陳超，孫建飛，魏海梁，馮冠強(qiáng)

1陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712000

2陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，陜西 咸陽 712000

目前，結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是第二大可導(dǎo)致腫瘤相關(guān)性死亡的疾病，其易轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后的特點(diǎn)，不斷地為臨床工作帶來挑戰(zhàn)?；|(zhì)細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展和治療反應(yīng)中具有重要意義。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblast，CAF）是腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中最活躍的組成部分，可通過分泌各種趨化因子和細(xì)胞因子與腫瘤細(xì)胞相互作用促進(jìn)腫瘤血管生成、細(xì)胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移。同時，許多 miRNA（miRNA-1246、miRNA-21、miRNA-329、miRNA-181a、miRNA-199a、miRNA-92a-3p、miRNA-17-5p和miRNA-24-3p等）組成的新型外泌體信號增強(qiáng)了CAF與腫瘤間的信息交流。外泌體miRNA通過靶向抑制目的基因在結(jié)直腸癌的增殖、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移、干性、細(xì)胞耐藥中發(fā)揮重要作用。因此對于CAF來源外泌體miRNA在此過程中扮演的角色越來越受到人們的關(guān)注。本文就CAF外泌體miRNA在TME中對CRC的影響作一綜述，以期為深入探究CAF在CRC中的作用提供新的線索。

1 CAF與CRC

1.1 CAF

成纖維細(xì)胞是結(jié)締組織最常見的成分，是腫瘤中CAF的主要來源之一。一般狀況下，它們處于靜止期，在有絲分裂中是無活性的，直到它們響應(yīng)組織損傷或?qū)Σ煌愋偷膲毫r，成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化為激活狀態(tài)。腫瘤可以比喻為“無法愈合的傷口”，腫瘤基質(zhì)細(xì)胞的重建過程與傷口愈合有一些共同的相似之處。在腫瘤發(fā)生過程中，常駐成纖維細(xì)胞被腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞的信號激活，由此被稱為CAF。這些信號分子包括CAF激活劑轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）配體（如血小板衍生生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子和表皮生長因子）以及促炎分子[如白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6]，它們通過核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）激活駐留的成纖維細(xì)胞。另外，環(huán)境應(yīng)激[如反應(yīng)性氧物質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）剛度等]和化療或放療引起的DNA損傷可通過JAK-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transduction and activator of transcription，STAT）途徑激活CAF。而活化的CAF常特異性表達(dá)平滑肌肌動蛋白（a smooth muscle actin，a-SMA）、成纖維細(xì)胞活化蛋白-α（fibroblast activation protein-α，F(xiàn)AP-α）、成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1（fibroblast specific protein-1，F(xiàn)SP-1）或血小板源性生長因子受體-β（platelet-derived growth facter receptor-β，PDGFR-β）等標(biāo)志分子。

1.2 CAF與CRC

研究發(fā)現(xiàn)CAF活化是ECM蛋白質(zhì)合成和分泌的一個關(guān)鍵事件，導(dǎo)致ECM重塑和增加腫瘤細(xì)胞的侵入性。CAF和腫瘤細(xì)胞之間是通過復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)的，每種細(xì)胞類型通過協(xié)同或拮抗的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)軸相互影響。大量體外和體內(nèi)研究已揭示CAF可通過生長因子、趨化因子、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1等腫瘤相關(guān)因子的釋放和ECM重塑影響CRC的進(jìn)展。此外盡管miRNA表達(dá)及功能對CAF和腫瘤細(xì)胞之間相互作用的影響尚未完全闡明，但有關(guān)證據(jù)表明，源自CAF的外泌體中的miRNA失調(diào)通過多種機(jī)制影響腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移和治療抵抗，最終調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)程。

