羅海山，孟德璇，陳曉陽，羅紅兵*

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙410128;2中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京100193)

在開花植物中，花粉發(fā)育成熟是一個極其復(fù)雜的過程，期間涉及到花藥原基細(xì)胞的分裂分化，花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂和有絲分裂等過程?；ǚ鄣陌l(fā)育依賴于花藥壁細(xì)胞層尤其是絨氈層細(xì)胞的支持。植物的花藥一般有呈蝶形的4個花粉囊，每個花粉囊的囊壁從外向內(nèi)分別是表皮層、藥室內(nèi)壁、中層、絨氈層［1］，花粉小孢子位于花粉囊腔內(nèi)。

有研究表明，絨氈層細(xì)胞發(fā)育過程中的任何異常，都可能直接或間接導(dǎo)致花粉粒的敗育，形成雄性不育［2，3］。對植物絨氈層細(xì)胞發(fā)育和分子機(jī)理的研究，將有助于更深入的了解花粉發(fā)育與雄性不育的分子機(jī)理，并利用生物技術(shù)創(chuàng)造可供生產(chǎn)中應(yīng)用的優(yōu)良雄性不育系。

1 植物絨氈層的功能

植物絨氈層作為花藥壁最內(nèi)層細(xì)胞，是向花粉母細(xì)胞運(yùn)輸物質(zhì)的樞紐，對花粉母細(xì)胞及后期小孢子的正常發(fā)育起著至關(guān)重要的作用［4］。

在花粉發(fā)育過程中，向花粉小孢子輸送營養(yǎng)物質(zhì)是植物絨氈層最主要的功能之一，絨氈層細(xì)胞中的物質(zhì)被極性轉(zhuǎn)運(yùn)至向藥室面，并分泌到藥室中，從而為花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂和花粉小孢子發(fā)育提供所需的營養(yǎng)［5］;在小孢子母細(xì)胞完成減數(shù)分裂形成四分體之后，絨氈層細(xì)胞適時的向外分泌胼胝質(zhì)酶，用以分解四分體之間的胼胝質(zhì)結(jié)構(gòu)，釋放出小孢子細(xì)胞［6］。

此外，人們還在絨氈層上發(fā)現(xiàn)了烏氏體和絨氈層小體，它們分別在花粉壁和花粉包被的形成過程中起了重要的作用［7，8］。絨氈層的這些功能表明，絨氈層細(xì)胞是花粉粒成熟過程中一層極其重要的細(xì)胞，它與花粉粒的正常發(fā)育有著密切的聯(lián)系。

2 植物絨氈層異常導(dǎo)致花粉敗育的機(jī)理

2.1 細(xì)胞學(xué)機(jī)理

周巍等［9］認(rèn)為，絨氈層細(xì)胞最靠近花粉母細(xì)胞，花粉母細(xì)胞發(fā)育所需營養(yǎng)主要來自絨氈層的供給，絨氈層發(fā)生異常，必然會引起花粉的發(fā)育異常。有研究［10，11］表明，絨氈層異常導(dǎo)致花粉小孢子敗育的原因主要是由于絨氈層細(xì)胞程序性死亡(Programmed Cell Death，PCD)造成的;調(diào)控絨氈層細(xì)胞PCD過程的基因一旦表達(dá)出現(xiàn)異常，都可能導(dǎo)致絨氈層細(xì)胞提前或者推遲降解，進(jìn)而影響花粉小孢子的正常發(fā)育，最終形成雄性不育［12］。

曹媛等［13］在對毛白楊的研究中發(fā)現(xiàn)，絨氈層細(xì)胞Ca2+－ATPase的分布異常會影響絨氈層細(xì)胞的正常PCD進(jìn)程，使絨氈層細(xì)胞無法正常降解，小孢子發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)得不到及時供應(yīng)，導(dǎo)致了花粉的敗育。戴文懿等［14］發(fā)現(xiàn)，在擬南芥的溫敏雄性不育突變體atms1中，高溫環(huán)境會使花藥絨氈層PCD進(jìn)程出現(xiàn)滯后，直到花粉粒發(fā)育后期仍無法正常降解，導(dǎo)致其不能產(chǎn)生正常的花粉粒，影響了植株的育性。盛英等［15］在對小麥不育系的研究中發(fā)現(xiàn)，由于RAFTIN1基因的提前高表達(dá)，導(dǎo)致絨氈層PCD異常而提前降解，小孢子無法得到充足的發(fā)育所需營養(yǎng)而形成雄性不育。

