劉芹邑，張 琪，安 婧，董士遠

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266000）

食品加工中發(fā)生美拉德反應所形成的潛在危害安全物質(zhì)如丙烯酰胺（acrylamide，AA）、雜環(huán)胺（heterocyclic amines，HAs）和晚期糖化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）等[1]已受到廣泛關(guān)注。AGEs是經(jīng)過美拉德反應中期、后期階段形成的一類復雜化合物的總稱。近年來，羧甲基賴氨酸（N-ε-carboxymethyllysine，CML）、羧乙基賴氨酸（N-ε-carboxyethyllysine，CEL）作為食品AGEs標志性產(chǎn)物備受關(guān)注，而甲基乙二醛氫咪唑酮（N-δ-(5-hydro-5-methyl-4-imidazolon-2-yl)-ornithine，MGH1）目前關(guān)注較少。美拉德反應中期階段產(chǎn)生高活性醛類及二羰基化合物，包括乙二醛（Glyoxal, GO）、甲基乙二醛（Methylglyoxal, MGO）與賴氨酸側(cè)鏈共價結(jié)合形成 CML、CEL，MGO與精氨酸側(cè)鏈共價結(jié)合形成MG-H1[2]。目前大量證據(jù)表明，膳食AGEs易在體內(nèi)積累，與諸如動脈粥樣硬化、腎臟疾病等慢性疾病的發(fā)生相關(guān)[3-4]。

影響食品AGEs形成的因素主要包括食品成分、加工方式和加工輔料。食品中含有較高的蛋白、脂質(zhì)和糖類，高蛋白高脂肪食品AGEs相對含量高，低脂牛奶制品、蔬菜、水果等AGEs含量較少[5]。此外，一般來說，干熱加工對食品AGEs形成的促進作用強于濕熱（蒸煮）加工[6-7]。蔗糖在受熱條件下可分解為葡萄糖和果糖衍生物，繼續(xù)受熱則會產(chǎn)生羰基化合物[8]，這些都是美拉德反應前體物質(zhì)，為促進AGEs的形成提供可能。Li等[9]通過使用微波加熱蔗糖-賴氨酸模式體系，證明美拉德反應的產(chǎn)生且形成CML；Cerny等[10]發(fā)現(xiàn)蔗糖的添加有助于蛋氨酸-葡萄糖模式體系中葡萄糖降解以及Amadori產(chǎn)物形成；Liang等[11]發(fā)現(xiàn)蔗糖-賴氨酸模式體系初始摩爾比的增加可以顯著促進吡咯素的形成。醬油本身含有一定量的AGEs前體物質(zhì)，Liu等[12]發(fā)現(xiàn)深色醬油MGO含量明顯高于蠔油，但GO含量低于醋和蠔油。醬油所含氨基肽氮較多[13]，添加到食品中可能促進AGEs形成。Chao等[14]發(fā)現(xiàn)在肉類中添加醬油進行烹飪后，CML和戊糖素顯著升高。

迄今為止，關(guān)于糖和醬油添加水平對食品AGEs形成影響的報道較少。鱘魚是我國主要淡水養(yǎng)殖魚類，其肉中蛋白質(zhì)含量高，富含必需氨基酸和多不飽和脂肪酸，相關(guān)鱘魚產(chǎn)品的開發(fā)受到越來越多的重視。本研究采用鱘魚為材料，通過添加不同比例的綿白糖和醬油并進行油炸處理，首次系統(tǒng)探究綿白糖和醬油對油炸鱘魚AGEs及其前體物質(zhì)糠氨酸、二羰基化合物形成的影響，為油炸水產(chǎn)品AGEs形成和控制提供理論依據(jù)和技術(shù)指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西伯利亞鱘、史氏鱘的雜交鱘魚（Acipenser baerii×Acipenser schrenckii） 青島市城陽區(qū)鱘魚養(yǎng)殖場，每條平均體重約1.5～2.5 kg，活鱘魚運送至實驗室，去除魚頭、魚皮和魚骨，將魚肉攪碎備用；AGEs標準品：羧甲基賴氨酸（CML）、羧乙基賴氨酸（CEL）、甲基乙二醛氫咪唑酮（MG-H1）、D4-羧甲基賴氨酸（D4-CML）、D4-羧乙基賴氨酸（D4-CML）、D3-甲基乙二醛氫咪唑酮（D3-MG-H1） 純度均大于99%，加拿大TRC公司；甲醇（色譜純） 德國Merck公司；糠氨酸（Furosine）標準品 Neosystem Laboratoire公司；其他試劑 均為分析純或色譜純。

