張秀萍，郎 平，姜 云,2*，羅慧麗，趙愛云，陳宏偉 ，齊 萌*

(1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第二師畜牧獸醫(yī)工作站，新疆鐵門關(guān) 841023)

溫氏支原體(Mycoplasmawenyonii)是引起牛嗜血支原體病的主要病原之一，多引起牛貧血、黃疸、發(fā)熱和消瘦等癥狀，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成一定的危害[1]。由M.wenyonii引起的奶牛嗜血支原體病各季節(jié)均有發(fā)生，可導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量下降、生長發(fā)育受阻、飼料報(bào)酬降低、繁殖力降低等多樣致病特征[1-3]。世界范圍內(nèi)，奶牛M.wenyonii的感染較為普遍。Ybanez等[4]對(duì)菲律賓某規(guī)?；瘓龅?0頭奶牛進(jìn)行M.wenyonii檢測，發(fā)現(xiàn)感染率為80.0%(32/40)。在我國，閆振貴等[5]對(duì)魯西南地區(qū)規(guī)?；瘓龅哪膛＿M(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)不同調(diào)查點(diǎn)奶牛M.wenyonii感染率為50.5%(53/105)～64.3%(90/140)。加強(qiáng)對(duì)奶牛M.wenyonii的檢查和監(jiān)測有助于保障奶牛業(yè)的健康發(fā)展。

M.wenyonii主要寄生于牛紅細(xì)胞表面，無細(xì)胞壁、無明顯細(xì)胞核和細(xì)胞器，根據(jù)形態(tài)結(jié)構(gòu)特征和分子生物學(xué)數(shù)據(jù)，將其歸為支原體[6-7]。在臨床生產(chǎn)中，常采用血液涂片鏡檢法檢查M.wenyonii，然而該病原體與經(jīng)蜱傳播的寄生于紅細(xì)胞內(nèi)的梨形蟲(Piroplasma)和無漿體(Anaplasmaspp.)等其他病原體形態(tài)相近，缺乏明顯的鑒別特征，需要經(jīng)驗(yàn)十分豐富的研究人員才能予以鑒別；同時(shí)此類經(jīng)媒介昆蟲傳播的病原體常常存在混合感染，如近年在波黑地區(qū)的調(diào)查顯示，牛同時(shí)感染M.wenyonii和分歧巴貝斯蟲(Babesiadivergens)，顯微鏡觀察很難區(qū)分；故而常規(guī)依靠顯微鏡觀察不能準(zhǔn)確鑒定上述病原體[8-9]。此外，受到細(xì)胞變形、異染顆粒等因素干擾，有些報(bào)道將此類非病理性形態(tài)變化的細(xì)胞也鑒定為M.wenyonii，造成較高的假陽性率[9]?；诜肿由飳W(xué)方法的檢測，可有效鑒別M.wenyonii和其他形態(tài)相近的病原體，并可進(jìn)行序列和種系發(fā)育分析，更適于開展流行病學(xué)調(diào)查研究[2,4]。

目前，有關(guān)新疆阿克蘇地區(qū)奶牛溫氏支原體病的流行情況調(diào)查報(bào)道尚較少，為了解新疆阿克蘇地區(qū)某場奶牛M.wenyonii感染情況，采用血液涂片鏡檢法和PCR法對(duì)該場奶牛血液樣本進(jìn)行檢測，以期為新疆地區(qū)奶牛溫氏支原體病的診斷提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 血液基因組DNA提取試劑盒，上海萊楓生物科技有限公司產(chǎn)品；2×EasyTaqPCR SuperMix(+dye)，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 CX31RTSF型光學(xué)顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品；Sorvall Legend Micro 17型微量離心機(jī)，Thermo Scientific公司產(chǎn)品；MC proS型梯度PCR儀，Eppendorf公司產(chǎn)品；DYY-7C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、JY系列電泳槽，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集 2019年7月，隨機(jī)選取新疆阿克蘇地區(qū)某場1歲～2歲臨床健康的奶牛12頭，采用5 mL的EDTA抗凝管經(jīng)頸靜脈采集其血液樣本，依次編號(hào)為1號(hào)～12號(hào)，現(xiàn)場制作血液涂片，自然干燥后滴加1滴～2滴無水甲醇；已編號(hào)的血液樣本置裝有冰袋的泡沫箱中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室置4℃保存，72 h內(nèi)提取全基因組DNA。

