張秋云，沈亞琦，蔣文翔，劉家林，王聯(lián)紅，賀浩華，2，3，胡麗芳，2，3

（1.江西農(nóng)業(yè)大學作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點實驗室，南昌 330045；2.江西省超級稻工程技術研究中心，南昌 330045；3.雙季稻現(xiàn)代化生產(chǎn)協(xié)同中心，南昌 330045）

水稻（Oryza sativaL.）的雄性生殖器官正常發(fā)育對其繁衍具有重要意義［1］。雄性核不育水稻是雜交制種的便捷途徑［2］，雄性生殖器官花藥的最內(nèi)層壁細胞為絨氈層細胞，與小孢子發(fā)育緊密聯(lián)系，是雄性不育的關鍵因素。絨氈層的正常發(fā)育能保障花粉母細胞減數(shù)分裂周期完成，在其發(fā)育后期可分泌酶降解胼胝質(zhì)釋放小孢子，并為花粉粒的發(fā)育提供營養(yǎng)和所需的脂類物質(zhì)［3］。絨氈層發(fā)育依賴于基因的表達，基因的表達受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，確定轉(zhuǎn)錄因子的功能是了解水稻絨氈層發(fā)育相關基因表達的重要部分。

水稻絨氈層的發(fā)育過程簡述為分化形成和退化降解兩個部分，這兩個部分受到不同家族轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用。闡明絨氈層分化形成和退化降解的相關轉(zhuǎn)錄因子之間的調(diào)控網(wǎng)絡，可為進一步了解水稻雄性不育分子機理提供理論支撐。

1 絨氈層的發(fā)育過程及功能

水稻花藥絨氈層發(fā)育是一個連續(xù)的過程，主要分為2 個階段：①分化形成。在花粉母細胞形成期絨氈層初步形成，經(jīng)由次級壁細胞經(jīng)過兩次平周分裂形成于花藥壁的最內(nèi)層［4］。②退化降解。從花粉母細胞減數(shù)分裂初期至小孢子早期，絨氈層細胞質(zhì)開始濃縮、顏色加深；小孢子中期，絨氈層開始退化降解，在成熟花粉時期最終消失［5］。

絨氈層對花粉母細胞和小孢子發(fā)育的作用主要體現(xiàn)在3 個方面：①在花粉母細胞四分體時期，絨氈層會分泌胼胝質(zhì)降解酶，用以分解四分體之間的胼胝質(zhì)結(jié)構(gòu)，釋放小孢子細胞［6］。②從花粉母細胞時期開始，絨氈層為花粉合成營養(yǎng)物質(zhì)并運至藥室中，從而為花粉母細胞減數(shù)分裂和小孢子發(fā)育提供所需的營養(yǎng)［7］。③小孢子中期，絨氈層開始退化降解，合成花粉壁所需孢粉素等脂類物質(zhì)，并通過特殊結(jié)構(gòu)烏氏體運輸?shù)叫℃咦颖砻?，使花粉壁結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，從而保證花粉活力［8］。此外，絨氈層細胞能通過影響減數(shù)分裂基因的表達對小孢子母細胞發(fā)育和成熟發(fā)揮作用［9］。

2 調(diào)控水稻絨氈層發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子

水稻絨氈層的發(fā)育是一個短暫有序的過程，涉及不同的酶、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子［10，11］。轉(zhuǎn)錄因子在生物中廣泛存在，具有保守性，通過特定的DNA 結(jié)合域調(diào)控特定基因的表達，可以產(chǎn)生信號傳導分子，或參與細胞發(fā)育過程調(diào)節(jié)細胞周期［12］。研究發(fā)現(xiàn)影響水稻絨氈層發(fā)育的相關轉(zhuǎn)錄因子主要為bHLH 轉(zhuǎn)錄因子、PHD-finger 結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，此外還有MADS 轉(zhuǎn)錄因子、bZIP 轉(zhuǎn)錄因子、AGO 家族蛋白質(zhì)等，這些轉(zhuǎn)錄因子的功能可分為調(diào)控絨氈層的分化形成和退化降解兩方面（表1）。

