劉 澍 盧建東 呂祎彤 喻長(zhǎng)遠(yuǎn)* 熊?chē)?guó)良*

(1.深圳市中醫(yī)院， 深圳 518005； 2.北京化工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 北京 100029)

引 言

肝癌是最常見(jiàn)的肝臟惡性腫瘤，致其發(fā)生的主要因素包括慢性病毒性肝炎、肝硬化、脂肪性肝病等[1]。近年來(lái)，肝癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，已經(jīng)成為威脅人類健康和妨礙社會(huì)發(fā)展的主要疾病之一，因此肝癌的預(yù)防與治療成為人們研究的熱點(diǎn)。對(duì)于肝癌的有效治療方案主要包括手術(shù)、化療等手段，索拉非尼和瑞格拉非尼是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的治療肝癌晚期的藥物，盡管這類化學(xué)藥物提高了癌癥的治愈率，但它們具有較大的毒副作用及耐藥性[2]。因此，探索與開(kāi)發(fā)新的肝癌治療藥物是很有必要的。

癌癥的早期發(fā)生和發(fā)展與多數(shù)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，細(xì)胞的凋亡代謝又受自身免疫性疾病等多種疾病的影響。中藥具有多靶點(diǎn)、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，可通過(guò)多途徑抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，因此日益受到人們的關(guān)注。雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook F.)作為一種傳統(tǒng)中藥，用于治療免疫系統(tǒng)疾病及炎性疾病已有數(shù)百年的歷史。研究表明，雷公藤可用于胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多種癌癥的治療[3]，雷公藤的提取物(如雷公藤甲素和雷公藤紅素)可通過(guò)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡和誘導(dǎo)分化而發(fā)揮抗肝癌療效[4]。

在雷公藤有效成分的抗癌機(jī)制研究中，Sun等[5]發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可以激活抑癌基因P53，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。Li等[6]發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素可以通過(guò)激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)肝癌Bel-7402細(xì)胞的凋亡。張乙川等[7]發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素通過(guò)激活caspase-3及抑制NF-κB通路來(lái)誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的凋亡。目前，對(duì)雷公藤抗肝癌機(jī)制的研究大多局限于單一成分的分析，尚未全面系統(tǒng)地闡述雷公藤的藥效機(jī)制和作用靶點(diǎn)。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)分析方法，借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)并結(jié)合多個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)，分析現(xiàn)有的相關(guān)信息資料(包括藥物、疾病、基因組、蛋白組等相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù))，多層次地建立“藥物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)以及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)，利用計(jì)算機(jī)解析軟件全面展示藥物與靶點(diǎn)、靶點(diǎn)與疾病之間的關(guān)系，從網(wǎng)絡(luò)層面研究雷公藤對(duì)肝癌的干預(yù)和影響，揭示雷公藤治療肝癌的分子作用機(jī)制，為肝癌的進(jìn)一步治療研究提供有力的理論依據(jù)。

1 網(wǎng)絡(luò)分析

1.1 雷公藤藥效成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建

從TCMSP平臺(tái)(http://www.tcmspw.com/tcmsp.php)中獲取雷公藤的活性成分藥理信息[8]，以藥代動(dòng)力學(xué)(ADME)參數(shù)中的口服生物利用度(OB)≥30%和藥物相似性(DL)≥0.18作為篩選條件，確定雷公藤在人體內(nèi)生物活性較高的關(guān)鍵成分。同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)收集雷公藤的藥效成分信息，對(duì)其進(jìn)行補(bǔ)充。

利用PubChem化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nl-m.nih.gov/)確認(rèn)上述所得化合物的分子結(jié)構(gòu)，將這些化合物轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)的Canonical SMILES格式，以 sdf格式儲(chǔ)存。

