郭停停,陸超榕,高 潔,開龍鑫,孫曉利, 楊厲穎,焦紅梅,孔桂美,李國才,3

(1.揚州大學醫(yī)學院,江蘇 揚州,225009;2.江蘇省非編碼RNA基礎與臨床轉(zhuǎn)化重點實驗室,江蘇 揚州,225009;3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚州,225001)

鮑曼不動桿菌(Ab)是一種革蘭陰性、非發(fā)酵、過氧化氫酶陽性和氧化酶陰性的芽孢桿菌[1]。鮑曼不動桿菌是一種機會致病菌，是引起醫(yī)院感染的重要病原菌之一，主要發(fā)生在免疫功能低下的患者中，具有很高的發(fā)病率和死亡率[2]。此外，鮑曼不動桿菌極易形成生物被膜，而抗生素的濫用又會導致多種菌株對多類抗生素產(chǎn)生耐藥性[3]。

抗菌肽(AMPs)是一種短肽，結構繁多，長度一般小于100個氨基酸，是由核糖體合成的天然抗生素，具有分子量小、水溶性好、熱穩(wěn)定性等優(yōu)點，可發(fā)揮抗菌活性、抗癌活性、免疫調(diào)節(jié)等作用。與常用抗生素相比,AMPs對多種耐藥菌株表現(xiàn)出較低的耐藥性、快速殺傷作用、廣譜活性和顯著的臨床療效[4]。

抗菌肽的類別主要包括動物來源抗菌肽、微生物來源抗菌肽和植物來源抗菌肽。動物抗菌肽主要包括哺乳動物源抗菌肽、兩棲動物源抗菌肽和昆蟲源抗菌肽。人源抗菌肽作為哺乳動物源抗菌肽的成員，因其物種特點，在臨床使用中不容易產(chǎn)生細胞毒性以及排異反應，更具備優(yōu)先發(fā)展成為新型抗菌藥物的潛力。兩棲類動物中的組織蛋白酶抑制素(Cathelicidins)家族抗菌肽具有高效廣譜的抗菌活性，相比其他動物源抗菌肽而言，這一類抗菌肽更具獨特性，比如特殊的酶作用、強修復活性等[5]。因此，研究兩棲類動物中的Cathelicidins家族抗菌肽對動物免疫學和新藥研發(fā)都具有重要意義。昆蟲源抗菌肽在治療哺乳動物疾病的過程中具有極大潛能[6]。本文對人源抗菌肽、兩棲動物源抗菌肽和昆蟲源抗菌肽結構特點以及治療鮑曼不動桿菌感染的研究進展進行綜述。

1 人源抗菌肽

人源抗菌肽主要由Cathelicidins、防御素(Defensins)和富組蛋白(Histains)組成。

1.1 Cathelicidins

LL-37是人體內(nèi)抗菌肽Cathelicidins家族的唯一成員,LL-37是目前被研究最多的一種抗菌肽。LL-37是Cathelicdin肽Hcap-18的C末端切割產(chǎn)物，該抗菌肽包含37個氨基酸[7],LL-37與LPS的相互作用是其抗菌作用的主要機制。LPS的結構重塑可增加革蘭陰性菌(如腸道沙門氏菌)對LL-37的耐藥性[8]。

最低抑菌濃度和最低生物膜根除濃度試驗[9]表明LL-37可降低鮑曼不動桿菌的生物膜形成能力，或可成為治療鮑曼不動桿菌感染的潛在治療方法。在最低抑菌濃度的測定過程中，LL-37對鮑曼不動桿菌的最低抑制濃度(MIC)為16～32 μg/mL。最低生物膜根除濃度(MBEC)實驗[10]表明，LL-37在32 μg/mL對鮑曼不動桿菌生物膜不僅有抑制作用，也有分散作用。LL-37截短片段在濃度為64～128 μg/mL時對生物膜有抑制作用。KS-30是LL-37的截短片段，能在64 μg/mL的濃度下有效分散生物膜。因此，該類抗菌肽對鮑曼不動桿菌具有顯著的抗菌和抗生物膜活性，并且無細胞毒性[10]。

