艾力·艾爾肯，李巴侖，張夢(mèng)菲，譚 寧，寇 正，張慧敏，吳筱潔，孫亞東，華進(jìn)聯(lián)*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)中心，陜西楊凌 721000；2.遼寧生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110000)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，在抗炎、免疫調(diào)節(jié)及組織器官再生方面有重要作用[1-4]。MSCs能夠合成分泌多種生長(zhǎng)因子及營(yíng)養(yǎng)因子，并可通過旁分泌效應(yīng)促進(jìn)其周圍的受損細(xì)胞及組織修復(fù)[5]。已發(fā)現(xiàn)的MSCs細(xì)胞因子包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(SCF)、血管生成素(Ang)、表皮調(diào)節(jié)素(epidermin)、內(nèi)皮素(endothelin)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(BF-GF)及抗凋亡因子如半乳糖凝集素3(galectin-3)和分泌型卷曲相關(guān)蛋白[6-10]。MSCs上清液可以促進(jìn)相應(yīng)細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，還可促進(jìn)人真皮成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，進(jìn)而加速創(chuàng)面的愈合[11-12]。這與MSCs上清液中所含有的各種抗凋亡因子、營(yíng)養(yǎng)因子、生長(zhǎng)因子和其旁分泌作用存在密切的聯(lián)系。水凝膠是一種穩(wěn)定的親水性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，通過物理、化學(xué)以及生物酶法交聯(lián)而成，具有良好的生物相容性、可降解性和保水性，在臨床醫(yī)學(xué)中顯現(xiàn)出較大的應(yīng)用潛力。從干細(xì)胞上清液功能開發(fā)、水凝膠材料選擇以及傷口修復(fù)機(jī)制等方面進(jìn)行深入探索，將有望使干細(xì)胞上清液的水凝膠用于臨床治療皮膚創(chuàng)傷，提高修復(fù)效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞由陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心儲(chǔ)存。

1.1.2 主要試劑 α-MEM培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品；Ultra GROTM(血清替代物)，上海創(chuàng)凌生物科技有限公司產(chǎn)品；TrypLE Express(胰酶替代物)，上海創(chuàng)凌生物科技有限公司產(chǎn)品；卡波姆-940，源葉生物公司產(chǎn)品，甘油，上海梯希愛公司產(chǎn)品；氫氧化鈉，上海梯希愛公司產(chǎn)品；Tween 80，上海梯希愛公司產(chǎn)品；尼泊金乙酯鈉鹽，上海梯希愛公司產(chǎn)品；三乙醇胺，上海梯希愛公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo scientific公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，北京亞太克隆公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡，尼康公司產(chǎn)品；冷凍干燥機(jī)，上海舜制儀器制造有限公司產(chǎn)品；-80度低溫冰箱，Haier公司產(chǎn)品；全自動(dòng)血常規(guī)分析儀，美國(guó)Bio Tec公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病例概況 2021年4月，寵頤生動(dòng)物醫(yī)院沈陽(yáng)佳緣分院接診1只黑田園犬，肱骨部有一塊約10 cm2皮膚缺失，表面黑硬，皮膚創(chuàng)緣整齊，內(nèi)部肌肉壞死，邊緣毛發(fā)粘連，有污濁物混合在一起(圖 1)。主訴幾天前被其他大犬咬傷，肱骨末端開放性骨折，主人選擇使用保守治療，將傷口縫合?？p合后第3天患犬出現(xiàn)組織壞死，感染及潰爛等癥狀，此時(shí)醫(yī)生未對(duì)患犬做其他檢查和處理。

1.2.2 檢查診斷 該犬為3月齡黑田園家犬，體重2.35 kg，體溫38.4℃，心跳呼吸正常，病犬精神狀態(tài)、食欲及排糞、排尿未見明顯異常。肱骨部位損傷嚴(yán)重，出現(xiàn)不同程度跛行，觸摸關(guān)節(jié)疼痛，結(jié)締組織增生伴隨炎癥反應(yīng)等癥狀，影響患犬正?；顒?dòng)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)室檢查 由前肢頭靜脈采血的方式采取病犬血液1 mL進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)。

1.2.4 間充質(zhì)干細(xì)胞凍干粉制備 間充質(zhì)干細(xì)胞上清液收集培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞至第2代至第5代；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度到80%～90%時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，無菌離心，上清液在-80℃凍存?zhèn)溆?；通過冷凍干燥機(jī)蒸發(fā)水分獲取干粉。最后制得凍干粉，稱重，錫紙包裹，登記，置-80℃保存。