1.2 雷公藤關(guān)鍵成分抗癌差異靶點(diǎn)的篩選

在TCMSP平臺(tái)的Targets Information中搜集獲取已確定藥物成分的靶點(diǎn)蛋白。使用Swiss Target Prediction平臺(tái)進(jìn)行化合物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，補(bǔ)充上述藥物的靶點(diǎn)信息，屬性設(shè)置為“homo sapiens”，其余參數(shù)設(shè)置均為默認(rèn)。

利用GeneCards、OMIM、Drugbank等數(shù)據(jù)庫(kù)以“l(fā)iver cancer”、“hepatocellular carcinoma”為關(guān)鍵詞檢索，收集人類肝癌的疾病基因。從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選數(shù)據(jù)集GSE33006，以此為肝細(xì)胞癌(HCC)組織樣本和相鄰的正常肝組織的基因表達(dá)特征數(shù)據(jù)，以GEO2R工具對(duì)此樣本進(jìn)行差異性表達(dá)分析，使用Rstudio 3.6.2軟件以|log2FC|>1(FC為倍數(shù)變化)及P<0.05為篩選條件作火山圖，獲得肝癌差異基因。

1.3 基因標(biāo)準(zhǔn)化和比對(duì)

通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.Uniprot.org/)下載“homo sapiens”的所有基因數(shù)據(jù)，整理所得靶點(diǎn)蛋白和基因信息并對(duì)其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正。將TCMSP中的靶點(diǎn)蛋白信息與Swiss Target Prediction的預(yù)測(cè)結(jié)果和主要成分信息進(jìn)行去重校對(duì)，剔除無(wú)靶點(diǎn)的活性成分，完善雷公藤的藥效成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。將雷公藤藥物靶點(diǎn)與挖掘到的肝癌相關(guān)基因進(jìn)行映射篩選，確定雷公藤中關(guān)鍵成分的抗癌作用靶點(diǎn)。

1.4 藥效成分- 靶點(diǎn)(C- T)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件建立雷公藤藥效成分-肝癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并使用network analyzer插件對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)特征分析。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)代表成分、靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)的度值(degree value)越大，靶點(diǎn)的生物學(xué)重要性的權(quán)重越大，說(shuō)明該節(jié)點(diǎn)越重要，越有可能是雷公藤作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，因此我們對(duì)度值較大的活性成分重點(diǎn)關(guān)注。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了更好地分析雷公藤抗肝癌靶點(diǎn)間的相互作用，將雷公藤抗癌靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，利用Multiple proteins模塊工具進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析，參數(shù)“organism” 設(shè)置為“homo sapiens”， 參數(shù)“minimum required interaction score”設(shè)置為“medium confidence(0.400)”，參數(shù)“network display options”設(shè)置為“hide disconnected nodes in the network”，其余參數(shù)設(shè)置均為系統(tǒng)默認(rèn)。以此建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并將結(jié)果存為T(mén)SV格式文件。導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，去除游離蛋白，進(jìn)行可視化拓?fù)浞治觥?/p>

1.6 生物過(guò)程和代謝通路富集分析

為了進(jìn)一步了解核心靶點(diǎn)的功能及在信號(hào)通路中的作用，將篩選的抗癌靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)，將所有靶基因ID類型校正為官方名稱，輸入靶基因名稱列表，限定物種為“homo sapiens”，設(shè)定人類全基因組為背景參照，經(jīng)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索和轉(zhuǎn)化操作，獲得gene ontology(GO)生物學(xué)過(guò)程富集分析和Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)信號(hào)通路富集分析，然后使用Rstudio 3.6.2軟件包對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化加工。

1.7 分子對(duì)接模擬驗(yàn)證

選取重要的藥效成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。通過(guò)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)搜索蛋白靶點(diǎn)來(lái)選擇最佳的晶體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Pymol軟件進(jìn)行去水、除雜，保存為pdb格式文件。使用AutoDock 4.2軟件進(jìn)行對(duì)接，使用藥物配體與蛋白受體的pdbqt格式文件，進(jìn)行加氫，計(jì)算電荷，設(shè)置原子類型[9]。選定受體結(jié)構(gòu)確定中心進(jìn)行畫(huà)盒，設(shè)置構(gòu)象搜索方法等對(duì)接參數(shù)進(jìn)行分子對(duì)接計(jì)算。