2 外泌體miRNA

外泌體是脂質(zhì)雙層形成的40～100 nm的細(xì)胞外囊泡，參與各種生理和病理過程。它們可以在細(xì)胞之間穿梭以促進(jìn)細(xì)胞間的通訊，在腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且可通過修飾受體腫瘤細(xì)胞中的基因表達(dá)來增強(qiáng)化學(xué)抗性和放射抗性。研究已經(jīng)表明，外泌體能夠承載多種類型的分子以促進(jìn)細(xì)胞間通訊，如miRNA、mRNA、長鏈非編碼RNA、DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。

miRNA是由外泌體遞送的重要貨物。miRNA通常由19～25個小型單鏈非編碼RNA組成，可以調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄后沉默。miRNA基因轉(zhuǎn)錄后，會產(chǎn)生一個稱為pre-miRNA的小發(fā)夾狀RNA。pre-miRNA被輸出到細(xì)胞質(zhì)后被RNA酶Ⅲ型內(nèi)切核酸酶處理，隨后釋放小RNA雙鏈體。加載到AGO蛋白上并形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）后，RNA雙鏈體將解開。一旦與RISC結(jié)合，miRNA將與mRNA互補(bǔ)配對。根據(jù)miRNA和mRNA是否完全結(jié)合，會發(fā)生兩種不同的機(jī)制：①如果miRNA與mRNA足夠互補(bǔ)，則mRNA會裂解。②當(dāng)miRNA與mRNA有不充分互補(bǔ)則翻譯被抑制。因此，miRNA可以調(diào)節(jié)各種生理和病理活動。

3 外泌體miRNA與CRC發(fā)展的關(guān)系

CRC是一種異質(zhì)性疾病，各種信號通路在其進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。TME中的外泌體miRNA被認(rèn)為是惡性轉(zhuǎn)化的誘因。外泌體miRNA作為介導(dǎo)腫瘤進(jìn)展和抑制的細(xì)胞間信號分子，可以針對腫瘤進(jìn)展中涉及的通路成分，最顯著的是

APC

、

KRAS

和

p53

，它們可以作為CRC中的致癌基因或抑癌基因。已有證據(jù)表明，CAF外泌體含有的miRNA可以影響腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移、凋亡、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)移。因此，放松miRNA管制會影響腫瘤的生長。

3.1 外泌體miRNA促進(jìn)CRC增殖及相關(guān)血管生成

腫瘤細(xì)胞的增殖是腫瘤進(jìn)展中最重要和最基本的步驟。除了如前所述的各種細(xì)胞因子或趨化因子，外泌體miRNA生長抑制相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白在腫瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控中發(fā)揮重要角色。

CCNG2

是負(fù)責(zé)編碼與生長抑制相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白G2（cyclin G2，CycG2）的基因，CycG2的下調(diào)可導(dǎo)致多種腫瘤的生長增強(qiáng)。因此，CCNG2的下調(diào)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞在G/G期的比例降低。而CAF外泌體miRNA-1246可靶向抑制CCNG2表達(dá)來介導(dǎo)CRC的惡性進(jìn)展。并且CAF外泌體通過TGF-β信號通路促進(jìn)CRC進(jìn)展。例如，CAF外泌體miRNA-17-5p直接靶向RUNX家族轉(zhuǎn)錄因子3（RUNX family transcription factor 3，RUNX3）。RUNX3與原癌基因

MYC

相互作用并與TGF-β1的啟動子結(jié)合，從而激活了TGF-β信號通路。RUNX3/MYC/TGF-β1通路刺激 TGF-β1釋放活化的CAF分泌更多的miRNA-17-5p，從而導(dǎo)致CAF大量激活，促進(jìn)CRC增殖、化學(xué)抗性和轉(zhuǎn)移。

同樣，血管生成是滿足實(shí)體瘤生長所需營養(yǎng)的關(guān)鍵過程。血管生成對應(yīng)于主要血管網(wǎng)絡(luò)的萌芽、重塑和擴(kuò)張，由原有血管形成新血管。腫瘤細(xì)胞會在周圍環(huán)境中產(chǎn)生并分泌因子，從而促進(jìn)新血管的生長，該過程受到包括血管內(nèi)皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子和TGF-β在內(nèi)的幾種生長因子的嚴(yán)格調(diào)控。在這些生長因子中，TGF-β是一種多功能的細(xì)胞因子，可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell，EC）（血管的主要成分）的兩種不同的Ⅰ型受體，即激活素受體樣激酶（activin receptor-like kinase，ALK）1和ALK5之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體內(nèi)平衡。ALK1是內(nèi)皮細(xì)胞限制性TGF-βⅠ型受體，可誘導(dǎo)SMAD1/5/8磷酸化增強(qiáng)血管生成。而ALK5可以促進(jìn)SMAD2/3的磷酸化，并抑制EC的增殖、遷移和血管形成。SMAD1/5/8信號和SMAD2/3信號之間的激活比例最終決定了EC是否開始增殖或保持靜止。miRNA-1246直接靶向PML（ALK1-SMAD2/3信號的調(diào)節(jié)劑），從而抑制SMAD2/3信號，這種信號的失活導(dǎo)致SMAD1/5/8信號的相對激活，從而促進(jìn)血管生成。