表1 參與水稻絨氈層發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子

2.1 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子

目前分離出的參與水稻絨氈層發(fā)育的bHLH 轉(zhuǎn)錄因子包括UDT1（UNDEVELOPED TAPETUM 1）、TDR（TAPETUM DEGENERATION RETARDATION）、TIP2（TDR INTERACTING PROTEIN 2）和EAT1（ETER?NAL TAPETUM 1）。其中UDT1定位于7 號染色體，全長1 698 bp，包括4 個外顯子和3 個內(nèi)含子，編碼含有227 個氨基酸的蛋白質(zhì)。BLAST 功能域分析表明，在第59~118 個氨基酸區(qū)域，既有形成二聚體所需的HLH 結(jié)構(gòu)域，又具有DNA 結(jié)合所需的堿性結(jié)構(gòu)域，表明該蛋白為bHLH 轉(zhuǎn)錄因子。UDT1基因突變得到不育突變植株udt1，表現(xiàn)花藥白色且無可育花粉，氈層細胞持續(xù)空泡化，降解延遲。該基因在絨氈層細胞早期階段具有很高的轉(zhuǎn)錄活性。芯片分析表明，突變體udt1在絨氈層發(fā)育早期大多數(shù)Aps（天冬氨酸蛋白酶）和絲氨酸蛋白酶基因下調(diào)并優(yōu)先表達，而Cys（半胱氨酸蛋白酶）基因上調(diào)并優(yōu)先表達，表明UDT1是水稻絨氈層早期發(fā)育的關鍵基因，主要參與次生壁細胞向成熟絨氈層的分化［13］。

TDR位于2 號染色體，全長3 223 bp，包含7 個內(nèi)顯子和8 個外顯子，編碼一個由552 個氨基酸組成的bHLH 蛋白質(zhì)，bHLH 結(jié)構(gòu)域位于第280~341 個氨基酸之間。TDR 蛋白與擬南芥AMS 蛋白最為相似，但與UDT1編碼的全長蛋白序列僅有12% 的同源性［14］。tdr突變體絨氈層細胞質(zhì)染色不加深，不濃縮，缺乏變性的超微結(jié)構(gòu)特征。TUNEL 試驗和彗星試驗表明，絨氈層PCD（程序性死亡）信號微弱，說明其未能降解。Affymetrix 水稻芯片對在減數(shù)分裂即小孢子發(fā)育階段的野生型和tdr突變體花藥進行轉(zhuǎn)錄分析時，發(fā)現(xiàn)2 個目標基因OsCP1和Osc6分別編碼半胱氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶抑制劑，而半胱氨酸蛋白酶與細胞的凋亡密切相關，表明TDR與水稻花藥絨氈層的PCD 過程密切相關［15］。

TIP2位于1 號染色體，全長2 112 bp，包含3 個內(nèi)含子和3 個外顯子，由于其編碼的產(chǎn)物與TDR相互作用而命名。TIP2編碼的轉(zhuǎn)錄因子包含一個保守的bHLH 結(jié)構(gòu)域和一個未知的功能域，與EAT1 蛋白的序列具有高度相似性。對tip2突變體花藥橫切面觀察，發(fā)現(xiàn)花藥壁內(nèi)三層細胞形態(tài)無明顯差異，無法區(qū)分絨氈層細胞，細胞數(shù)量分析發(fā)現(xiàn)絨氈層的平均細胞數(shù)較野生型顯著增加［14］。共表達TIP2和TDR的酵母菌株在缺乏His 和Ade 的特定培養(yǎng)基上正常生長，顯示LacZ報告基因表達激活，證實了TIP2和TDR之間相互作用。研究表明TIP2與TDR互作共同參與調(diào)控花藥發(fā)育后期絨氈層PCD 過程［16］。