1290/6460液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；T18basic高速均質(zhì)分散機 德國IKA公司；GL-21M高速冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；LC-20AT 高效液相色譜儀、UV-2550紫外可見分光光度計、F-4600熒光分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鱘魚餅制備 將絞碎的鱘魚肉與1%食鹽混合均勻，按照表1加入調(diào)味料并攪拌均勻。調(diào)味料比例是根據(jù)預實驗添加調(diào)味料后鱘魚餅的滋味來確定的。隨后使用模具制作重量約40 g、直徑6.5 cm、厚度1 cm的鱘魚餅，設(shè)置對照組為不添加綿白糖和醬油的鱘魚餅。預實驗結(jié)果表明，在170 ℃油溫下油炸9 min的鱘魚餅品質(zhì)佳，故將鱘魚餅浸沒在170 ℃的大豆油油炸9 min，每隔90 s翻轉(zhuǎn)一次。油炸后的鱘魚餅經(jīng)冷卻、稱重、攪碎、混勻后儲存在-20 ℃以作進一步分析。所以樣品均在3 h內(nèi)制備完畢。

表1 調(diào)味料添加比例（w/w，%）Table 1 Seasoning addition ratio(w/w, %)

1.2.2 糠氨酸含量測定 參照Tavares等[7]采用高效液相色譜法檢測油炸鱘魚餅糠氨酸含量變化。準確稱取200 mg樣品于安瓿瓶中，加入2 mL 9 mol/L HCl并密封，在110 ℃酸解24 h。酸解液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。取Sep-Park C18柱活化、平衡，取0.5 mL濾液經(jīng)由此柱凈化，并用3 mL 3 mol/L HCl洗脫，收集洗脫液。使用 Allitima C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱進行分離分析。流動相A為0.4%乙酸水溶液，流動相B為含有0.3%氯化鉀的0.4%乙酸水溶液。采用等度洗脫，流動相A比例為98%，流動相B比例為2%，流速設(shè)定為1 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫為30 ℃。

1.2.3 甲基乙二醛（MGO）、乙二醛（GO）含量測定參照Zhu等[15]進行二羰基化合物含量的測定。

1.2.3.1 樣品前處理 稱取1 g樣品添加10 mL水震蕩提取3 h，然后添加10 mL甲醇沉淀蛋白，并于5000 ×g離心20 min。取2 mL上清液，加入100 μL 40 mg/mL鄰苯二胺于60 ℃衍生2 h；添加2 mL 50%甲醇的水溶液，過0.22 μm濾膜于進樣小瓶。標準品濃度設(shè)為0～0.25 μg/mL。

1.2.3.2 樣品的檢測 采用LC-MS/MS分析方法對樣品中MGO、GO含量進行檢測。采用Symmetry C18（2.1×100 mm，3.5 μm）色譜柱，流動相A為0.1%甲酸甲醇，流動相B為0.1%甲酸水。流速為0.3 mL/min，流動相梯度設(shè)定如下：0～10 min，70%～40% B；10～12 min，40%～70% B；12～15 min，70% B。柱溫設(shè)定為30 ℃。質(zhì)譜采用電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式，多重反應監(jiān)測模式（MRM），監(jiān)測參數(shù)見表2。

表2 二羰基化合物多重反應監(jiān)測參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters for multiple reactions monitoring AGEs

1.2.4 熒光AGEs含量測定 參照 Delgado-Andrade等[16]的方法檢測油炸鱘魚餅熒光性AGEs含量變化。稱取4 g 樣品分散于20 mL 0.2 mol/L pH8.2 的磷酸鹽緩沖液中，然后加入40 μL堿性蛋白酶，并在55 ℃條件下恒溫水浴1 h。冷卻至室溫后，在8000×g條件下離心15 min，隨后取上清檢測熒光值，激發(fā)波長設(shè)定為347 nm，發(fā)射波長設(shè)定為415 nm，狹縫寬度設(shè)定為5 nm。以1 μg/mL的硫酸奎寧作為100%熒光強度，樣品熒光強度以AU/100 mg protein表示。