3.2 外泌體miRNA促進(jìn)CRC遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移

在大多數(shù)CRC患者中腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處器官的擴(kuò)散，往往預(yù)示著不良的生存期。miRNA-21具有對若干腫瘤類型的致癌效應(yīng)已被廣泛接受，其最充分的描述是與腫瘤抑制因子磷酸酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）和程序性死亡受體4（programmed cell death 4，PDCD4）的相互作用。實(shí)驗(yàn)證明外泌體miRNA-21可直接與PDCD4的3'-UTR結(jié)合，抑制PDCD4活性，從而導(dǎo)致侵襲能力增強(qiáng)。CAF以多種方式對腫瘤的侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移發(fā)揮作用。CAF中的miRNA失調(diào)也可以通過調(diào)節(jié)ECM重塑來介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在鑒定CRC中亞組特異性miRNA和功能基因集的聯(lián)合回歸模型中發(fā)現(xiàn)，某些miRNA可以調(diào)節(jié)ECM靶基因。實(shí)驗(yàn)證明，外泌體中miRNA-19、miRNA-17和miRNA-200c的高表達(dá)可以在蛋白質(zhì)水平調(diào)節(jié)ECM靶基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)ECM重塑從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲力。相關(guān)研究表明，纖溶酶原激活劑抑制劑-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）作為一種分泌蛋白，是CAF與上皮腫瘤細(xì)胞間串?dāng)_的重要中介物，可觸發(fā)上皮樣腫瘤細(xì)胞的生長和極性變化。而miRNA-200b、c/NF-κB軸可借由增加PAI-1的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生極性消失，例如E-鈣黏蛋白減少和波形蛋白增加，從而增強(qiáng)其侵襲性。通過共培養(yǎng)或異種移植實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，CAF中的其他miRNA也參與體外或體內(nèi)腫瘤的侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移。

3.3 外泌體miRNA激活CRC干性

在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療抵抗中部分細(xì)胞群具有巨大的自我更新和分化潛力，這些細(xì)胞被定義為腫瘤干細(xì)胞，其干性的獲得和維持受到許多因素影響。CAF促進(jìn)干性的能力已被廣泛研究，但CAF衍生miRNA在干性調(diào)控中作用的研究相對較少。FBXW7和MOAP1分別是重要的促凋亡腫瘤抑制分子，MOAP1與最主要的凋亡基因

BAX

結(jié)合可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)FBXW7和MOAP1的過表達(dá)可促進(jìn)β-catenin的泛素化降解來抑制WNT/β-catenin途徑并促使線粒體凋亡，最終抑制細(xì)胞干性和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。CAF外泌體miRNA-92a-3p通過靶向抑制FBXW7和MOAP1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞干性和EMT并抑制細(xì)胞凋亡，同時可增強(qiáng)對5-氟尿嘧啶/奧沙利鉑的抗性?？傮w而言，miRNA代表CAF調(diào)節(jié)干性的重要方式，值得進(jìn)行更深入和廣泛的探索。

3.4 外泌體miRNA促進(jìn)CRC耐藥

研究證明，CAF與治療耐藥性和不良預(yù)后密切相關(guān)。CAF可通過多種機(jī)制來增強(qiáng)腫瘤的治療抗性，包括分泌旁分泌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)（如細(xì)胞因子和外泌體）、預(yù)防藥物輸送、重新編程新陳代謝和信號通路的調(diào)節(jié)。miRNA在這些過程中也起著不可替代的作用。在CAF外泌體對卵巢癌順鉑耐藥的探索中發(fā)現(xiàn)CAF衍生的miRNA-98-5p與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）之間存在關(guān)聯(lián)。剔除下游目標(biāo)

