汪金華，楊臘英，黃俊生，周 游，汪 軍，郭立佳

（1.海南大學(xué)植物保護學(xué)院，海南 ?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室/海南省熱帶農(nóng)業(yè)有害生物監(jiān)測與控制重點實驗室，海南 ?？?571101）

磷在提高植物光合作用，促進根系發(fā)育和維持能量循環(huán)中起著重要的作用，它是植物生長中不可缺少的營養(yǎng)元素［1-2］.我國土壤中含有較為豐富的磷資源，但其中大部分都以難溶性的磷灰石、氧磷灰石、羥基磷灰石、磷酸二酯、磷酸三酯等礦石或有機物的形式存在，只有不超過5%的可溶性磷能被植物吸收和利用［3-4］.因此，為了滿足作物生長所需要的磷，向土壤施加磷肥成了一種可行的方式；然而，向土壤施肥雖然也能提高作物產(chǎn)量，但是不科學(xué)的施肥方法往往也會破壞土壤結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致環(huán)境污染，甚至使水體富營養(yǎng)化［5］.此外，由于磷肥在土壤里容易被固定，其平均利用率只有10%～20%，因此易造成磷資源的浪費［6］.土壤里有一類微生物可以分解土壤中難溶性的礦質(zhì)磷，它們被稱為解磷微生物，解磷微生物可以通過分泌磷酸酶和有機酸，比如檸檬酸、葡萄糖酸、依康酸、蘋果酸和草酸等來促進磷元素從磷的化合物里釋放出來［7-8］，從而使其成為可被植物吸收和利用的游離態(tài)磷.土壤中的解磷微生物有很多，其中細菌占大部分比例［9］，據(jù)估計，土壤中大約有50%的細菌被認為是解磷細菌，解磷細菌的種類比較多，包括芽孢桿菌（Bacillus）、假單胞菌（Pseudomonas）、腸桿菌（Enterobacter）、節(jié)桿菌（Arthrobacter）、克呂沃爾氏菌（Kluy?vera）、金色單胞菌（Chryseomonas）、弧菌（Vibrio）、黃色桿菌（Xanthobacter）、微球菌（Micrococcus）、克雷伯氏菌（Klebsiella）等多種屬中的一種或幾種細菌［10］，并且，不同種類的解磷細菌也會通過不同的機制來分解不同來源的磷.解磷菌的數(shù)量和分布在很大程度上受土壤結(jié)構(gòu)類型、質(zhì)地、土壤有機質(zhì)和耕作方式的影響.相關(guān)研究表明，植物根際土中解磷菌的種類和數(shù)量比非根際土中解磷菌的種類和數(shù)量要多很多［11］.趙小蓉［12］等的研究發(fā)現(xiàn)，玉米根際土中細菌和解磷菌的數(shù)量要遠大于非根際土中細菌和解磷菌的數(shù)量.Katznelson發(fā)現(xiàn)小麥根面的解磷菌數(shù)量比根際和非根際中的解磷菌數(shù)量多十幾倍，并且在大麥、紅三葉等植物的根際土微生物數(shù)量更高，但在不同作物根際，解磷菌的數(shù)量和種類也是不同的［13］.目前，對解磷菌的研究主要集中在高效解磷菌的篩選和對解磷特征的分析上.將用解磷微生物加工成的菌肥施入土壤中，一方面可以提高土壤肥力，保證植物生長和改善土壤的菌群結(jié)構(gòu)，另一方面又可以減少磷肥的使用，從而節(jié)約肥料資源，減少污染.可見，解磷細菌的研究對土壤磷素的轉(zhuǎn)換過程有著重要的意義，也對未來農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展起著十分重要的作用.

