熊夢琳 吳龍 馬麗 趙今

1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（附屬口腔醫(yī)院）牙體牙髓科 烏魯木齊830054；2.新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所 烏魯木齊830054

造成口腔骨組織缺損的疾病有很多，例如頜 面部創(chuàng)傷或者感染、骨髓炎及腫瘤等。牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）是一種來源于牙髓組織的具有高度增殖能力及多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，可分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，是組織工程牙再生、骨再生研究中極具潛能的細(xì)胞，可參與牙髓的再生修復(fù)[1]。加快誘導(dǎo)DPSCs增殖和成骨向分化，可縮短骨缺損的修復(fù)時間。轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是通過細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞活動的一類多肽因子，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3均屬于TGF-β家族成員，在骨形成中起重要作用[2]。已有研究[3]表明：TGF-β1過表達(dá)可增加DPSCs的增殖及成骨分化。還有學(xué)者[4]發(fā)現(xiàn)：骨折愈合者血清TGF-β1的濃度高于骨折不愈合者，提示TGF-β1對骨折的愈合有益。TGF-β3對于細(xì)胞的增殖、分化、代謝等起著至關(guān)重要的作用[5]，可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和成骨能力，還可促進(jìn)DPSCs成骨向分化[6-7]。TGF-β2也是TGF-β家族的重要一員，和血管內(nèi)皮生長因子一起可提高骨缺損區(qū)組織的再生[8]。然而目前TGF-β2對DPSCs增殖及成骨分化的影響尚未清楚，本實(shí)驗(yàn)旨在通過探索TGF-β2對DPSCs增殖及成骨分化的影響，為修復(fù)牙髓組織，促進(jìn)牙骨再生提供新的方法和思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胰蛋白酶、青鏈霉素（美國Sigma公司）；β甘油磷酸鈉、地塞米松（武漢博士德生物工程有限公司）；TGF-β2（北京孚博生物科技有限公司）；四甲基偶氮唑鹽比色法（tetramethylazoazole colorimetric method，MTT）試劑盒（上海晶抗生物工程有限公司）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性測定試劑盒（美國Sciencell公司）；二辛可寧酸（bicinchoninicacid，BCA）試劑盒（上海聯(lián)碩生物科技有限公司）；Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）和骨橋蛋白（osteopontin，OPN）多克隆抗體（上海信裕生物科技有限公司）；DAB底物顯色試劑盒、蘇木素染色液（上?？道噬锟萍加邢薰荆?；Thermo FC酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 DPSCs分離、培養(yǎng)與鑒定

收集臨床15～28歲因正畸需要或阻生而拔除的健康完整牙齒，去除表面牙周組織后立即置于預(yù)冷的含雙抗的低糖無血清DMEM培養(yǎng)液中，于無菌條件下沖洗數(shù)遍，劈開牙冠并迅速取出牙髓并剪去根尖1/3，然后用低糖無血清DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗干凈，剪成1 mm3大小的碎塊，加入5 mL 2.5%的胰蛋白酶，37℃消化30 min，加入含血清培養(yǎng)液終止消化，去除多余水分，將消化后的組織塊平鋪于含有15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶底部，瓶底向上，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，組織塊貼壁后翻轉(zhuǎn)瓶底，靜置培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底80%左右時用胰酶消化，按1∶1首次傳代，以后按1∶3傳代。取第4代培養(yǎng)3 d的細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

取第4代DPSCs，隨機(jī)分為陰性對照組、陽性對照組、TGF-β2組。陰性對照組用含10%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，陽性對照組用含10%胎牛血清培養(yǎng)液+10 mmol·L-1β甘油磷酸鈉+10 mol·L-1地塞米松+50 mg·L-1維生素C培養(yǎng)，TGF-β2組用含10%胎牛血清培養(yǎng)液+80 ng·mL-1TGF-β2培養(yǎng)。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞活力