CDKN1A

可以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的順鉑耐藥性，增加卵巢癌細(xì)胞的增殖，并減少以前對順鉑敏感細(xì)胞的凋亡。這項(xiàng)研究幫助闡明了CAF通過miRNA-98-5p介導(dǎo)的CDKN1A抑制卵巢癌治療耐藥性的潛在機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)與過度表達(dá)miRNA-21的成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)可以保護(hù)結(jié)直腸癌細(xì)胞免受奧沙利鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并增加這些細(xì)胞的增殖能力。并且在卵巢癌耐藥的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，將CAF轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞的外泌體miRNA-21不僅促進(jìn)細(xì)胞侵襲，而且通過與凋亡酶激活因子結(jié)合抑制細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)紫杉醇耐藥。研究發(fā)現(xiàn)，尾端相關(guān)同源盒2（caudal type homeobox 2，CDX2）/肝素軸在結(jié)腸癌的甲氨蝶呤抗性中起作用，CDX2的過表達(dá)可以降低結(jié)腸癌細(xì)胞對甲氨蝶呤的抗性。在結(jié)腸癌進(jìn)展過程中CAF外泌體miRNA-24-3p通過抑制CDX2對肝素表達(dá)的強(qiáng)化作用，提高了結(jié)腸癌細(xì)胞對甲氨蝶呤的抵抗力。研究表明，在胃癌的背景下，CAF分泌外泌體miRNA-522通過靶向花生四烯酸脂氧合酶15抑制腫瘤細(xì)胞的肥大化，阻斷有毒脂質(zhì)過氧化物的積累，從而防止了肥大化導(dǎo)致的非凋亡性細(xì)胞死亡。

3.5 外泌體miRNA促進(jìn)CRC放療抵抗

為了有效減少局部晚期或播散性CRC患者局部復(fù)發(fā)，非手術(shù)聯(lián)合放射治療越來越受到重視。但CRC細(xì)胞對放療的抵抗力對于患者預(yù)后具有不良影響。CAF衍生的外來體的研究為臨床工作者提供了新的候選目標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，輻照引起G/S期細(xì)胞周期過渡延遲和細(xì)胞凋亡促進(jìn)。叉頭框蛋白A1（fork head box A1，F(xiàn)OXA1）可以與目標(biāo)基因的啟動子結(jié)合，以影響腫瘤細(xì)胞周期。FOXA1的上調(diào)提高了G期細(xì)胞的比例，降低了S期細(xì)胞的比例，并提高了細(xì)胞凋亡率。輻照后，細(xì)胞中FOXA1更為顯著過表達(dá)。FOXA1可以負(fù)調(diào)控TGF-β3的轉(zhuǎn)錄，并防止其轉(zhuǎn)位入核抑制TGF-β信號通路、G/S期細(xì)胞周期過渡。在線分析網(wǎng)站Targetscan揭示了miRNA-93-5p和FOXA1之間存在特定的結(jié)合位點(diǎn)。攜帶外泌體miRNA-93-5p的CAF通過下調(diào)FOXA1促進(jìn)CRC細(xì)胞的化學(xué)抗性。并且在SW620和HCT116細(xì)胞中引入miRNA-145會降低干細(xì)胞和放療的抵抗力。研究證實(shí)，CAF外泌體miRNA-590-3p也在CRC發(fā)展中發(fā)揮作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)氯化物通道附件4（chloride intracellular channel 4，CLCA4）充當(dāng)腫瘤抑制因子，能夠通過抑制磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/絲氨酸/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來阻止膀胱癌細(xì)胞的惡性表型。并且在肝癌的研究中也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CLCA4可通過抑制PI3K/AKT信號通路來預(yù)防疾病的發(fā)展。同時PI3K/AKT信號通路的激活與各種腫瘤的抗輻射能力密切相關(guān)，可見PI3K/AKT途徑的激活導(dǎo)致對多種針對腫瘤的療法產(chǎn)生抵抗力。通過數(shù)據(jù)庫生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，