蛋白結(jié)構(gòu)根據(jù)以下條件進(jìn)行篩選[10-11]：1)物種選擇“homo sapiens”；2)試驗(yàn)方法中選擇通過(guò)X晶體衍射法獲取的蛋白結(jié)構(gòu)；3)蛋白的晶體分辨率選擇2.0～3.0 ?，因?yàn)槭褂梅直媛蔬^(guò)低的晶體結(jié)構(gòu)可能使對(duì)接結(jié)果不理想；4)優(yōu)先選擇已有文獻(xiàn)報(bào)道的蛋白結(jié)構(gòu)。

2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

肝癌HepG2細(xì)胞，康源博創(chuàng)生物科技(北京)有限公司；雷公藤甲素(純度≥98%)、雷公藤紅素(純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰酶，SolarBio公司；RIPA裂解液，Thermo Scientific公司；凝膠快速制備試劑盒、STAT3、PTGS2抗體，CST公司；內(nèi)參GAPDH、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，Beyotime公司。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

使用DMEM培養(yǎng)基，將HepG2細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱(311型，Thermo Fisher公司)中貼壁培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底部80%左右，使用PBS洗滌，用0.25%胰酶消化傳代。

2.3 Western Blot測(cè)定蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，分于6孔板中，將0.5、1、1.5 μmol/L的雷公藤甲素或雷公藤紅素處理的細(xì)胞孔設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，未添加藥物處理的細(xì)胞孔設(shè)為對(duì)照組，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h，PBS清洗，收取細(xì)胞。使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，收集總蛋白。使用蛋白核酸電泳儀(EPS 600型，上海天能科技有限公司)，以每孔100 μL的上樣量進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，于120 V恒壓1.5 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，于350 mA恒流1.5 h，用8%脫脂奶粉孵育內(nèi)參GAPDH和一抗(PTGS2、STAT3)，4 ℃過(guò)夜。次日清洗膜，與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，再次洗滌后，置于化學(xué)發(fā)光成像儀(ChemiScope-6000-Rro型，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)下觀察并拍照。

3 結(jié)果與討論

3.1 雷公藤藥效成分的篩選結(jié)果

從TCMSP平臺(tái)中篩選得到144種雷公藤有效成分，根據(jù)ADME參數(shù)對(duì)其進(jìn)行評(píng)估、刪選，最終篩選出51種，另外根據(jù)Targets Information結(jié)果刪掉無(wú)蛋白靶點(diǎn)的成分。檢索雷公藤成分的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行補(bǔ)充、排除，同時(shí)考慮到雷公藤紅素是雷公藤抗炎和抑制免疫的非常重要的有效成分，故本文將其也納入雷公藤的有效成分化合物庫(kù)中，最終確定了雷公藤的31個(gè)藥效成分，如表1所示。

表1 篩選出的雷公藤藥效成分Table 1 Screened effective ingredients of Tripterygium wilfordii

3.2 雷公藤主要成分抗癌靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

根據(jù)Swiss Target Prediction平臺(tái)預(yù)測(cè)藥物靶點(diǎn)，篩選得到68個(gè)Probability>0.5的靶點(diǎn)，與TCMSP平臺(tái)的164個(gè)基因蛋白互補(bǔ)，確定208個(gè)藥物靶點(diǎn)蛋白。對(duì)照UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將其靶蛋白標(biāo)準(zhǔn)化，并與GeneCards、OMIM、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)所得的人類肝癌相關(guān)基因通過(guò)Venn圖進(jìn)行比對(duì)剔除，結(jié)果如圖1所示，其中藍(lán)色與其他顏色的交集部分即為篩選確定的80種雷公藤抗肝癌靶點(diǎn)。