1.2.5 CML、CEL、MG-H1含量測定 參照Sun等[17]的方法檢測油炸鱘魚餅CML和CEL含量變化。

1.2.5.1 樣品預處理 取40 mg樣品于安瓿瓶中，加入0.4 mL、0.2 mol/L、pH9.2的硼酸鹽緩沖液和0.08 mL的2 mol/L硼氫化鈉溶液（以0.1 mol/L的NaOH配制），并在4 ℃條件下放置8 h，然后添加0.8 mL、6 mol/L HCl，并密封，在110 ℃條件下酸解24 h，并在60 ℃條件下干燥，隨后以2 mL超純水復溶。取Sep-Park MCX柱活化、平衡，取復溶液經(jīng)由此柱凈化，并用3 mL含有5%氨水的甲醇洗脫，收集洗脫液，使用0.22 μm濾膜過濾，待上機檢測。用濃度均為5 μg/mL的CML-d4、CEL-d4、MG-H1-d3、CML、CEL、MG-H1配制2 mL含0.05 μg/mL內(nèi)標品的標準品溶液。

1.2.5.2 樣品檢測 采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LCMS/MS）對所制得的樣品進行檢測，使用HILIC Silica column（2.1×100 mm，3 μm）色譜柱對待測物進行分離分析。流動相A為0.1%甲酸甲醇，流動相B為0.1%甲酸水。流速為0.2 mL/min，流動相梯度設(shè)定如下：0～3 min，20%～50% B；3～6 min，50%B；6～6.1 min，50%～20% B；6.1～12 min，20% B。柱溫設(shè)定為35 ℃。質(zhì)譜采用電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式，多重反應監(jiān)測采集模式（MRM），采集參數(shù)見表3。

表3 AGEs 多重反應監(jiān)測采集參數(shù)Table 3 Mass spectrometric parameters for multiple reactions monitoring AGEs

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗設(shè)計的所有指標均設(shè)計3個平行，實驗結(jié)果以平均值±標準偏差表示，所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析利用R（v3.5.0）及R Studio（v1.1.453）軟件進行，P＜0.05為有顯著差異。所有實驗均重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加綿白糖與醬油對油炸鱘魚餅糠氨酸含量的影響

糠氨酸是美拉德反應前期的前體物質(zhì)Amadori產(chǎn)物經(jīng)過酸化水解而產(chǎn)生[18]，被認為是評價食品加工熱處理強度的技術(shù)指標[19]。醬油與綿白糖的添加對油炸鱘魚餅糠氨酸含量影響如圖1所示。油炸鱘魚餅糠氨酸含量隨綿白糖、醬油添加水平增加而增加。與Con相比，T1、T2、T3組糠氨酸含量由15.90 μg/100 mg protein顯著升高到26.49 μg/100 mg protein及以上（P＜0.05），這表明綿白糖的添加大大提高油炸鱘魚餅糠氨酸含量。蔗糖雖是非還原性糖，不能參與美拉德反應，但其加熱后的分解產(chǎn)物之一為葡萄糖[20]，為美拉德反應提供充足的反應物。本團隊的另一研究發(fā)現(xiàn)，與未添加糖粉的蝦餅相比，單獨添加3%糖粉的烘焙蝦餅和微波蝦餅糠氨酸含量分別增加33.3%和28.9%[21]。醬油中含有少量葡萄糖，因此添加醬油也會導致糠氨酸含量的增加。綿白糖與醬油同時添加則進一步導致糠氨酸含量增加，最高可達55.88 μg/100 mg protein。方差分析顯示，綿白糖和醬油對糠氨酸含量均具有極顯著性影響（P＜0.01），綿白糖與醬油共同添加則產(chǎn)生顯著協(xié)同作用影響（P＜0.05），共同促進糠氨酸產(chǎn)生。

圖1 醬油與綿白糖的添加對油炸鱘魚餅中糠氨酸含量的影響Fig.1 Effects of the addition of soy sauce and soft white sugar on furosine content in fried sturgeon patties

