楊安強(qiáng)，楊曉濱，李江濤，吳和剛，王曉軍，劉松，范莉

宜賓市第一人民醫(yī)院1神經(jīng)外科，2中心實(shí)驗(yàn)室，3病理科，4麻醉科，四川 宜賓 644000

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，占顱內(nèi)腫瘤的20%～60%。世界衛(wèi)生組織（WHO）依其惡性程度分為4級(jí)：Ⅰ～Ⅱ級(jí)為低級(jí)別膠質(zhì)瘤，惡性程度較低；Ⅲ級(jí)為間變性膠質(zhì)瘤；Ⅳ級(jí)為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。Ⅲ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤均為高度惡性膠質(zhì)瘤，發(fā)病率為（5～8）/100 000，在35～55歲腫瘤患者死亡原因中居第四位，在≤34歲腫瘤患者死亡原因中居第二位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，膠質(zhì)瘤患者5年生存率為20%～30%，而膠質(zhì)母細(xì)胞瘤僅為1%。目前，外科手術(shù)、放療和化療仍是臨床上治療惡性膠質(zhì)瘤的主要手段，但一般預(yù)后較差。因此，從分子水平上研究膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制，對(duì)于預(yù)防和治療膠質(zhì)瘤具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（1ong noncoding RNA，lncRNA）是一類不能編碼蛋白質(zhì)的RNA，其轉(zhuǎn)錄副本超過(guò)200個(gè)核苷酸。長(zhǎng)鏈非編碼RNA的表達(dá)與神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)退行性和免疫性疾病、精神疾病、原發(fā)性腦腫瘤、神經(jīng)腫瘤等存在密切的聯(lián)系。Pvt1致癌基因（Pvt1 oncogene，PVT1）是由

PVT1

基因編碼的一個(gè)lncRNA，是一種轉(zhuǎn)錄激活子。研究發(fā)現(xiàn)，PVT1參與多種生理學(xué)和病理學(xué)過(guò)程，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展高度相關(guān)，在肝細(xì)胞肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎癌等多種腫瘤中高表達(dá)。此外，已經(jīng)得到公認(rèn)的是腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是其獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。然而，PVT1與膠質(zhì)瘤進(jìn)展中EMT過(guò)程的關(guān)系尚未有相關(guān)研究。因此，本研究擬通過(guò)研究PVT1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和EMT過(guò)程中的作用，完善膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的治療奠定實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)，提供全新的治療方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年1月至2020年1月宜賓市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科收治的40例膠質(zhì)瘤患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)中病理學(xué)檢查證實(shí)為原發(fā)性膠質(zhì)瘤；術(shù)前未接受過(guò)任何放化療及免疫治療；病歷資料完整；自愿簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并內(nèi)分泌系統(tǒng)疾?。话橛醒合到y(tǒng)腫瘤；其他系統(tǒng)腫瘤伴腦轉(zhuǎn)移。取40例膠質(zhì)瘤患者的膠質(zhì)瘤組織。腫瘤分級(jí)：Ⅰ級(jí)5例，Ⅱ級(jí)5例，Ⅲ級(jí)15例，Ⅳ級(jí)15例。另選取5例顱腦外傷后腦腫脹致腦疝形成后進(jìn)行顱內(nèi)減壓手術(shù)患者的正常腦組織標(biāo)本作為對(duì)照。所有標(biāo)本采集后，迅速置于液氮中速凍，隨即轉(zhuǎn)移至-80℃貯存。

1.2 主要材料

胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；Lipofectamine 2000和Trizol均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；抗 E-cadherin（ab1416）、抗 N-cadherin（ab76011）和抗Vimentin抗體（ab92547）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；總蛋白提取試劑盒和CCK-8試劑盒均購(gòu)自上海碧云天公司。siRNA-