1.2.5 凝膠劑的配制 稱取0.1 g卡波姆-940加入適量蒸餾水，充分溶解; 另取0.3 g阿昔洛韋加入到溶解好的基質(zhì)當(dāng)中，攪拌分散均勻; 之后加入20 g甘油、5 g乙醇、0.4 g氫氧化鈉、0.2 g Tween-80和0.2 g尼泊金乙酯鈉鹽，攪拌使其分散均勻; 將混合均勻的基質(zhì)加入三乙醇胺，調(diào)節(jié)pH至6～7后加蒸餾水至88.3 g，機(jī)械攪拌60 min使其充分混合均勻，4℃放置12 h，即得透明凝膠。

1.2.6 治療方法及預(yù)后 使用間充質(zhì)干細(xì)胞凍干粉注射液治療，肌肉注射(50 mg/kg)，每天1次，連用3 d。同時(shí)使用間充質(zhì)干細(xì)胞凝膠(10 g)涂抹在傷口上，連用1周。治療前后血常規(guī)各檢查一次。

2 結(jié)果

2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞凍干粉與凝膠對(duì)犬創(chuàng)面愈合效果觀察

治療第0天，組織壞死及潰爛；第1天，開始逐漸結(jié)痂，無液體滲出，創(chuàng)面變化明顯；第2天，創(chuàng)面無液體滲出，結(jié)痂，創(chuàng)面不平整；第3天，傷口開始縮痂，創(chuàng)面呈現(xiàn)暗紅色；第4天，傷口結(jié)痂部分脫落，疤痕面積變小；第6天，已完全掉痂，創(chuàng)面進(jìn)一步縮小，開始長(zhǎng)出毛發(fā)(圖1)。

2.2 犬血常規(guī)指標(biāo)的變化

由表1和表2可以看出，治療前犬的白細(xì)胞、紅細(xì)胞壓積及紅細(xì)胞數(shù)均顯著高于參考值，同時(shí)平均紅細(xì)胞體積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量及血小板數(shù)目水平顯著低于參考值。聯(lián)合使用間充質(zhì)干細(xì)胞凝膠和間充質(zhì)干細(xì)胞注射液治療第7天后犬的白細(xì)胞、紅細(xì)胞壓積及紅細(xì)胞數(shù)、平均紅細(xì)胞體積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量及血小板數(shù)均恢復(fù)至標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，結(jié)果表明，間充質(zhì)干細(xì)胞凍干粉促進(jìn)了病犬皮膚創(chuàng)傷愈合并改善了病犬各項(xiàng)生理指征。

表1 治療前后血常規(guī)檢查結(jié)果

D0.治療之前；D1.治療后第1天；D2.治療后第2天；D3.治療后第3天；D4.治療后第4天；D6.治療后第6天。

3 討論

皮膚是機(jī)體的重要屏障，然而隨著寵物飼養(yǎng)數(shù)量的增加，各種原因造成的皮膚缺損、難愈性創(chuàng)面及瘢痕的病例也在逐漸增加，給獸醫(yī)臨床治療帶來了很大的挑戰(zhàn)[11]。小動(dòng)物臨床上偶有因外傷或其它因素受傷，或因未能及時(shí)處理導(dǎo)致皮膚大面積缺損及壞死病例，自然愈合時(shí)間久，創(chuàng)口復(fù)發(fā)感染幾率大，現(xiàn)有治療手段少且缺乏高效的治療措施。皮膚移植法具有供體皮膚稀缺等不利因素。創(chuàng)面愈合主要的特征包括組織再生、創(chuàng)面再上皮化和創(chuàng)面血管的新生。組織再生缺乏干細(xì)胞、促愈合細(xì)胞因子以及血管生成減少，都能導(dǎo)致創(chuàng)面愈合困難。通過間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子來促進(jìn)創(chuàng)面的愈合及大面積軟組織損傷后的修復(fù)是一個(gè)全新思路。干細(xì)胞分泌因子能通過自分泌或旁分泌的方式改善受損部的微環(huán)境，促進(jìn)機(jī)體內(nèi)源性干細(xì)胞向受損部位的遷移并分化，拯救即將壞死的細(xì)胞，從而達(dá)到修復(fù)組織的目的[12-14]。它還是一種可以把被動(dòng)的機(jī)體自我修復(fù)轉(zhuǎn)換為主動(dòng)可控的外界治療手段[15]。經(jīng)過本病例犬的治療證明，間充質(zhì)干細(xì)胞凍干粉局部注射和間充質(zhì)干細(xì)胞凝膠涂抹對(duì)皮膚創(chuàng)傷炎癥有很好的抑制作用，同時(shí)能提高犬創(chuàng)面愈合率。由此可以看出，間充質(zhì)干細(xì)胞凍干粉與凝膠對(duì)皮膚愈合有良好的效果。