取陰性對照組、陽性對照組、TGF-β2組DPSCs，以每孔5×104個細(xì)胞的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別培養(yǎng)1、3、7、10 d（每個時間點(diǎn)設(shè)3個復(fù)孔）后，每孔加入20μL MTT，繼續(xù)孵育4 h后棄去上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），振蕩反應(yīng)10 min使沉淀溶解，用酶標(biāo)儀于波長490 nm處檢測光密度（optical density，OD）值。

1.5 ALP活性測定試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)ALP活性

取陰性對照組、陽性對照組、TGF-β2組DPSCs，以每孔5×104個細(xì)胞的密度接種于24孔板中，分別培養(yǎng)1、3、7、10 d（每個時間點(diǎn)設(shè)3個復(fù)孔）后，加入體積分?jǐn)?shù)為1%的Triton-X100 120μL，反復(fù)凍融，充分裂解，裂解后用PBS清洗2遍，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液按試劑盒說明書進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀520 nm波長處測定OD值。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測Runx2、BSP和OPN蛋白表達(dá)

陰性對照組、陽性對照組、TGF-β2組DPSCs培養(yǎng)10 d后提取總蛋白，BCA試劑盒定量后將蛋白變性，取30μg蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，再分別加入一抗（1∶500），4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗（1∶2000）室溫孵育2 h，TBST洗滌，用ECL發(fā)光液顯影，用ChemiDoc XRS+系統(tǒng)成像，Quantity One軟件測定各組蛋白條帶灰度值，蛋白相對表達(dá)水平=目的條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Runx2免疫組織化學(xué)染色檢測

取陰性對照組、陽性對照組、TGF-β2組DPSCs，以每孔1×104個細(xì)胞的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)10 d后用4%多聚甲醛室溫固定30 min，5%胎牛血清封閉30 min，加入Runx2多克隆抗體（1∶300），4℃孵育過夜，加入二抗孵育1 h，然后DAB顯色，蘇木素染色2 min，自來水沖洗后倒置顯微鏡下觀察拍照，用ImagePro Plus軟件分析Runx2表達(dá)的陽性單位（positive unit，PU），每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牙髓干細(xì)胞生長狀態(tài)

通過酶消化法分離獲得DPSCs，傳至第4代，生長3 d后觀察其細(xì)胞形態(tài)，大多數(shù)細(xì)胞為長梭形或多角形，胞體豐滿，胞質(zhì)均勻（圖1）。選擇本代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 第4代DPSCs培養(yǎng)3 d的細(xì)胞形態(tài) 倒置熒光顯微鏡 ×200Fig 1 Cell morphology of the fourth-generation DPSCs on day 3 inverted fluorescence microscope×200

2.2 TGF-β2對DPSCs增殖的影響

陰性對照組、陽性對照組、TGF-β2組細(xì)胞培養(yǎng)1、3、7、10 d后進(jìn)行細(xì)胞活力檢測，結(jié)果見表1。培養(yǎng)1 d后各組細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；隨著時間延長，細(xì)胞活力升高，陽性對照組細(xì)胞活力高于陰性對照組（P＜0.05），同時低于TGF-β2組（P＜0.05）。

表1 TGF-β2對DPSCs增殖的影響Tab 1 Effect of TGF-β2 on the proliferation of DPSCss，n=3

表1 TGF-β2對DPSCs增殖的影響Tab 1 Effect of TGF-β2 on the proliferation of DPSCss，n=3

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05；與陽性對照組比較，#P＜0.05。

培養(yǎng)時間/d 1 3 7 10 OD490陰性對照組0.31±0.02 0.47±0.02 0.77±0.05 1.13±0.03陽性對照組0.30±0.06 0.65±0.03*1.35±0.08*1.53±0.08*TGF-β2組0.38±0.03 0.68±0.07*#1.75±0.08*#1.82±0.06*#F值0.951 18.600 144.050 103.170 P值0.438 0.003＜0.000 1＜0.000 1