EAT1位于4 號染色體上，全長3 063 bp，包含3個內(nèi)含子和4 個外顯子，EAT1編碼含有一個bHLH結(jié)構(gòu)域和一個DUF 基序的轉(zhuǎn)錄因子。對eat1-1突變體進行花藥橫切面觀察，發(fā)現(xiàn)絨氈層異常，烏氏體呈不規(guī)則的圓形，并被一層管狀結(jié)構(gòu)所覆蓋，花藥發(fā)育和小孢子形成被終止。 qRT-PCR 檢測突變體eat1-1，發(fā)現(xiàn)GAMYB、UDT1、TDR和PTC1等基因在eat1-1花藥中沒有明顯變化，酵母雙雜交分析表明EAT1與TDR相互作用。EAT1在分子調(diào)控網(wǎng)絡上位于TDR的下游，可直接調(diào)控AP25和AP37編碼APs來調(diào)控水稻絨氈層的PCD 過程［17］。

2.2 PHD-finger 結(jié)構(gòu)域蛋白

目前分離出的參與水稻絨氈層發(fā)育的PHDfinger 結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)包括PTC1（PERSISTENT TAPE?TAL CELL1）和TIP3（TDR INTERACTING PROTEIN 3）。TIP3是最新發(fā)現(xiàn)的與水稻TDR 蛋白相互作用的基因，位于3 號染色體上，全長2 094 bp，包含3 個外顯子和2 個內(nèi)含子，編碼698 個氨基酸構(gòu)成的PHD-finger 蛋白質(zhì)。TIP3敲除突變體植株表現(xiàn)出完全不育，與野生型對比，tip3突變體絨氈層細胞PCD 延遲，盡管小孢子母細胞釋放出小孢子，但其細胞質(zhì)凌亂且密布小液泡。突變體tip3從第8 時期開始在絨氈層中幾乎沒有TUNEL 信號，再次表明絨氈層PCD 延遲，說明TIP3也參與調(diào)控水稻絨氈層的PCD 過程［18］。

PTC1定位在9 號染色體上，包含一個2 040 bp的編碼區(qū)，其中有3 個外顯子和2 個內(nèi)含子，分別在N 未端和C 末端預測一個核定位信號和一個保守的PHD 結(jié)構(gòu)域。突變體ptc1表現(xiàn)為雄性不育，透射電鏡分析其花藥結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)其絨氈層的膜和細胞器持續(xù)保持完整，沒有破裂和凋亡的跡象，且絨氈層廣泛增生向花藥室擠壓且烏氏體相對減少。對野生型和ptc1 突變體進行轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)，175 個與脂質(zhì)運輸和代謝以及次生代謝物生物的合成、運輸和分解代謝有關的基因在突變體ptc1中表達量產(chǎn)生差異［19］。進一步分析發(fā)現(xiàn)，PTC1與TIP3在水稻中不是功能冗余基因，能通過另外的途徑調(diào)控水稻絨氈層的退化降解［20］。

2.3 MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子

目前分離出的參與水稻絨氈層發(fā)育相關的MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子包括OsMADS3 和OsMADS8。OsMADS3位于1號染色體，為水稻C類器官識別蛋白質(zhì)，在花藥發(fā)育早期被證明是雄蕊發(fā)育的必需基因。在雄蕊原基中，當外稃和內(nèi)稃原基啟動時，OsMADS3的表達開始被檢測到，在第9~12 時期OsMADS3在絨氈層和小孢子中再次表達。突變體mads3-4絨氈層細胞沒有凝聚且染色較淺，之后絨氈層細胞增大并雜亂無序，且降解延遲［21］。結(jié)果表明，OsMADS3早期參與了花藥原基的分化并間接參與絨氈層形成，后期也在絨氈層退化中表達調(diào)控［22］。