2.2 添加綿白糖與醬油對油炸鱘魚餅MGO、GO含量的影響

醬油與綿白糖的添加對油炸鱘魚餅中MGO、GO含量影響如圖2所示。T1、T2、T3組MGO、GO含量逐漸增加，表明僅添加綿白糖可促進油炸鱘魚餅中MGO、GO的產(chǎn)生，且隨著添加量的增加逐漸增加。有研究表明蔗糖在加熱過程中會發(fā)生焦糖化反應，并能夠?qū)⒔到猱a(chǎn)生二羰基化合物[22-23]。與對照相比，J1組MGO、GO含量顯著升高（P＜0.05），而J2組GO含量顯著降低（P＜0.05），表明1%醬油的添加促使油炸鱘魚餅中 MGO、GO形成；2%醬油的添加抑制GO形成。綿白糖與醬油共同添加時，MGO、GO含量呈現(xiàn)非線性變化。在綿白糖固定添加水平情況下，MGO、GO含量隨醬油添加水平增加而逐漸減少。方差分析顯示，綿白糖與醬油共同添加時產(chǎn)生交互作用影響（P＜0.05）。當綿白糖添加量為3%、醬油添加量為1%時，MGO、GO含量最高分別為9.94 μg/g protein、2.73 μg/g protein?；旌咸砑訒r，與T1、T2、T3組相比，醬油減弱綿白糖對GO形成的促進作用，當醬油添加量為2%時抑制效果更加明顯。

圖2 醬油與綿白糖的添加對油炸鱘魚餅中MGO、GO含量的影響Fig.2 Effects of the addition of soy sauce and soft white sugar on MGO, GO content in fried sturgeon patties

2.3 添加綿白糖與醬油對油炸鱘魚餅熒光AGEs含量的影響

醬油與綿白糖的添加對油炸鱘魚餅熒光強度影響如圖3所示。油炸鱘魚餅熒光強度隨綿白糖或醬油添加量的增加而增加。J1、J2組熒光強度顯著高于T1、T2組（P＜0.05），表明醬油對油炸鱘魚餅熒光強度的提高效果高于綿白糖。綿白糖與醬油的共同添加進一步提高油炸鱘魚餅中熒光強度。當綿白糖添加量為3%、醬油添加量為2%時，熒光強度最高（28.17%/100 mg protein）。熒光AGEs形成途徑之一是氨基與還原糖反應。因此，綿白糖促進熒光AGEs形成的原因是其通過熱降解提供豐富的還原糖[22]，而醬油中豐富的氨基酸提供充足的游離氨基[24]，因此，無論是單獨添加還是組合添加均能導致熒光AGEs形成增加，且受添加量影響。另外，從前文得出，2%醬油的添加降低油炸鱘魚餅GO含量，推測醬油中的大部分游離氨基參與美拉德反應時可能不形成二羰基化合物，而直接重排形成晚期糖化終末產(chǎn)物，從而促進熒光AGEs產(chǎn)生。

圖3 醬油與綿白糖的添加對油炸鱘魚餅熒光強度的影響Fig.3 Effects of the addition of soy sauce and soft white sugar on fluorescence intensity in fried sturgeon patties

2.4 添加綿白糖與醬油對油炸鱘魚餅CML、CEL、MG-H1 含量的影響

醬油與綿白糖的添加對油炸鱘魚餅CML、CEL、MG-H1含量影響如圖4所示。綿白糖的添加促進CML、CEL、MG-H1形成，而醬油的添加促進CEL形成，卻降低CML、MG-H1形成。無醬油添加時，綿白糖的添加量對CML影響較大?；旌咸砑訒r，相較于綿白糖，醬油對CML形成的抑制效果占主導作用，而相較于醬油，綿白糖對MG-H1形成的促進效果占主導作用。

圖4 醬油與綿白糖的添加對油炸鱘魚餅中CML、CEL、MG-H1含量的影響Fig.4 Effects of the addition of soy sauce and soft white sugar on CML, CEL, MG-H1 content in fried sturgeon patties