鮑曼不動桿菌外膜蛋白A (OmpA)通過OmpA樣結構域參與鮑曼不動桿菌的耐藥性[11]。相關實驗[12]表明，LL-37除了可以對鮑曼不動桿菌的生物膜有抑制和分散作用之外，還可以結合鮑曼不動桿菌的OmpA 蛋白。以BA-LL37為探針，在野生型菌株中檢測到OmpA信號，但OmpA缺失菌株中未發(fā)現(xiàn)該蛋白，驗證了二者的相互作用。因此,LL-37也可以通過與OmpA蛋白結合來拮抗鮑曼不動桿菌感染。

1.2 Defensins

Defensins是先天免疫系統(tǒng)的一個效應成分，具有廣泛的抗菌活性，是哺乳動物防御系統(tǒng)中具有殺菌能力的組分。Defensins和帶負電荷的細胞膜之間的靜電相互作用是殺死細菌的主要機制[13]。人類有2種防御素，即α-防御素和β-防御素(hBDs)。根據(jù)表達模式和遺傳結構，α-防御素可進一步細分為髓系(HNP1-4)和腸系(HD5和HD6)。α-防御素是一種豐富的抗菌肽，具有廣泛、強效的抗細菌、抗真菌和抗病毒活性[14]。HNP1-4主要由中性粒細胞表達，但也可在單核/巨噬細胞、自然殺傷細胞、部分T細胞、B細胞和未成熟樹突狀細胞(DCs)中表達[15]。人防御素5 (HD5)是一種α-亞家族肽，能夠在體內(nèi)滅活致病菌，是一種潛在的能夠消除多重耐藥鮑曼不動桿菌的殺菌劑。HD5是一種32位殘基陽離子肽，由3個二硫鍵提供特定的構象[16],主要在腸帕內(nèi)特細胞中檢測到，因其已經(jīng)進化出了抑制病原體的能力，因此是拮抗MDR Ab的潛在候選者。HD5d5是由二硫鍵還原和引入精氨酸構建的HD5的簡化衍生物，能夠結合并穿透MDR Ab膜，通過災難性的崩潰和代謝中斷導致細菌死亡。HD5d5對MDR Ab具有強大的抗菌活性，因此是一種有希望在臨床環(huán)境中拮抗MDR Ab的候選藥物[16]。

人hBDs是上皮細胞來源的陽離子AMPs,在先天免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)之間起橋梁作用。通過檢測鮑曼不動桿菌對原代口腔和皮膚上皮細胞hBD-2和hBD-3的誘導作用，發(fā)現(xiàn)鮑曼不動桿菌對hBD-3的誘導作用大于對hBD-2的誘導作用。研究[17]顯示,hBDs可以通過輔助和化學吸引T細胞、未成熟樹突狀細胞、B細胞、中性粒細胞和巨噬細胞來增強適應性免疫。鮑曼不動桿菌感染氣道上皮細胞可誘導hBD-2的產(chǎn)生。通過研究2株鮑曼不動桿菌對原代口腔和皮膚上皮細胞hBD-2和hBD-3的誘導作用，發(fā)現(xiàn)hBD-3優(yōu)先以表皮生長因子受體(EGFR)依賴的方式誘導。雖然這兩種抗菌肽對鮑曼不動桿菌都有抗菌活性，但hBD-3更有效，可能是因為其凈陽離子電荷高于hBD-2。對鮑曼不動桿菌AB0057和ATCC 17978進行藥敏試驗,hBD-2和hBD-3對鮑曼不動桿菌均表現(xiàn)出濃度依賴性的殺滅作用,hBD-3在0.062 5 μmol/L濃度下幾乎完全殺滅了這2株鮑曼不動桿菌[18]。

2 兩棲動物源抗菌肽

兩棲動物源抗菌肽是指來源于蛙類皮膚的抗菌肽，這些肽構成了先天免疫系統(tǒng)的組成部分以抵抗微生物的入侵，也可以在阻止捕食者捕獵的方面發(fā)揮作用。該種抗菌肽具有多樣性，表現(xiàn)在不同種類的兩棲動物皮膚中有不同種類的抗菌肽。兩棲動物源抗菌肽在醫(yī)藥、食品工業(yè)和農(nóng)業(yè)等領域有著廣闊的應用，尤其在臨床上的應用越來越受到關注。

2.1 馬蓋寧(Magainin)及其類似物培西加南(Pexiganan)