除了絨氈層細(xì)胞PCD進(jìn)程異常的原因以外，花粉小孢子敗育也可能由于絨氈層細(xì)胞本身發(fā)育過程中出現(xiàn)異常造成。朱惠霞等［16］在對花椰菜不育系09－R9的試驗中發(fā)現(xiàn)，該突變體的絨氈層細(xì)胞發(fā)育異常，花粉囊內(nèi)無絨氈層形成。許忠民等［17］發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)不育系CMS158在花粉母細(xì)胞四分體時期絨氈層細(xì)胞徑向膨大，細(xì)胞內(nèi)含物極少，其營養(yǎng)無法滿足自身發(fā)育需要，反而通過徑向伸長以吸取小孢子四分體中營養(yǎng)，導(dǎo)致小孢子營養(yǎng)流失，不能正常生長發(fā)育而形成敗育。施展等［18］認(rèn)為，大白菜不育系6w－9605A的敗育原因是絨氈層細(xì)胞異常膨大，擠壓小孢子，導(dǎo)致小孢子和絨氈層解體。

綜上所述，在正常的花藥中，絨氈層細(xì)胞完全成熟之后，細(xì)胞內(nèi)富含花粉小孢子后期發(fā)育所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)，當(dāng)小孢子從四分體釋放出來時，絨氈層便開始降解以提供小孢子發(fā)育營養(yǎng)和結(jié)構(gòu)物質(zhì)［19］，同時也能為花粉粒的完全成熟騰出空間。而PCD異?；蛘甙l(fā)育異常的絨氈層細(xì)胞，則無法正常向小孢子提供發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)，甚至占據(jù)了小孢子發(fā)育所需的空間，最終導(dǎo)致花粉的敗育。

2.2 分子學(xué)機(jī)理

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，在擬南芥和水稻等模式植物中鑒定克隆了一些與絨氈層發(fā)育相關(guān)的基因，使人們更深入的了解到調(diào)控植物絨氈層細(xì)胞發(fā)育過程的分子機(jī)制。由圖2可見，在花藥細(xì)胞分化早期，調(diào)控絨氈層發(fā)育的基因有AG、SPL/NZZ、EMS/EXS、TPD1、BAM1/BAM2以及 MPK3/MPK6 和ER/ERL1/ERL2［20～23］等。Toshiro Ito 等［24］發(fā)現(xiàn)，AG(Agamous)作為絨氈層發(fā)育早期的調(diào)控因子之一，位于SPL/NZZ(Sporocyteless/Nozzle)基因的上游，并通過激活SPL/NZZ基因的表達(dá)，共同調(diào)控花藥的發(fā)育;而SPL/NZZ基因編碼一個MADS－box轉(zhuǎn)錄因子家族的核蛋白，其功能與孢原細(xì)胞分化形成初生周緣細(xì)胞和初生造孢細(xì)胞的過程有關(guān)，突變體spl/nzz中的孢原細(xì)胞可以形成，但接著的細(xì)胞分裂會出現(xiàn)缺陷，導(dǎo)致絨氈層和造孢細(xì)胞缺失，造成雄性不育。

圖2 絨氈層發(fā)育的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模式圖［19］

Hord等［25］在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了 BAM1(Barely Any Meristem 1)/BAM2，這對基因主要調(diào)控花藥發(fā)育早期細(xì)胞的特異分化，并且推測 BAM1/BAM2與SPL/NZZ可能在花藥中協(xié)同對造孢細(xì)胞和體細(xì)胞的數(shù)量平衡起正負(fù)調(diào)控的作用。