PVT1

（正義鏈5'-UUAGUAUCCUGAAAUGUGC-3'，反義鏈 5'-GCACAUUUCAGGAUACUAA-3'）及其陰性對(duì)照

siNC

（正義鏈5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反義鏈 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'）均由上海吉瑪基因公司合成。正常腦組織細(xì)胞HEB，膠質(zhì)母細(xì)胞系U87MG、U251均購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37℃5%CO培養(yǎng)箱中。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction ，qRT-PCR）檢測(cè) 正常腦組織樣本和臨床膠質(zhì)瘤組織樣本經(jīng)液氮研磨后，加入Trizol提取組織樣本總RNA（細(xì)胞樣本直接加入Trizol，無(wú)需液氮研磨）。以提取的總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)cDNA。采用qRT-PCR試劑盒SYBR Green法步驟進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)周期。每個(gè)樣本重復(fù)3次，以

β-actin

基因作為內(nèi)參。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)運(yùn)用相對(duì)表達(dá)量2的方法進(jìn)行分析。

PVT1

引物序列為：5'-GGCCAGCCTTTAGAGAGGTC-3'和 5'-TCGGAAGGGCACACATTCAG-3'。1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將U87MG和U251細(xì)胞按照2×10/孔接種于6孔培養(yǎng)板，各分為兩組，分別轉(zhuǎn)染siNC和siRNA-

PVT1

。轉(zhuǎn)染48 h或72 h后，qRTPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，進(jìn)行后續(xù)研究。1.3.3 CCK- 8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性U87MG和U251細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后，分為siNC組和siRNA-

PVT1

組，將其分別接種于96孔板內(nèi)，5×10/孔，5%CO37 ℃培養(yǎng) 0、1、2、3天，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，加入10 μl CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h，然后在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)量各孔的光密度（optical density，OD）值，繪制細(xì)胞增殖活性曲線。1.3.4 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 取無(wú)血清培養(yǎng)基與BD基質(zhì)膠按照3∶1的比例混勻，每孔40 μl加入到Transwell小室的上室中，37℃5%CO培養(yǎng)箱中凝固1 h。取轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（siNC組和siRNA-

PVT1

組），無(wú)血清培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)，10個(gè)細(xì)胞加入Transwell小室上室，600 μl完全培養(yǎng)基加入到下室中。在37℃5%CO孵育48 h或72 h后，取出小室，擦去上室的細(xì)胞后置于4%多聚甲醛中固定15 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌1次，結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌1次，計(jì)數(shù)并拍照（10×10）穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量。1.3.5 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞（siNC組和siRNA-

PVT1

組），用蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白并測(cè)定其濃度，取30 μg總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），其參數(shù)為濃縮膠60 V電泳60 min，分離膠120 V電泳70 min；采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，參數(shù)為100 V，60 min。然后，5%BSA溶液中封閉60 min，隨后分別加入抗E-cadherin、抗N-cadherin、抗Vimentin抗體（1∶1000）和二抗[抗鼠或抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG），1∶5000]。超敏電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑A液和B液按體積1∶1混勻，加至水平放置的聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，移入暗室，取醫(yī)用X線片覆蓋，曝光1 min左右，依次進(jìn)行顯影、定影。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰密度的比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PVT 1表達(dá)水平的比較

與正常腦組織相比，隨著膠質(zhì)瘤分級(jí)的增加，

PVT1

表達(dá)水平逐漸升高（

P

＜0.05）（表1）。膠質(zhì)母細(xì)胞系U251和U87MG（相當(dāng)于WHOⅣ級(jí)）的

PVT1

表達(dá)水平均明顯高于正常HEB細(xì)胞系，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）（表2）。

表1 正常腦組織及不同腫瘤分級(jí)的膠質(zhì)瘤組織中PVT 1表達(dá)水平的比較（±s）

表2 HEB、 U87MG、 U251細(xì)胞系中PVT 1表達(dá)水平的比較（±s）

2.2 PVT 1對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞增殖的影響

培養(yǎng)2、3天后，siRNA-

PVT1

組U87MG和U251細(xì)胞OD值均低于siNC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。（表3）

表3 siNC組和siRNA-PVT1組 U87MG和 U251細(xì)胞中OD值的比較（±s）

2.3 PVT 1對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞侵襲的影響

與siNC組相比，siRNA-

PVT1

組U87MG和U251細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)量均減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。（圖1、表4）