馬蓋寧(Magainin)是由非洲爪蟾的皮膚中分離出來的抗肽素，有Magainin-1和 Magainin-2,都具有抗不動桿菌活性，但Magainin-2抗菌活性更強。研究[19]報道Magainin-2在4.9～64 μg/mL的濃度下抑制鮑曼不動桿菌敏感菌株和耐藥菌株的生長，而Magainin-1需要達到256 μg/mL才能發(fā)揮相同效果。Magainin-2對人角質(zhì)細胞(HaCaT)無細胞毒性及溶血活性，對鮑曼不動桿菌的生物膜有明顯的抑制和消除作用。上述結果表明,Magainin-2是一種有效的抗鮑曼不動桿菌的抗菌和抗生物膜制劑。

在發(fā)現(xiàn)Magainin-2后，研究者試圖通過改變氨基酸序列來提高肽的抗菌活性和穩(wěn)定性，此后Pexiganan和MSI-78被研發(fā)出來[20]。Pexiganan具有很高的抗鮑曼不動桿菌活性，在1～8 μg/mL濃度下能抑制鮑曼不動桿菌的敏感和耐藥臨床分離株的生長[21]。Pexiganan對人紅細胞的溶血活性表明誘導100%溶血的最低濃度為250 μg/mL[22],遠低于許多菌株的MIC。這說明Pexiganan對紅細胞具有高選擇性，因此毒性較低。MSI-78已完成了臨床試驗Ⅲ期階段，雖然美國食品藥品監(jiān)督局(FDA)還沒有批準MSI-78的臨床使用，但其仍然是迄今為止最好的用于治療的AMPs。臨床試驗設計以及肽生產(chǎn)的改進都將大大增加FDA批準Pexiganan進入臨床使用的可能性[23]。

2.2 布萊溫素-2(B2RP)相關肽

B2RP是從水貂蛙和匠蛙的皮膚分泌物中分離出來的，具有廣譜抗菌活性，但其治療潛力受到中度溶血活性的限制。B2RP具有抗病毒活性，特別是保護細胞免受HIV-1感染。B2RP能在29.0 μg/mL濃度下抑制鮑曼不動桿菌的生長，但在7.0～13.9 μg/mL濃度下對鮑曼不動桿菌的抑制效果更好[24]。該肽導致細菌生長抑制或細菌死亡的機制可能是在目標細胞附近形成α-螺旋結構，導致磷脂雙分子層的擾動。由于這種肽對人紅細胞有著中等毒性，所以其應用受到了極大的限制。為了解決這一局限性，科學家想出了氨基酸替代的方法。目前研究人員已經(jīng)制造了一種類似于這種肽的物質(zhì)，替代位置為4、16和18 (D4K,K16A,L18K),結果是抗鮑曼不動桿菌活性提高了2倍且溶血活性降低。研究[25]稱替代模式D4K的B2RP類似物可以抑制敏感的和黏菌素耐藥菌株，也可以抑制鮑曼不動桿菌的XDR分離株。

3 昆蟲源抗菌肽

昆蟲源抗菌肽主要包含蜂毒肽(Melittin)、天蠶素(Cecropins)、昆蟲類防御素、富含脯氨酸的抗菌肽等，這類抗菌肽主要針對革蘭陰性細菌。將這些分子引入市場是一個較大的挑戰(zhàn)，例如作為藥物將會是一種具有成本效益的大規(guī)模生產(chǎn)工藝。昆蟲源性肽主要有免疫活性肽、肽激素和毒液中的肽[26],其中蜂毒肽屬于毒液中的肽，天蠶素屬于免疫活性肽。

3.1 Melittin

Melittin是蜜蜂毒液的主要成分[26],具有10～14個氨基酸，其中包括獨特的疏水氨基酸和兩親α-螺旋構象，其是一種多功能肽，具有抗細菌、抗真菌、抗寄生蟲、抗病毒和抗癌特性[27]。蜂毒肽具有較強的抗不動桿菌活性，在0.125～2.000 μg/mL濃度下可以抑制鮑曼不動桿菌的MDR和XDR臨床分離株[28]。蜂毒肽對鮑曼不動桿菌有一定的殺菌活性，且細胞黏附分子的殺菌活性不受莢膜存在的影響。采用掃描電鏡觀察分析[29]發(fā)現(xiàn)，蜂毒肽和黏菌素在0.125～0.250 μg時的協(xié)同作用完全抑制了生物膜的形成，對耐黏菌素鮑曼不動桿菌分離株具有快速的殺菌作用，因此蜂毒肽可以作為克服鮑曼不動桿菌多黏菌素耐藥性的有前途的替代方案。研究[30]表明，蜂毒肽在無毒劑量下與多酚青霉烯、頭孢他啶協(xié)同作用，可作為外用藥物治療MDR細菌引起的燒傷感染。