對(duì)GSE33006肝癌樣本數(shù)據(jù)集的差異基因作火山圖，如圖2所示。取|log2FC|>1、P<0.05的結(jié)果，與上一步數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行交集映射，得到具有上下調(diào)屬性的抗癌基因31個(gè)。

3.3 C- T網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

根據(jù)3.2節(jié)的數(shù)據(jù)篩選結(jié)果，我們創(chuàng)建了雷公藤的藥效成分與對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)映射，如圖3所示。該復(fù)合網(wǎng)絡(luò)包含55個(gè)節(jié)點(diǎn)和393條邊，節(jié)點(diǎn)包含31個(gè)雷公藤抗肝癌靶點(diǎn)和24個(gè)化合物，邊表示它們彼此之間的聯(lián)系。按度值由大到小篩選，確定核心成分為山奈酚、雷公藤甲素、β-谷甾醇、雷公藤紅素。從對(duì)應(yīng)靶標(biāo)基因的數(shù)量來(lái)看，這幾種成分可能是治療肝癌的重要化合物。另外，從蛋白靶點(diǎn)的角度來(lái)看，我們選擇度值大于2倍中位數(shù)的結(jié)果，其分別是PTGS2、ESR1、AR、NOS3、JUN、PRKACA、TGFB1。在網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治鼋Y(jié)果中，我們認(rèn)為上述靶點(diǎn)占據(jù)相當(dāng)重要的位置。

3.4 PPI分析

圖4(a)為蛋白靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，將圖4(a)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析并進(jìn)行可視化處理，結(jié)果如圖4(b)所示。根據(jù)Network Analyzer插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)果中共獲得31個(gè)節(jié)點(diǎn)和176條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為11.4，聚類相關(guān)性系數(shù)(clustering coefficient)為0.689，相鄰節(jié)點(diǎn)的平均數(shù)目為11.733，說(shuō)明基因彼此之間存在相互作用，它們協(xié)同起效，關(guān)系十分密切，驗(yàn)證了雷公藤中的藥效化合物與肝癌疾病兩者的重疊基因具有密切的關(guān)聯(lián)性。我們以度值大于2倍平均度值為標(biāo)準(zhǔn)篩選核心靶標(biāo)蛋白，可以看出JUN、STAT3、PTGS2、ESR1、FOS、CXCL8、ICAM1、CDKN1A、AR、TGFB1在其中的作用程度較大，因此，我們認(rèn)為有必要進(jìn)一步探討此類基因的分子功能和通路富集情況。

藍(lán)色表示已確定的藥物蛋白靶點(diǎn)，黃色、綠色、粉色分別表示GeneCards、OMIM、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的肝癌靶點(diǎn)，數(shù)字表示交集數(shù)據(jù)庫(kù)所共有的蛋白靶點(diǎn)數(shù)量。圖1 雷公藤的抗癌靶點(diǎn)Fig.1 Anti-cancer targets of Tripterygium wilfordii

圖2 GSE33006樣本的火山圖Fig.2 Volcano plot for sample GSE33006

紅色菱形表示藥效成分；綠色圓形表示蛋白靶點(diǎn)，其大小代表重要程度。圖3 雷公藤(TWHF)藥效成分與肝癌靶點(diǎn)的C-T網(wǎng)絡(luò)映射Fig.3 C-T network mapping of the active ingredients of Tripterygium wilfordii (TWHF) and liver cancer targets

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析Fig.4 Protein interaction network analysis