目前，可防控各種土傳病害的和含高效拮抗生防菌的生物菌肥的研發(fā)已經(jīng)成為一個熱點，其中，包括香蕉枯萎病拮抗生防菌與香蕉根結(jié)線蟲拮抗菌淡紫擬青霉結(jié)合研發(fā)的復(fù)合微生物菌肥［14］.鑒于此，為拓寬生物菌肥的功效，將香蕉枯萎病、番茄青枯病、柑橘黃龍病的拮抗生防菌與提高肥效利用率的菌株相結(jié)合，并以此來研發(fā)不同系列的微生物菌肥，同時通過平板溶磷圈法和鉬銻抗比色法篩選出了一株具有較強解磷性能的細菌，并進行了菌株的鑒定與溶磷條件的分析，旨在為后續(xù)的研發(fā)打下良好基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1土樣實驗土樣來自甘肅省白銀市的一塊西瓜地，其地理位置為東經(jīng)103'—105'，北緯35'—37'.

1.1.2培養(yǎng)基無機磷固體培養(yǎng)基：葡萄糖（C6H12O6）10 g，硫酸銨（（NH4）2SO4）1 g，磷酸鈣（Ca3（PO4）2）5 g，瓊脂16 g，蒸餾水1 000 mL.

無機磷液體培養(yǎng)基：葡萄糖（C6H12O6）10 g，硫酸銨（（NH4）2SO4）1 g，磷酸鈣（Ca3（PO4）2）5 g，硫酸鎂（Mg SO4）0.1 g，胰蛋白胨0.5 g，瓊脂16 g，蒸餾水1 000 mL，pH調(diào)至7.0.

LB液體培養(yǎng)基（解磷細菌的富集）：氯化鈉10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，蒸餾水1 000 mL.

LB固體培養(yǎng)基（單菌落形態(tài)的觀察）：氯化鈉10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL.

1.1.3其他溶液鉬酸鹽溶液：將13 g鉬酸銨（（NH4）6Mo7O24·4H2O）溶于100 mL蒸餾水中，接著將0.35 g酒石酸銻鉀（KSbC4H4O7·1H2O）溶于100 mL蒸餾水中，在不斷攪拌的情況下，將鉬酸銨溶液徐徐加入到300 mLφ=50%的硫酸溶液中，然后再加入酒石酸銻鉀溶液，混勻，以棕色瓶于4℃保存.

w=10%的抗壞血酸溶液：將10 g抗壞血酸溶于100 mL的蒸餾水中，并以棕色瓶于4℃保存.

芽孢染色劑：φ=5%的孔雀綠水溶液，φ=0.5%的番紅水溶液.

1.2方法

1.2.1菌株的篩選（1）解磷菌的提取和初篩：將西瓜苗根部土壤抖落收集，取1 g土樣，并將其置于已滅菌的三角瓶中，加入50 mL的無菌水，放入30℃的搖床中以180 r/min震蕩20 min后取出，然后將震蕩后的樣品逐級稀釋成10-5、10-6、10-7的懸濁液.分別吸取100μL不同質(zhì)量濃度的懸濁液，將其加到無機磷固體培養(yǎng)基上，用玻璃棒涂抹均勻，每個質(zhì)量濃度重復(fù)3次.7 d后測量無機磷固體培養(yǎng)基上有透明圈的菌體直徑（d）和透明圈的直徑（D），并計算D/d.

（2）解磷菌的富集和復(fù)篩：取兩只100 mL的三角瓶，各裝入50 mL的LB液體培養(yǎng)基，挑出無機磷固體培養(yǎng)基上解磷能力較強的菌株并將其接種于LB液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)48 h（溫度37℃，轉(zhuǎn)速180 r/min）.將培養(yǎng)液取出并于無菌離心管中離心，重新用無菌水懸浮菌體.將菌懸液各取1 mL并將其接種到50 mL的無機磷液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)3 d（對照組接入100μL的無菌水）.3 d后離心并取上清液.最后參考陳瑋［15］改編的鉬銻抗比色法，測定速效磷的含量，同時選出速效磷高的菌株.