圖1 Transwell檢測(cè)siNC組和siRNA-PVT 1組 U87MG和U251細(xì)胞的侵襲情況（結(jié)晶紫染色，×100）

表4 siNC組和siRNA-PVT 1組 U87MG和 U251細(xì)胞系的細(xì)胞侵襲數(shù)目比較（x± s）

2.4 PVT 1對(duì)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

siRNA-

PVT1

組U87MG和U251細(xì)胞系中E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于siNC組，N-cadherin和Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于siNC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。（圖2、表5）

圖2 Western blot檢測(cè)siNC組和siRNA-PVT 1組 U87MG和U251細(xì)胞系中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)情況

表5 siNC組和siRNA-PVT 1組 U87MG和 U251細(xì)胞系中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

3 討論

在成年原發(fā)性腦腫瘤患者中，膠質(zhì)瘤的惡性程度最高，預(yù)后最差，特別是Ⅲ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤。在膠質(zhì)瘤的進(jìn)展中，lncRNA扮演著重要的角色。lncRNA與膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制、轉(zhuǎn)移性、侵襲性及預(yù)后情況等均存在一定的關(guān)系，其相互關(guān)聯(lián)性已成為近年來(lái)膠質(zhì)瘤研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。比如，多個(gè)與免疫相關(guān) 的lncRNA （AC046143.1、AC021054.1、AC080112.1、MIR222HG和PRKCQ-AS1）與患者的生存能力密切相關(guān)，可以用作膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后的潛在指標(biāo)和潛在治療方法。PVT1在膠質(zhì)瘤中的作用本課題組早已關(guān)注。先前的研究發(fā)現(xiàn)，PVT1通過(guò)調(diào)控

Zeste

基因增強(qiáng)子同源物2（enhancer of Zeste homolog 2，EZH2）表達(dá)水平來(lái)調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖、遷移和侵襲能力，最終影響膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。臨床組織樣本的研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤的惡性程度越高，PVT1的表達(dá)水平越高，高水平的PVT1可能促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)程。那么，PVT1是否參與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的EMT過(guò)程呢？EMT可使上皮細(xì)胞失去極性，成為具有活動(dòng)能力、能在細(xì)胞基質(zhì)自由移動(dòng)的間質(zhì)細(xì)胞。EMT發(fā)生時(shí)，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin、α-catenin、β-catenin、黏蛋白等表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)表型標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin、基質(zhì)金屬蛋白酶等表達(dá)上調(diào)。其中，

E-cadherin

的缺失是EMT最重要的標(biāo)志性變化，伴隨著腫瘤細(xì)胞間的黏附減弱和腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)。因此，EMT發(fā)生后腫瘤細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)。膠質(zhì)瘤作為神經(jīng)上皮細(xì)胞來(lái)源的腫瘤，Ⅲ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤不僅具有較強(qiáng)的增殖潛能，極易形成大的腫塊，而且具備超強(qiáng)的侵襲性生長(zhǎng)的特點(diǎn)，能夠持續(xù)侵犯正常腦組織。通過(guò)siRNA

PVT1

細(xì)胞轉(zhuǎn)染，沉默U87MG和U251細(xì)胞中

PVT1

水平發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖活性和侵襲能力顯著下降，而Western blot檢測(cè)顯示EMT上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin升高，間質(zhì)表型標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin下調(diào)，EMT過(guò)程受到明顯抑制。因此，本研究推測(cè)PVT1參與了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的EMT過(guò)程，進(jìn)而調(diào)控了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲，但其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

綜上所述，lncRNA PVT1在膠質(zhì)瘤中異常高表達(dá)，其表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤惡性程度有關(guān)；PVT1可能通過(guò)調(diào)節(jié)EMT過(guò)程進(jìn)而影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力；推測(cè)PVT1-EMT-侵襲調(diào)控過(guò)程可能為膠質(zhì)瘤的基因療法提供了一個(gè)新方向和思路。