3.5 代謝通路富集結(jié)果分析

進(jìn)一步對(duì)靶點(diǎn)在生物功能中的富集關(guān)系進(jìn)行分析，以獲得靶點(diǎn)在生物集群中的協(xié)同作用。我們對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行了GO富集分類和分子注釋，同時(shí)也獲得Pathway分析，將P<0.05的結(jié)果由小到大排序，取排名前20位的結(jié)果，如圖5所示，其中，氣泡大小代表基因數(shù)目的多少，氣泡顏色由紅色至綠色表示P值由小到大。從富集結(jié)果可以看出，靶點(diǎn)基因主要富集在催化酶結(jié)合、血紅素結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合、配體激活的序列特異性DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合、細(xì)胞周期蛋白結(jié)合、氧化還原酶活性、蛋白質(zhì)異二聚活性等分子功能上，這些基因主要參與細(xì)胞增殖的正負(fù)調(diào)控、有絲分裂細(xì)胞周期的陽(yáng)性調(diào)控、血管生成的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞的氧化應(yīng)激以及基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控等生物過(guò)程，體現(xiàn)出雷公藤是通過(guò)多種分子功能調(diào)控生物過(guò)程而共同實(shí)現(xiàn)抗肝癌效果的。圖6列出了排名前20位的信號(hào)通路，包括HIF-1、TNF以及調(diào)控細(xì)胞周期、乙型肝炎等信號(hào)通路，說(shuō)明雷公藤通過(guò)靶向基因?qū)Χ鄺l通路產(chǎn)生影響而發(fā)揮抗肝癌作用。

圖5 GO富集分析氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of GO enrichment analysis

圖6 KEGG富集通路分析氣泡圖Fig.6 Bubble diagram of KEGG enrichment pathway analysis

肝癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程是一個(gè)受多基因、多途徑調(diào)控的過(guò)程，癌細(xì)胞的增殖失控和凋亡機(jī)制失活，是導(dǎo)致肝癌發(fā)展的主要因素[12]。因此，抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是肝癌治療的主要目標(biāo)之一。另外也有研究表明，乙型肝炎病毒是肝癌的主要危險(xiǎn)因素[13]。這些研究結(jié)果與我們的數(shù)據(jù)分析結(jié)果不謀而合，表明本文的工作具有研究?jī)r(jià)值和借鑒意義。

3.6 分子對(duì)接驗(yàn)證分析

綜合上述C-T網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出的靶點(diǎn)集合，選取其中富集排名在前5位的KEGG信號(hào)通路上的蛋白，確定了PTGS2、TGFB1、CXCL8、STAT3、CDKN1A、FOS、JUN這7種蛋白為核心靶點(diǎn)。

有研究表明，山奈酚、β-谷甾醇和槲皮素在不同的藥物篩選中經(jīng)常作為活性成分出現(xiàn)[14]，因此我們認(rèn)為它們?cè)诒疚闹袥](méi)有較大的研究意義。本文最終確定對(duì)雷公藤中的特有成分雷公藤甲素和雷公藤紅素這兩種關(guān)鍵藥效物質(zhì)與核心抗癌靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接驗(yàn)證。

通常，結(jié)合能<-17.78 kJ/mol可認(rèn)為配體與受體之間具有結(jié)合活性，結(jié)合能<-20.92 kJ/mol則認(rèn)為結(jié)合活性較高，結(jié)合能<-29.29 kJ/mol可認(rèn)為配體與受體之間具有強(qiáng)烈的對(duì)接活性[15]。對(duì)接結(jié)果如表2所示，由表2可知，雷公藤甲素、雷公藤紅素與所選核心靶點(diǎn)的結(jié)合能均小于-17.78 kJ/mol，表明它們與靶點(diǎn)具有結(jié)合活性。雷公藤甲素與PTGS2以及雷公藤紅素與PTGS2、CXCL8、STAT3的結(jié)合能均小于-29.29 kJ/mol，表明它們之間有著很強(qiáng)的結(jié)合活性。對(duì)其進(jìn)行對(duì)接模式分析，如圖7所示。由結(jié)果可知，雷公藤甲素與PTGS2在CYS-36、CYS-47和ARG-44處形成氫鍵。雷公藤紅素與PTGS2在LYS-532、GLN-372、LYS-369和SER-121處形成氫鍵，與CXCL8在LYS-11和ARG-26處形成氫鍵，與STAT3在PRO-333和ARG-325處形成氫鍵。