1.2.2菌株的鑒定（1）菌株形態(tài)和生理生化鑒定：在LB固體培養(yǎng)基上用平板劃線對菌株進行純化，而后觀察菌株單菌落的形態(tài).根據(jù)沈萍［16］的方法對細菌進行芽孢染色；同時參考趙斌［17］的方法，對菌株進行唯一碳源試驗，淀粉、纖維素分解試驗，明膠液化試驗，硝酸鹽還原試驗.

（2）分子生物學(xué)鑒定：根據(jù)遲原龍等［18］的堿裂解法提取細菌DNA，使用細菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR序列擴增.擴增程序為：94℃預(yù)變性4 min；95℃45 s，55℃45 s，72℃60 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物送至上海生工測序，然后將測序所得序列在Gene Bank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，并通過MEGA6.06軟件對解磷菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹.

1.2.3培養(yǎng)時間與溶液中速效磷的關(guān)系配制無機磷液體培養(yǎng)基，取1 mL菌懸液并將其置于50 mL滅過菌的無機磷液體培養(yǎng)基中，作為處理組，處理組制成相同7份，以不加菌液的培養(yǎng)基作為對照組.接菌后于溫度為37℃和轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中培養(yǎng).以后1～7 d每天取1份處理組，并以鉬銻抗比色法測量其中速效磷的含量，同時測量每天的pH，取3次重復(fù)的平均值.

1.2.4初始接種量與溶液中速效磷的關(guān)系配制無機磷液體培養(yǎng)基，滅菌后分別接0 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL的菌懸液（稠密度為2×107CFU/mL）于50 mL的液體培養(yǎng)基中，接著將其置于轉(zhuǎn)速為180 r/min和溫度為37℃的搖床中.第3天取出，測量其pH以及其中的速效磷含量，取3次重復(fù)的平均值.

1.2.5初始pH與溶液中速效磷的關(guān)系用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH將無機磷液體培養(yǎng)基分別調(diào)成pH為5、6、7、8、9的培養(yǎng)基，于121℃滅菌20 min后，接入稠密度為2×107CFU/mL的4 mL菌懸液，并于180 r/min和37℃的條件下培養(yǎng)3 d.3 d后取出，測量其速效磷的含量和pH值，取3次重復(fù)的平均值.

2 結(jié)果與分析

2.1菌株的分離與篩選通過對土壤樣品的涂布處理，在無機磷固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)了7株有透明圈的菌落，通過比較菌落透明圈直徑（D）和菌落直徑（d）之比（表1），篩選出了兩株解磷能力較強的菌株（圖1）.每個菌落的透明圈直徑和菌落直徑均量取3次，均取平均值.其中，菌株1的透明圈的平均直徑為1.03 cm，菌落平均直徑為0.33 cm，透明圈直徑與菌落直徑之比的平均值為3.11.菌株2的透明圈直徑與菌落直徑之比的平均值為1.79，兩株菌株的解磷能力均強于其他菌株，故對菌株1、2的解磷能力再進行比較.

表1 菌株在無機磷平板上的透明圈（D）和菌落直徑（d）之比

圖1 解磷細菌在無機磷固體培養(yǎng)基上的解磷情況

2.2菌株的復(fù)篩兩株菌株在無機磷液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，利用鉬銻抗比色法測量菌液中速效磷的含量，試驗結(jié)果如表2所示，由表2可知，在菌株1的培養(yǎng)液中，其速效磷的含量最高，可達100 mg/L，大于菌株2的速效磷含量，也遠大于對照組的4 mg/L，在此將菌株1命名為GS032，并對其進行進一步的生理生化和分子鑒定.