OsMADS8位于9 號染色體，全長6 377 bp，為水稻E 類器官識別蛋白質(zhì)。為分析OsMADS8的調(diào)控網(wǎng)絡，構(gòu)建了OsMADS8基因敲除轉(zhuǎn)基因株系，收集轉(zhuǎn)基因植株0.5~2.0 cm 的圓錐花序用于基因芯片分析。利用水稻芯片技術分析發(fā)現(xiàn)OsMADS8的一個靶向基因OsTGA10，該基因位于9 號染色體上，全長9 095 bp，包含9 個內(nèi)含子和10 個外顯子，被注釋為bZIP 轉(zhuǎn)錄因子。靶向區(qū)域分析表明，OsMADS8直接通過蛋白-DNA 結(jié)合方式靶向OsTGA10。對突變體ostga10花藥切片觀察，發(fā)現(xiàn)突變體的絨氈層細胞降解異常，其細胞質(zhì)不濃縮，細胞核較大，降解延遲［23］。表明OsMADS8不僅調(diào)控水稻花分生組織形成雄蕊且抑制小穗分生組織的逆轉(zhuǎn)，還通過調(diào)控OsTGA10，參與水稻絨氈層的PCD 過程［24］。

2.4 其他轉(zhuǎn)錄因子

目前分離出的參與水稻絨氈層發(fā)育相關的其他轉(zhuǎn)錄因子還包括OsAGO2、DTC1和OsGAMYB。OsAGO2位于4號染色體，全長3 063 bp，編碼包含典型AGO蛋白的PAZ 和PIWI 結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子。OsAGO2的敲除導致花藥發(fā)育缺陷從而花粉不育，絨氈層都出現(xiàn)細胞質(zhì)疏松和空泡化，絨氈層提前出現(xiàn)降解，后期絨氈層細胞持續(xù)空泡化［25］。表明OsAGO2主要參與調(diào)控花藥后期絨氈層降解。

DTC1（DEFECTIVE TAPETUM CELL DEATH 1）位于7 號染色體，全長為3 163 bp，包含6 個內(nèi)含子和6 個外顯子，編碼一種含有DCD 結(jié)構(gòu)域和KELCH重復序列的蛋白質(zhì)。dtc1突變體的絨氈層沒有降解，而是保持原有形狀，但小孢子降解消失。qRTPCR 分析dtc1突變體的基因表達差異，發(fā)現(xiàn)UDT1、TDR和EAT1的表達水平?jīng)]有明顯變化，而OsCP1、AP25、AP37和Osc6的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，這些基因在tdr、eat1和eat1突變體中也表達下調(diào)。DTC1 的啟動子區(qū)域包含一個bHLH 轉(zhuǎn)錄因子的假定靶序列，說明DTC1可能作用于UDT1、TDR和EAT1的下游。雙分子熒光互補試驗得出DTC1 蛋白質(zhì)與OsMT2b和OsMT-I-4b 相互作用，表明DTC1是調(diào)控花藥后期絨氈層降解的重要基因［26］。

OsGAMYB位于1 號染色體，全長4 325 bp，編碼的OsGAMYB 蛋白質(zhì)包含4 個結(jié)構(gòu)域：MYB 結(jié)構(gòu)域和其他3 個保守域，是水稻絨氈層發(fā)育中一個GA 相關的MYB基因。OsGAMYB在花序頂部區(qū)域表達，在雄蕊原基和花藥絨氈層細胞高表達，在營養(yǎng)生長器官表達較低［27］。突變體gamyb的花藥絨氈層發(fā)育異常，小孢子母細胞皺縮不緊挨絨氈層，隨后絨氈層細胞膨脹延伸到內(nèi)室，導致雄性不育。OsGAMYB與UDT1平行作用于絨氈層發(fā)育，影響了水稻絨氈層的退化降解［28］。