1.2.2 顯微鏡觀察 12份牛血液涂片經(jīng)瑞氏染液染色后，置于普通光學(xué)顯微鏡油鏡下進(jìn)行觀察，若觀察到紅細(xì)胞表面附著點(diǎn)狀、逗點(diǎn)狀藍(lán)紫色顆粒，或紅細(xì)胞呈棘形或星芒狀，則判斷為疑似M.wenyonii陽性或其他病原體陽性。

1.2.3 DNA提取 12份?？鼓簶颖久糠萦靡埔簶屛?00 μL，按照血液基因組DNA提取試劑盒的說明書操作步驟提取100 μL全基因組DNA，置-20℃冰箱中保存。

1.2.4 PCR檢測 參照文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)M.wenyoniiSSU rRNA基因特異性引物進(jìn)行套式PCR檢測，兩輪反應(yīng)程序均為94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。為進(jìn)一步對(duì)M.wenyonii進(jìn)行鑒別診斷，參照文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)梨形蟲SSU rRNA基因通用引物進(jìn)行PCR檢測，反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。參照文獻(xiàn)[9]設(shè)計(jì)無漿體SSU rRNA基因通用引物進(jìn)行PCR檢測，反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。引物序列和目的片段見表1，引物由蘇州金維智生物科技有限公司合成。

表1 引物序列和目的片段

PCR反應(yīng)體系均為25 μL：2×EasyTaqPCR SuperMix(+dye)12.5 μL，20 μmol/L的上、下游引物各0.3 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 10.9 μL。每次PCR擴(kuò)增過程中均設(shè)陽性對(duì)照樣本和陰性對(duì)照樣本(同等體積雙蒸水)。陽性對(duì)照樣本分別為牛的M.wenyonii、牛的環(huán)形泰勒蟲(Theileriaannulata)和綿羊的牛無漿體(Anaplasmabovis)，由塔里木大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)室鑒定保存。擴(kuò)增結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。

1.2.5M.wenyoniiSSU rRNA基因序列分析 擴(kuò)增出的M.wenyonii陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測序，送蘇州金維智生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序。對(duì)成功獲得的序列，NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性搜索，應(yīng)用Clustal X 2.11軟件對(duì)所獲得的序列進(jìn)行比對(duì)分析，鑒定M.wenyonii。在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載嗜血支原體常見種類的序列，采用Mega 7.0軟件，選擇最大似然法(Maximum likelihood，ML)中General Time Reversible模型，構(gòu)建種系發(fā)育進(jìn)化樹，評(píng)價(jià)M.wenyonii遺傳進(jìn)化關(guān)系；發(fā)育進(jìn)化樹可靠性用Bootstrap分析檢測，進(jìn)行1 000個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡下觀察結(jié)果

12份血液涂片經(jīng)瑞氏染色后，鏡檢發(fā)現(xiàn)有1份樣本中部分紅細(xì)胞表面有明顯點(diǎn)狀和不規(guī)則狀紫色病原體(圖1)，初步鑒定疑似為M.wenyonii；其他11份樣本中未見紅細(xì)胞存在明顯的形態(tài)異常。

圖1 血液樣本經(jīng)瑞氏染色后的鏡檢結(jié)果(1 000×)

2.2 PCR檢測結(jié)果

分別基于M.wenyoniiSSU rRNA基因位點(diǎn)、梨形蟲SSU rRNA基因位點(diǎn)和無漿體SSU rRNA基因位點(diǎn)，對(duì)12份奶牛血液DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。12份樣本中，有3份樣品擴(kuò)增出M.wenyonii目的片段(圖2)，陽性率為25.0%(3/12)，其中，鏡檢呈病原體陽性的1份樣本擴(kuò)增出M.wenyonii目的片段；未擴(kuò)增出梨形蟲和無漿體的目的片段。