表2 兩菌株發(fā)酵液中可溶性磷的含量

2.3菌株的形態(tài)和生理生化特征菌落呈淡黃色不透明狀，為不規(guī)則形狀，菌落表面開始較為濕潤、平滑和不粘稠，后期干燥有褶皺.在芽孢染色后，于油鏡鏡檢下發(fā)現(xiàn)有綠色的芽孢，如圖2所示.該菌株能利用葡萄糖、果糖等多種糖類，也能分解淀粉，但不能分解纖維素，其生理生化的鑒定結(jié)果如表3所示.

表3 生理生化的試驗結(jié)果

圖2 菌株GS032于芽孢染色后的顯微觀察結(jié)果

2.4菌株的分子生物學(xué)特征將所測得的生物序列放入GenBanK中進行BLAST比對，選擇同源性最高的12條完整序列，在MEGA6中分析和比對序列后，采用鄰位法構(gòu)建生物系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）.由圖3可知，與GS032序列同源性最高的是序列MT372156.1，能達到99.86%.已向GenBank提交序列數(shù)據(jù)，并獲得核苷酸序列登錄號MW276036.

圖3 菌株GS032的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5培養(yǎng)時間與溶液中速效磷的關(guān)系由圖4分析可得，從第1天到第5天，隨著解磷菌培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基內(nèi)的速效磷含量先上升后下降.在第3天時達到最高含量（87.2 mg/L），第3天后開始下降，第5天時培養(yǎng)基內(nèi)的速效磷含量最低，只有41.8 mg/L，比第3天少45.4 mg/L，是第3天速效磷含量的一半.與之相反的是，培養(yǎng)基內(nèi)的pH則呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，第3天時最低，而第5天時最高.從第1天到第7天，培養(yǎng)基內(nèi)pH值升高時，速效磷的含量則下降，而pH值下降時速效磷的含量卻升高，這說明解磷菌分泌出的有機酸溶解了部分磷酸鈣.

圖4 不同培養(yǎng)時間下培養(yǎng)基的速效磷含量及其培養(yǎng)液的pH變化

2.6初始接種量與溶液中速效磷的關(guān)系由圖5可得，解磷菌接種量對培養(yǎng)基內(nèi)速效磷含量的促增效果是極顯著的（P<0.01），隨著接種量的增加，培養(yǎng)基內(nèi)速效磷的含量也在不斷增加，菌液接種量為4 mL時培養(yǎng)基內(nèi)速效磷的含量為115.04 mg/L，比接種量為0.5 mL時要高出76.2%.0.5 mL的處理與2 mL、3 mL、4 mL的處理相比較，其速效磷含量的差異顯著，但與1 mL的處理相比較，其速效磷含量的差異則不顯著.1 mL的處理與3 mL、4 mL的處理差異顯著，但與0.5 mL和2 mL處理的差異不顯著.處理間速效磷含量差異最顯著的是0.5 mL和4 mL處理，由此可見，接種量差異越大，速效磷含量的差異也就越顯著.與CK組相比，處理組的pH都有了明顯的下降，除了對照組，接了菌的培養(yǎng)基都呈酸性，0.5 mL處理的pH最高，2 mL處理的pH最低.并且，在培養(yǎng)時間相同的條件下接種量越大，培養(yǎng)基中速效磷的質(zhì)量濃度也就越高.

圖5 菌株GS032在不同初始接種量下?lián)u培后的速效磷含量及pH的變化（條形圖上的不同小寫字母代表差異顯著性，P<0.05）

2.7初始p H值與溶液中速效磷的關(guān)系據(jù)圖6分析可得，培養(yǎng)基的初始pH值對培養(yǎng)基內(nèi)速效磷含量的促增效果是顯著的（P<0.05）.培養(yǎng)基內(nèi)pH從5到9依次升高時，培養(yǎng)基內(nèi)的速效磷質(zhì)量濃度則在逐步降低，pH為8和9時培養(yǎng)基內(nèi)速效磷的含量相差很小.初始pH為5時，培養(yǎng)基中速效磷質(zhì)量濃度最高，可達224 mg/L.pH為8時速效磷的質(zhì)量濃度最低，比最高質(zhì)量濃度低40.5%.在初始pH同為酸性或者同為堿性時，溶液中速效磷的含量差異不顯著，如初始pH為7、8、9時，他們之間速效磷的含量差異不顯著.培養(yǎng)基初始狀態(tài)為酸性和堿性相比，最終的速效磷含量差異是顯著的.除初始pH為5的處理外，其他處理的最終pH較初始pH都有一定的下降，初始pH越高，最終pH也就越高.