圖7 雷公藤甲素、雷公藤紅素與核心抗癌靶點(diǎn)的對(duì)接模式分析Fig.7 Analysis of the docking mode of triptolide and celastrol with core anti-cancer targets

表2 雷公藤甲素、雷公藤紅素與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能Table 2 Binding energies of triptolide and celastrol tothe core targets

3.7 雷公藤對(duì)蛋白表達(dá)的影響

由于高濃度的雷公藤甲素和雷公藤紅素表現(xiàn)出細(xì)胞毒性且伴隨毒副作用，所以本文選擇相對(duì)低的藥物濃度梯度(0.5、1、1.5 μmol/L)，以探究對(duì)癌細(xì)胞增殖的影響。Western Blot原始條帶結(jié)果見(jiàn)圖8，可以看出，隨著雷公藤甲素和雷公藤紅素濃度的升高，STAT3和PTGS2蛋白的表達(dá)量減少，說(shuō)明雷公藤甲素和雷公藤紅素可以抑制STAT3和PTGS2蛋白的表達(dá)，并且抑制作用具有劑量依賴性。

圖8 雷公藤甲素和雷公藤紅素對(duì)蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effect of triptolide and celastrol on the expression of various proteins

前列腺素(PG)是由炎癥誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激關(guān)鍵酶PTGS2催化合成的重要炎癥介質(zhì)，具有抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制免疫監(jiān)視、促進(jìn)血管生成等作用，體內(nèi)外研究均表明PTGS2的特異性抑制劑可以抑制肝癌[16]。STAT3是JAK2/STAT3信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控基因，其在信號(hào)通路中的表達(dá)與肝細(xì)胞癌的發(fā)生關(guān)系密切[17]。單獨(dú)或協(xié)同其他化療藥物使用的雷公藤紅素可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，防止癌細(xì)胞的擴(kuò)散和侵襲，通過(guò)STAT3信號(hào)通路[18]，抑制下游基因如cyclin D1、Bcl-2、Bcl-xL、survivin、Mcl-1、VEGF等，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡，從而抑制血管生成并促使細(xì)胞凋亡。

4 結(jié)論

本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法并結(jié)合分子對(duì)接模擬，對(duì)雷公藤抗肝癌的藥效物質(zhì)及其生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行探討。通過(guò)對(duì)雷公藤成分中的多種化合物數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選和富集分析，篩選出雷公藤甲素和雷公藤紅素為雷公藤抗肝癌的關(guān)鍵藥效成分。通過(guò)對(duì)靶點(diǎn)的功能富集以及配體與受體之間的結(jié)合能分析，得出雷公藤作用于肝癌的核心靶點(diǎn)蛋白為STAT3、PTGS2、CXCL8。分子對(duì)接的結(jié)果顯示，雷公藤甲素與PTGS2以及雷公藤紅素與PTGS2、CXCL8、STAT3有著很強(qiáng)的結(jié)合活性。生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雷公藤甲素和雷公藤紅素均可以抑制PTGS2和STAT3蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果表明，雷公藤可能作用于這些靶點(diǎn)，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡，發(fā)揮抗炎癥、調(diào)節(jié)免疫的作用，從而抑制肝癌的惡化。

本研究?jī)H是依靠數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的理論分析和初步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，故存在一定的局限性，后續(xù)還需其他實(shí)驗(yàn)(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn))進(jìn)一步驗(yàn)證才具有更為科學(xué)可靠的說(shuō)服力。但是，從整體的分析層面上講，本研究為雷公藤抗肝癌的作用機(jī)制及相關(guān)藥物的開(kāi)發(fā)提供了新思路。