3 水稻絨氈層發(fā)育相關基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡

bHLH 蛋白質(zhì)是調(diào)控絨氈層發(fā)育過程的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。UDT1 優(yōu)先表達于絨氈層早期發(fā)育階段，調(diào)控編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因除bHLH 基因外，還包含MYB 和WRKY 轉(zhuǎn)錄因子。UDT1 啟動子包含Ebox 元件，這些元件是bHLH-MYB 轉(zhuǎn)錄復合物中已知的結(jié)合位點，表明UDT1 與OsGAMYB 平行調(diào)控水稻的早期發(fā)育［29，30］。MSP1（MULTIPLE SPORO?CYTE 1）和MIL2（MICROSPORELESS2）調(diào)節(jié)3 個花藥內(nèi)壁層的產(chǎn)生和分化，突變會導致絨氈層消失［31，32］。TIP2、TDR 和EAT1緊密聯(lián)系，主要調(diào)控絨氈層降解，基因表達較晚，可能在UDT1、MSP1和MIL2的下游起作用。TIP2位于TDR和EAT1的上游，在絨氈層分化形成初期表達，促進絨氈層分化。在絨氈層細胞分化形成后期，TIP2 通過激活下游轉(zhuǎn)錄因子TDR編碼蛋白質(zhì)，并與TDR 形成復合蛋白質(zhì)繼續(xù)促進絨氈層細胞的發(fā)育。在四分體時期，TIP2調(diào)控第三個bHLH 轉(zhuǎn)錄因子EAT1的表達，同時EAT1 蛋白與TDR 蛋白形成新的復合體，調(diào)節(jié)絨氈層程序性死亡過程（圖1）。TDR直接調(diào)控花藥發(fā)育相關基因OsADF、Osc6和OsCP1的表達水平。OsADF 是F-box 蛋白質(zhì)，在細胞周期進程、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、程序性細胞死亡和細胞信號等許多生理活動中起關鍵作用［33］。TDR 可能通過觸發(fā)ADF 介導的蛋白質(zhì)水解通路調(diào)節(jié)絨氈層細胞發(fā)育和花粉形成［34］。Osc6和OsCP1與水稻花藥發(fā)育所需的脂質(zhì)（LTPs）有關，OsCP1編碼一種半胱氨酸（Cys）蛋白酶，屬于廣泛分布于動植物和微生物中的一個酶家族，在降解細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和促進PCD 方面發(fā)揮著重要作用［35］。OsC6編碼具有脂質(zhì)結(jié)合活性的特定脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)（LTP），是絨氈層特定結(jié)構(gòu)烏氏體和花粉外壁發(fā)育所必需的［36］。 EAT1 通過激活AP25和AP37（兩者都是天冬氨酸蛋白酶）的轉(zhuǎn)錄，激活下游蛋白酶表達從而調(diào)控絨氈層細胞死亡［37］。

圖1 絨氈層的發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡

OsGAMYB、UDT1、TDR、CYP703A3［38］作用于PTC1的上游，而PTC1調(diào)控Cys 蛋白酶和質(zhì)膜ATP酶的表達，質(zhì)膜ATP 酶是調(diào)節(jié)細胞凋亡和壞死之間轉(zhuǎn)換的關鍵蛋白質(zhì)［39］。TIP3、PTC1和擬南芥中的PHD-finger 蛋白影響雄配子減數(shù)分裂的機制不同［40，41］，TIP3、PTC1與TDR互作，直接或者間接地激活下游特定靶基因進而調(diào)控絨氈層的降解和花粉壁的形成。

OsMADS3和OsMADS8同是花器官識別蛋白質(zhì)，調(diào)控早期絨氈層的分化［42］，同時又參與絨氈層的退化降解。OsMADS3與MT-1-4b的啟動子有關，降低MT-1-4b的表達會導致轉(zhuǎn)基因植株超氧陰離子水平升高，影響花粉育性［43］。OsTGA10為MADS-box蛋白質(zhì)OsMADS8的靶點，OsMADS8蛋白與其第二個內(nèi)含子結(jié)合，從而調(diào)控OsTGA10表達。MTR1編碼一種分泌性成束蛋白糖蛋白，對水稻的雄性生殖發(fā)育起重要作用［44］。OsTGA10蛋白與AP25和MTR1啟動子中的TGACG 單元結(jié)合，抑制了2個基因的啟動子活性，TIP2的存在能增強OsTGA10蛋白的抑制作用。