2.3 M.wenyonii SSU rRNA基因序列分析

對(duì)3個(gè)M.wenyonii陽性樣本的序列進(jìn)行比對(duì)，3條序列無核苷酸差異，序列一致；在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索，均與NCBI數(shù)據(jù)庫中M.wenyonii分離株序列(序列登錄號(hào)：FJ375309和MF666879)的同源性為100%，鑒定本研究中檢測到的病原體為M.wenyonii。構(gòu)建種系發(fā)育進(jìn)化樹，分析結(jié)果顯示，本研究中的3條M.wenyonii序列與我國牛的M.wenyonii分離株(FJ375309、AY769937、EF221880)、墨西哥牛的M.wenyonii分離株(KX171205)、澳大利亞牛的M.wenyonii分離株(KY412804)和日本牛的M.wenyonii分離株(EU367963)等處于同一個(gè)進(jìn)化分支上，而與豬嗜血支原體(Mycoplasmasuis)、貓嗜血支原體(Mycoplasmahaemofelis)和犬嗜血支原體(Mycoplasmahaemocanis)等其他種類的嗜血支原體處于不同分支上(圖3)。

采用最大似然法法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，節(jié)點(diǎn)數(shù)字分別表示自展值;黑色三角形代表本研究獲得的序列

3 討論

近年來，牛的嗜血支原體病在我國廣泛流行，常用的檢測方法主要是染色鏡檢法和PCR法。基層養(yǎng)殖業(yè)的技術(shù)工作人員多采用染色鏡檢法檢測和診斷牛的嗜血支原體病，以出現(xiàn)變形紅細(xì)胞、棘形紅細(xì)胞和六芒星狀紅細(xì)胞為主要的判定陽性依據(jù)[5,12]，但引起紅細(xì)胞變形的因素比較多，如溶血、染色液的選擇、染色顆粒、血涂片厚度等，造成較高的假陽性；同時(shí)，M.wenyonii不易與其他血液類病原如梨形蟲、無漿體等進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒別[13]。本研究結(jié)合染色鏡檢法和分子生物學(xué)方法，對(duì)新疆阿克蘇地區(qū)某場奶牛進(jìn)行M.wenyonii檢測，發(fā)現(xiàn)PCR敏感性和特異性均較好，可避免主觀判斷因素影響，也可與其他病原體進(jìn)行鑒別診斷和混合感染診斷，準(zhǔn)確性高。因此，在開展牛嗜血支原體病流行病學(xué)調(diào)查時(shí)，應(yīng)在染色鏡檢法檢測的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展分子生物學(xué)方法檢測和序列分析，以準(zhǔn)確鑒定牛的M.wenyonii。

本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，新疆阿克蘇地區(qū)某奶牛場存在M.wenyonii感染，PCR法檢測陽性率為25.0%(3/12)。在我國魯西南地區(qū)的調(diào)查顯示，奶牛M.wenyonii感染較為普遍，PCR法檢測不同采樣點(diǎn)奶牛場的M.wenyonii陽性率均在50%以上，多數(shù)為隱性感染[3]。在重慶的調(diào)查顯示，PCR法檢測牛M.wenyonii的陽性率為11.1%(34/307)[13]。我國不同地區(qū)牛的感染情況存在一定差異，可能與地理環(huán)境、養(yǎng)殖條件、媒介種類等因素存在密切關(guān)系。本研究中，采集的血液樣本數(shù)量較少，進(jìn)一步的研究將深入開展新疆不同地區(qū)、不同季節(jié)和不同養(yǎng)殖條件下牛M.wenyonii的感染情況調(diào)查。

目前，尚無特效藥物可治療牛的溫氏支原體病。貝尼爾(血蟲凈)、尼可蘇、頭孢多烯、多西環(huán)素和磺胺嘧啶鈉等藥物對(duì)牛溫氏支原體病具有一定的治療效果，應(yīng)在發(fā)病初期使用，同時(shí)配合使用常規(guī)抗菌藥物，防止其他細(xì)菌繼發(fā)感染[9,14]。奶牛溫氏支原體病感染途徑尚不明確，一般認(rèn)為是經(jīng)吸血昆蟲和注射器針頭等器具進(jìn)行機(jī)械傳播，且與飼養(yǎng)條件、免疫狀況和營養(yǎng)缺乏等因素有關(guān)，防控該病應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和消毒，注意環(huán)境和器具衛(wèi)生，在吸血昆蟲活躍的季節(jié)進(jìn)行滅殺，采用貝尼爾等藥物進(jìn)行預(yù)防性用藥。