EMS1和TPD1對花藥發(fā)育早期偏后的時期起著調(diào)控作用。在擬南芥中，EMS1基因編碼了一個LRR－RLK蛋白受體激酶［26］，TPD1基因編碼1個含176個氨基酸的小蛋白;這兩個基因在細(xì)胞中的表達(dá)位置并不相同，EMS1主要在絨氈層中表達(dá)，而TPD1則主要是在小孢子母細(xì)胞中表達(dá)，它們的突變體表型類似，均是在花藥細(xì)胞層出現(xiàn)發(fā)育缺陷，突變體的絨氈層細(xì)胞被額外形成的小孢子母細(xì)胞所取代。Yang等［27］將TPD1基因在擬南芥中過表達(dá)時發(fā)現(xiàn)，突變體心皮的數(shù)目明顯增加，而在EMS1突變體中過表達(dá)TPD1基因時卻沒發(fā)現(xiàn)相同的變化，這證明了TPD1和EMS1可能在同一條調(diào)控途徑中起作用。

SERK1(Somatic Embryogenesis Receptor－Like Kinase 1)和SERK2基因編碼了一個LRR型的受體蛋白激酶，雙突變體表型為絨氈層缺失，產(chǎn)生較多小孢子母細(xì)胞，與ems1和tpd1的突變表型相類似，推測可能與EMS1和TPD1有比較相似的調(diào)控途徑［28］。Hord等［29］對 ER 家族(ER，ERL1，and ERL2)和MPK3(Mitogen－Activated Protein Kinase 3)/MPK6的研究中發(fā)現(xiàn)，這兩個基因家族的突變體也是在絨氈層的發(fā)育過程中出現(xiàn)了一層異常的細(xì)胞，然而在這類突變體中，EMS1和TPD1的表達(dá)均不受影響，所以推斷MPK3/MPK6和ER/ERL1/ERL2在絨氈層細(xì)胞的發(fā)育中可能有其獨(dú)立的調(diào)控途徑。

DYT1(DYSFUNCTIONAL TAPETUM 1)是絨氈層發(fā)育中期表達(dá)的bHLH類型的轉(zhuǎn)錄因子，與水稻中的UDT1(UNDEVELOPED TAPETUM1)基因高度同源。Zhang等［30］研究發(fā)現(xiàn)，該基因位于 SPL/NZZ、EMS/EXS等基因調(diào)控途徑的下游，主要在絨氈層中表達(dá)，表達(dá)高峰期在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂早期和后期，突變體的絨氈層液泡化嚴(yán)重且不能降解，且小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂異常，無法形成正常的胼胝質(zhì)壁，導(dǎo)致不能形成正常的小孢子。

TDF1(TAPETAL DEVELOPMENT AND FUNCTION1)、AMS(ABORTED MICROSPORES)、MYB103、MS1(MALE STERILITY 1)是調(diào)控絨氈層后期發(fā)育的4個主要轉(zhuǎn)錄因子。基因表達(dá)分析表明［19］，TDF1基因的作用位于AMS和MYB103基因的上游，DYT1的下游，該基因編碼了一個MYB家族轉(zhuǎn)錄因子，其突變體絨氈層細(xì)胞在發(fā)育的第7期高度液泡化，無法形成分泌型細(xì)胞，后期小孢子被擠在花粉囊中間且無法降解導(dǎo)致花粉敗育。

AMS與水稻中的TDR(TAPETUM DEGENERATION RETARDATION)基因同源，編碼了一個MYC類的轉(zhuǎn)錄因子，主要在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂后期的絨氈層細(xì)胞中表達(dá)，突變體表現(xiàn)為絨氈層細(xì)胞肥大、降解推遲導(dǎo)致的花粉不育［31］。