OsAGO2在轉(zhuǎn)錄因子基因TIP2、TDR、EAT1/DTD和OsTGA10上游發(fā)揮作用。 OsAGO2 蛋白與Os?HXK1啟動子結(jié)合并通過DNA 甲基化直接調(diào)控其表達。OsHXK1 是己糖激酶，這是一種雙功能酶，它既能將己糖磷酸化，形成6-磷酸己糖，又能在糖傳感和信號傳導中發(fā)揮重要作用［45］。OsHXK1 的表達會影響絨氈層活性氧（ROS）的積累，從而調(diào)控絨氈層PCD 和花粉的正常發(fā)育。

DTC1在轉(zhuǎn)錄因子基因UDT1、TDR、EAT1下游和分泌蛋白基因OsMT2b上游發(fā)揮作用。OsMT2b編碼一種分子量小、富含半胱氨酸的小分子金屬結(jié)合蛋白質(zhì)，在植物抗病信號傳導通路中的活性氧產(chǎn)生和細胞死亡中發(fā)揮關鍵作用［46］。DTC1通過降低花藥發(fā)育后期ROS 清除蛋白OsMT2b 的表達量和活性，提高ROS 的含量，從而促進絨氈層的降解。

4 展望

水稻絨氈層的分化形成和退化降解是一個復雜的過程，對花粉粒的育性有著重要作用，目前已發(fā)現(xiàn)多種與水稻絨氈層發(fā)育相關的轉(zhuǎn)錄因子。bHLH 蛋白質(zhì)是花藥絨氈層細胞分化、形態(tài)建成和降解過程的核心調(diào)控因子，可調(diào)節(jié)PHD-finger 蛋白質(zhì)的表達。MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子是同時協(xié)助水稻絨氈層形成及降解的重要轉(zhuǎn)錄因子。絨氈層細胞降解是小孢子發(fā)育的重要保障，活性氧（ROS）的積累是導致絨氈層細胞PCD 的關鍵。DTC1和OsMADS3直接或間接調(diào)控ROS 清除蛋白OsMT-1-4b 和OsMT2b 的表達量和活性，從而提高ROS 的含量，進一步促進絨氈層的降解，影響花粉的形成。此外脂肪代謝物是花粉外壁的重要成分，PTC1和EAT1分別影響半胱氨酸蛋白酶和蛋白酶抑制因子的表達，調(diào)控花粉壁的脂肪家族代謝，從而影響花粉育性。

應用正向及反向遺傳學是了解水稻絨氈層發(fā)育相關基因的有效方法，花粉不育為相關突變體的產(chǎn)生和發(fā)現(xiàn)提供了良好的試驗材料，為研究水稻花粉發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡提供了便利。轉(zhuǎn)錄因子之間調(diào)控網(wǎng)絡主要通過突變體引起的表達量變化來判斷其上下游關系。然而人類目前對許多水稻絨氈層發(fā)育相關轉(zhuǎn)錄因子功能的了解還不深入，其調(diào)控網(wǎng)絡依舊模糊。近年來，水稻花粉發(fā)育特定階段以及特定組織的基因表達譜分析工作和激光微切割技術的發(fā)展為水稻花粉發(fā)育的分子機理研究奠定了良好的基礎，同時高通量測序及代謝組分析方法的充分利用，使得對水稻絨氈層發(fā)育的相關轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡研究更加深入，相信更多未知的控制水稻生殖發(fā)育的分子機制將逐漸被人們所解析。