CML與CEL是賴氨酸衍生產(chǎn)物，MG-H1是精氨酸衍生產(chǎn)物[25]。CML可以通過Amadori產(chǎn)物氧化產(chǎn)生，也可通過GO與賴氨酸殘基反應產(chǎn)生；CEL通過MGO與賴氨酸殘基反應產(chǎn)生；MG-H1通過MGO與精氨酸殘基反應產(chǎn)生[26]。作者研究發(fā)現(xiàn)，綿白糖添加導致MGO、GO形成增加，因此綿白糖的添加造成鱘魚餅CML、CEL、MG-H1含量增加。

油炸鱘魚餅中AGEs形成受醬油添加量的影響，主要表現(xiàn)為低水平醬油添加會使油炸鱘魚餅CML、CEL形成增加，高水平醬油添加會使油炸鱘魚餅CML、MG-H1形成減少。推測低濃度醬油中的游離氨基與食品體系中的游離羰基反應并占主導作用，并且醬油中的游離氨基還能與MGO、GO反應，使得部分AGEs含量升高，另外，醬油中多糖化合物的存在也可能促進食品體系中美拉德反應的發(fā)生；而醬油中同時含有豐富的大豆異黃酮等酚類化合物及抗氧化性肽，這些成分不僅能與食品體系產(chǎn)生的MGO、GO共價結(jié)合導致MGO、GO含量下降，其本身還具有一定的DPPH自由基清除能力和抗氧化能力[27-28]，有助于抑制食品體系中AGEs形成。與本研究相似，根據(jù)Mashilipa等[29]報道，醬油可以通過抗氧化、螯合金屬離子等作用抑制AGEs形成；Ham等[27]發(fā)現(xiàn)醬油的Fe2+螯合活性和DPPH自由基清除活性可能是防止熟牛肉餅脂質(zhì)氧化的主要機制，而脂質(zhì)氧化正是AGEs形成途徑之一。從前文可知，高水平醬油添加抑制GO的形成，推測醬油通過抑制GO與賴氨酸殘基反應途徑從而造成CML含量降低。另外，AGEs的形成包含有多條途徑，包括美拉德反應、脂質(zhì)氧化、糖降解[30]，作者推測，醬油對多條AGEs形成途徑的影響效應是不同的，從而導致添加醬油后三種AGEs呈現(xiàn)不同的變化趨勢。

當綿白糖與醬油混合添加時，醬油減弱綿白糖對GO、CML的促進效果，使GO和CML的形成受到抑制，推測由于醬油中的酚類物質(zhì)及抗氧化肽在GO形成途徑中與GO共價結(jié)合，而綿白糖降解產(chǎn)生GO的速度要慢于GO被共價結(jié)合的速度，因此同時添加會使GO含量降低，從而使CML含量降低。

3 結(jié)論

綿白糖或醬油的添加對油炸鱘魚餅AGEs形成有影響，且兩者共同添加對油炸鱘魚餅AGEs含量具有顯著交互作用（P＜0.05）。綿白糖的添加提高油炸鱘魚餅AGEs（CML、CEL、MG-H1）及其前體物（糠氨酸、MGO、GO）含量，且綿白糖添加量與油炸鱘魚餅AGEs及其前體物含量呈正相關(guān)，表明綿白糖在油炸魚餅過程發(fā)生降解產(chǎn)生醛類物質(zhì)和二羰基化合物，從而促進AGEs的形成。醬油的添加增加鱘魚餅糠氨酸、熒光AGEs、CEL含量，但降低油炸鱘魚餅CML、MG-H1含量，1%醬油的添加促進油炸鱘魚餅MGO、GO產(chǎn)生，而2%醬油的添加降低油炸鱘魚餅GO產(chǎn)生。綿白糖和醬油共同添加進一步促進油炸鱘魚餅糠氨酸、熒光AGEs、MG-H1含量增加，而醬油對GO、CML形成的抑制占主導作用。

綜上，在鱘魚餅油炸過程中，添加過多的綿白糖會較大促進晚期糖化終末產(chǎn)物的形成，醬油由于其復雜成分導致其添加對不同AGEs標志物形成影響各異。因此，建議未來研究應關(guān)注調(diào)味料對魚加工食品AGEs形成機制方面的研究。