Zhang等［32］發(fā)現(xiàn)，MYB103 基因與絨氈層中胼胝質(zhì)的降解以及花粉外壁的形成相關(guān)，通過對MYB103的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，MYB103調(diào)控著MS2和A6啟動子的表達(dá)，其作用域位于MS1的上游。MS1基因通過編碼具有PHD－finger結(jié)構(gòu)域的蛋白，調(diào)控絨氈層細(xì)胞和小孢子的發(fā)育，ms1突變體由于絨氈層發(fā)育異常，不能正常降解導(dǎo)致小孢子從四分體釋放后，無法形成正常的花粉壁而退化降解［33］。

3 其他影響絨氈層發(fā)育的相關(guān)基因

在水稻、油菜、玉米等其他大田作物中，也陸續(xù)報道了一些與絨氈層發(fā)育相關(guān)的基因。

在水稻中，Osc6、OsOPT9、MTR1等基因都與花藥絨氈層發(fā)育相關(guān)。Zhang等［34］研究發(fā)現(xiàn)，Osc6是TDR下游一個基因，在第9期到第11期的絨氈層和小孢子中特異表達(dá)，參與了絨氈層內(nèi)脂類物質(zhì)前體向其它花藥組織的運(yùn)輸過程，水稻OsOPT9基因位于第八號染色體上，同源分析顯示它屬于水稻寡肽運(yùn)輸家族，突變體花粉敗育是由于小孢子母細(xì)胞發(fā)育時期花藥的絨氈層過早脫落降解造成的［35］。MTR1是2012年由Tan等［36］克隆出來的一個水稻不育基因，它編碼了一個含有Fasciclin結(jié)構(gòu)域的分泌性的糖蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，該基因雖然在花粉母細(xì)胞中特異表達(dá)，卻影響了絨氈層細(xì)胞的發(fā)育，導(dǎo)致絨氈層細(xì)胞無法正常降解。

曾芳琴等［37］對油菜 SB45A不育系的研究發(fā)現(xiàn)，油菜BnCYP704BJ基因與孢粉素的合成有關(guān)，該基因的突變會導(dǎo)致絨氈層中脂類物質(zhì)代謝的紊亂造成不育。夏秀云［1］推測，甘藍(lán)型油菜的不育相關(guān)基因BnATA20可能受TPD1的調(diào)控，突變體表現(xiàn)為絨氈層膨大擠壓小孢子，導(dǎo)致花粉敗育。

MAC1是調(diào)控玉米絨氈層形成及發(fā)育的一個重要基因，mac1突變體表現(xiàn)為絨氈層缺失，本應(yīng)發(fā)育為絨氈層的細(xì)胞層被小孢子母細(xì)胞取代，由于絨氈層的缺失，小孢子母細(xì)胞不能完成減數(shù)分裂，最終沒有花粉產(chǎn)生［38］。

4 小結(jié)與展望

植物絨氈層細(xì)胞在花粉粒發(fā)育成熟過程中扮演著舉足輕重的角色，盡管目前人們對絨氈層的發(fā)育過程以及結(jié)構(gòu)功能研究比較多，但是對其分子機(jī)理的了解還在探索中，比如絨氈層的PCD的精確調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，絨氈層異常產(chǎn)生大量液泡的作用機(jī)制還缺乏直接的分子生物學(xué)證據(jù)。

隨著生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對絨氈層機(jī)理研究的不斷深入，可以利用基因工程等成熟的技術(shù)條件，創(chuàng)造人工雄性不育系，來克服常規(guī)育種中時間上的局限性。前人研究［39］表明，將煙草中絨氈層的特異啟動子基因T29與外源基因Barnase(胞外核糖核酸酶)嵌合，在絨氈層中表達(dá)可以破壞絨氈層細(xì)胞，從而獲得雄性不育材料。目前該技術(shù)在煙草［40］、葡萄［41］、菜心［42］、甘藍(lán)［43］等作物上均有成功的例子。通過基因工程的方法來創(chuàng)建不育系，具有快速、高效、簡便等優(yōu)勢，不僅大大縮短了育種的周期，也節(jié)省了人力物力，在以后的育種工作中必將有著廣泛的應(yīng)用前景。

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