圖6 菌株GS032在不同初始pH條件下于搖培后溶液中的速效磷含量及pH的變化（條形圖上的不同小寫字母代表差異顯著性，P<0.05）

3 討論與結(jié)論

由于農(nóng)業(yè)需要來自磷礦的磷，而磷礦是一種不可再生的資源，加之剩余磷礦的質(zhì)量在下降，磷肥的生產(chǎn)成本也較高，因此分解和活化土壤中的礦質(zhì)磷就成為緩解磷素危機的一條重要途徑［19-20］.細菌、真菌和放線菌是主要的三種解磷菌，其中，細菌的種類最多，真菌的解磷能力更強，而放線菌則是耐熱性更強［21-22］.本實驗分離和篩選出了一株有解磷能力的菌株.在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液的pH下降，培養(yǎng)基里速效磷的含量則升高.根據(jù)秦利均［23］的整理分析和Bolan［24］的實驗表明，解磷菌是分別通過磷酸酶和小分子有機酸來分解有機磷和無機磷的，并且有機酸主要是通過減少磷的吸附和增加磷化合物的溶解來提高土壤中磷的有效性的.在解磷菌的培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基內(nèi)速效磷的含量先上升，在第3天時達到最高，而后又下降.杜雷［25］的研究表明，在低磷脅迫下，解磷菌能更好地發(fā)揮其功能，磷質(zhì)量濃度過高，解磷菌的促進作用亦會減弱.這和本實驗的結(jié)果是一致的，第3天時速效磷的質(zhì)量濃度升高到了一定程度，解磷菌的解磷速度減弱，再加上解磷菌本身的消耗亦會導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)速效磷的含量降低.當(dāng)磷質(zhì)量濃度降低到一定程度后，在低磷脅迫下，解磷菌又開始進行下一輪的分解工作.經(jīng)過多年的研究，相關(guān)課題組已經(jīng)研發(fā)出一系列含高效拮抗生防菌的防控土傳病害的生物菌肥，并且為了增加生物菌肥的菌株功效，研究者們還將枯萎病、青枯病，黃龍病等的生防拮抗菌與能提高肥料利用率的解磷菌相結(jié)合，研發(fā)出了多功效的生物菌肥.可見，解磷菌的篩選和功能研究對多功效復(fù)合微生物菌肥的研發(fā)有著重要的參考價值.

本研究通過平板溶磷圈法和鉬銻抗比色法，從甘肅的一塊西瓜地里分離和篩選出了一株有解磷能力的菌株.經(jīng)生理生化實驗、芽孢染色和16SrDNA基因序列測序后，該解磷菌株被鑒定為枯草芽孢桿菌.該菌株能利用葡萄糖、蔗糖等，但不能分解和利用纖維素.在培養(yǎng)過程中，菌株產(chǎn)生了酸性物質(zhì)，能分解磷酸鈣并能使培養(yǎng)基里的速效磷含量升高，隨著培養(yǎng)基里的細菌數(shù)量增加，其吸收了培養(yǎng)液里的可溶性磷，從而使得培養(yǎng)液里的速效磷含量下降.實驗表明，至少在短期內(nèi)，培養(yǎng)液接入的解磷菌數(shù)和培養(yǎng)液初始pH與后期培養(yǎng)液內(nèi)的速效磷含量有著明顯的相關(guān)性，因此研究解磷菌的解磷特征對研究土壤中的磷循環(huán)有著重要的意義.