CLCA4

可能作為miRNA-590-3p的靶基因被抑制，以此增強(qiáng)了CRC細(xì)胞對輻射的抵抗力。因此PI3K途徑抑制劑化療藥物增敏劑也應(yīng)用于臨床。并且另一研究發(fā)現(xiàn)miRNA-590-3p還具有通過直接靶向免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域蛋白1來促進(jìn)人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對放療的抗性能力。

4 CAF中的miRNA作為腫瘤生物標(biāo)志物

盡管近年來，CRC的檢出率不斷提高，然而其早期診斷率僅達(dá)到30%～40%，剩余的一大部分患者錯失了最佳的根治性手術(shù)時機(jī)，導(dǎo)致其預(yù)后不良。所以，有效檢測生物標(biāo)志物無疑將大大有助于腫瘤患者的治療和延長生存時間。因此，除了研究miRNA在CAF與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用外，許多研究已經(jīng)開始考慮CAF外泌體中miRNA作為預(yù)后生物標(biāo)志物的潛能。在對照CRC患者和健康個體的血清外泌體miRNA表達(dá)水平中發(fā)現(xiàn)，與健康個體相比，CRC患者的miRNA-21、miRNA-92a-3p和miRNA-17-5p水平均明顯更高，甚至可將CRC與健康個體準(zhǔn)確區(qū)分開，且在手術(shù)后CRC患者miRNA的表達(dá)水平降低到健康個體水平。并且miRNA-92a-3p和miRNA-17-5p對健康個體與CRC患者進(jìn)行分類中，曲線下面積分別為0.845和0.897。另外，在CRC的癌前病變-腺瘤階段受試者血清中的外泌體miRNA-29a和miRNA-21的表達(dá)水平與健康個體有明顯差異，同時發(fā)生肝轉(zhuǎn)移與CRC原發(fā)性腫瘤患者組織血漿中外泌體miRNA-21表達(dá)水平上調(diào)，且總生存率較低。所以，miRNA作為診斷及評價患者預(yù)后標(biāo)志物的潛力毋庸置疑。

5 小結(jié)

目前研究發(fā)現(xiàn)CAF在CRC的疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。在CAF外泌體相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)miRNA能夠通過腫瘤細(xì)胞間信號通訊促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲、誘導(dǎo)血管生成和代謝重編程。但現(xiàn)有大多數(shù)研究都集中在由單個miRNA介導(dǎo)的單個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的機(jī)制上。實(shí)際上一個miRNA能夠抑制多個基因的表達(dá)，一個靶基因也受多個基因調(diào)控。上述研究缺乏對TME中復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的進(jìn)一步研究，研究結(jié)論僅涉及大型復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的一部分。在臨床治療中利用繁雜的單一目的miRNA抑制劑抑制相關(guān)miRNA表達(dá)和目標(biāo)外泌體的包裝過程，盡管都能取得一定的效果，卻難以提供確切指導(dǎo)。而直接干預(yù)細(xì)胞外泌體的釋放，難免對其他“貨物”的運(yùn)輸產(chǎn)生影響，帶來不良結(jié)局。而且盡管現(xiàn)在未在CRC中明確發(fā)現(xiàn)抑癌CAF外泌體miRNA，但已證實(shí)在胃癌、前列腺癌、乳腺癌等腫瘤背景下，CAF的外泌體釋放可以抑制腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，降低腫瘤細(xì)胞對化學(xué)治療的抗性。同時，CAF既是miRNA的供體，同時腫瘤細(xì)胞所分泌的許多外泌體要發(fā)揮效應(yīng)也需要CAF的參與。因此，在不同種類的腫瘤及其腫瘤相關(guān)細(xì)胞中鑒定最佳的靶標(biāo)miRNA及miRNA群具有重要意義，也是外泌體miRNA應(yīng)用于臨床的最大挑戰(zhàn)。同時，對CAF中miRNA的深入研究不僅是為了設(shè)計針對miRNA的治療方法，也是為了進(jìn)一步了解CAF的性質(zhì)和生物學(xué)特征，并且可能有助于探究針對CAF的其他治療方法。