素類和氨基糖苷類藥物等17種試驗藥物敏感，但也對青霉素有耐藥性，這與本研究的結(jié)果相似.這很可能是水產(chǎn)養(yǎng)殖場長期使用青霉素而引起的［25-26］.因此，建議采用對四環(huán)素類、頭孢類和氨基糖苷類等敏感的藥物來進行防治，但在使用過程中要避免反復加大量地使用單一抗生素，以避免病原菌出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象；同時應(yīng)鼓勵開發(fā)綠色的和安全的防治手段.目前，國內(nèi)外已有學者開展了有關(guān)海豚鏈球菌疫苗的研究［27-30］，如袁國尚等［31］的研究表明，九味羌活湯和桑菊飲這2種復方中草藥對鱘魚海豚鏈球菌具有較好的抑菌和殺菌效果；姚麗等［32］的研究也證實，黃連、黃芩、連翹、丁香和秦皮對海豚鏈球菌均具有較好的抑菌和殺菌功效.但是，目前對中草藥的作用機理尚未弄清，還有待做進一步的研究和開發(fā)，唯有如此才能更好地控制海豚鏈球菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的影響.