3.2 天蠶素

Cecropins最初是從巨型蠶蛾的血淋巴中分離出來的[31],其主要是由鱗翅目和雙翅目昆蟲中分離到的大量抗菌和有毒肽組成，構成了昆蟲無細胞免疫的主要組成部分。Cecropins是一種小蛋白質(zhì)，約有35個氨基酸殘基，對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌都有活性。天蠶素可以溶解細菌細胞膜，也可以抑制脯氨酸的攝取，并導致細胞膜滲漏[32]。

3.2.1 天蠶素A(Cecropin A):Cecropin A是一種具有穩(wěn)定α-螺旋結構的抗菌肽。天蠶素A可顯著降低還原型輔酶Ⅱ(NADPH)和谷胱甘肽水平，通過形成活性氧簇(ROS)進一步誘導氧化應激[33]。臨床研究[34]表明,Cecropin A能在0.5～32.0 μg/mL時抑制鮑曼不動桿菌活性。研究[35]還表明,Cecropin A能分別在32 μg/mL和256 μg/mL濃度下抑制鮑曼不動桿菌敏感株和黏菌素耐藥株的生長。

從埃及伊蚊中分離到的抗菌肽BR003-天蠶素A(BR003-Cecropin A)對鮑曼不動桿菌的抑制活性高于其他抗菌肽，在4.5 μg/mL濃度下對鮑曼不動桿菌的敏感和耐多藥菌株具有抑制作用，其對鮑曼不動桿菌細胞膜的通透性可能是其殺菌的潛在機制[36]。

Cec是家蠅產(chǎn)生的天蠶素家族基因，其中Cec4的抑菌活性更為廣譜，對鮑曼不動桿菌的抑菌效果非常強[37]。Cec4能在24 h內(nèi)快速、濃度依賴性地殺滅鮑曼不動桿菌。此外，掃描電鏡分析[37]表明Cec4通過破壞細胞膜完整性來殺菌。

3.2.2 Mdc:Mdc是一種從家蠅幼蟲中提取的新型天蠶素抗菌肽，對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌標準株均有較強的抑制活性[38]。Mdc的MIC為4 μg/mL,其殺菌動力學顯示對鮑曼不動桿菌快速滅活需30 min。流式細胞術檢測結果[38]表明,Mdc誘導鮑曼不動桿菌細胞膜通透，且其作用時間與濃度有關。透射電鏡檢查顯示,Mdc能夠破壞細菌細胞膜，導致必要的細胞質(zhì)成分外排。本研究中抗菌肽及其氨基酸序列見表1。

表1 本研究中抗菌肽及其氨基酸序列

4 總結與展望

本文主要闡述了人源抗菌肽、兩棲動物源抗菌肽和昆蟲源抗菌肽在治療鮑曼不動桿菌引起的感染中的作用及其機制。目前有關抗菌肽藥動學、藥效學方面的研究還比較少，大多數(shù)的抗菌肽試驗只適用于局部治療，比如LL-37的應用[39]。目前，已經(jīng)進入臨床試驗階段的抗菌肽有乳鏈菌肽、源于Magainin的MSI-78及源于protegin的IB-367,用于治療局部感染。因此，要在臨床上更多地使用抗菌肽時，還要解決好它的毒性、免疫原性、應用方法、藥物制劑等方面的問題。

抗菌肽的另一種潛在的應用是與抗生素共同給藥?？咕穆?lián)合抗生素治療可減少抗生素耐藥性的發(fā)生。此外，許多研究已觀察到抗菌肽和抗生素之間的體外協(xié)同作用[40]。當藥物聯(lián)合使用時，以更低的劑量可以減少毒性或不良副作用。本文可指導抗菌肽在控制臨床感染中的應用，并為新型抗菌肽的研發(fā)提供思路。