2.3 TGF-β2對DPSCs ALP活性的影響

陰性對照組、陽性對照組、TGF-β2組細(xì)胞培養(yǎng)1、3、7、10 d后ALP活性檢測結(jié)果見表2。培養(yǎng)1 d后，各組細(xì)胞內(nèi)ALP活性的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；隨著時間延長，細(xì)胞內(nèi)ALP的活性總體上調(diào)，陽性對照組細(xì)胞內(nèi)ALP活性高于陰性對照組（P＜0.05），同時低于TGF-β2組（P＜0.05）。

表2 TGF-β2對DPSCs ALP活性的影響Tab 2 Effect of TGF-β2 on ALPactivity of DPSCs xˉ±s，n=3

2.4 TGF-β2對DPSCs Runx2、BSP和OPN蛋白表達(dá)的影響

陰性對照組、陽性對照組、TGF-β2組細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)10 d后檢測成骨分化蛋白表達(dá)，結(jié)果見圖2和表3。陽性對照組Runx2、BSP和OPN蛋白表達(dá)水平高于陰性對照組（P＜0.05），同時低于TGF-β2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 TGF-β2對DPSCs Runx2、BSP和OPN蛋白表達(dá)的影響Tab 3 Effect of TGF-β2 on the expression of Runx2,BSPand OPN protein of DPSCs xˉ±s，n=3

圖2 DPSCs中Runx2、BSP和OPN蛋白的表達(dá)Fig 2 Runx2,BSPand OPN protein expression of DPSCs

2.5 DPSCs Runx2免疫組織化學(xué)染色

陰性對照組、陽性對照組、TGF-β2組細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)10 d后進(jìn)行Runx2免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果見 圖3，其PU值 分 別 為7.19±0.41、10.78±0.78、12.72±0.76（F=51.98，P＜0.000 2）。陽性對照組Runx2陽性表達(dá)單位高于陰性對照組（P＜0.05），同時低于TGF-β2組（P＜0.05）。

圖3 DPSCs中Runx2的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色 ×200Fig 3 Runx2 expression of DPSCs immunohistochemical staining ×200

3 討論

DPSCs具有多向分化潛能，一定條件下可以分化為成骨細(xì)胞，在組織再生與修復(fù)研究中具有潛在作用[9]。本實(shí)驗(yàn)通過酶消化法分離培養(yǎng)人DPSCs，培養(yǎng)第4代生長3 d，大多數(shù)細(xì)胞為長梭形或多角形，胞體豐滿，胞質(zhì)均勻，說明DPSCs分離成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

TGF-β可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化，對骨改建和骨形成具有重要作用[10]。TGF-β3對DPSCs成骨向分化具有促進(jìn)作用，TGF-β3聯(lián)合DPSCs可有效促進(jìn)種植體的骨結(jié)合[11]。TGF-β2可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化[12]。本實(shí)驗(yàn)采用TGF-β2處理DPSCs，結(jié)果顯示：陰性對照組、陽性對照組、TGF-β2組細(xì)胞誘導(dǎo)1 d后各組細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），誘導(dǎo)3、7、10 d后，陽性對照組細(xì)胞活力高于陰性對照組，TGF-β2組細(xì)胞活力高于陽性對照組，該結(jié)果提示TGF-β2可促進(jìn)DPSCs增殖。

ALP是反應(yīng)骨組織中分解代謝水平的一種標(biāo)志酶，在組織鈣化中起著重要作用，其活性在一定程度上可反應(yīng)成骨細(xì)胞的分化程度和功能狀態(tài)[13]。Runx2、BSP、OPN在細(xì)胞分化過程的不同時期形成，可反映DPSCs的成骨能力。Runx2是Runt相關(guān)基因家族成員之一，是成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞形成過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在成骨分化早期起促進(jìn)作用，可調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[14]。BSP是一種高度磷酸化和糖基化的分泌性蛋白，具有促進(jìn)骨的形成及分化，以及成骨細(xì)胞的趨化、黏附等功能，是成骨細(xì)胞礦化的標(biāo)志[15]。OPN是一種分泌型的磷酸化糖蛋白，在骨礦化、代謝、重建中扮演重要角色，可促進(jìn)DPSCs向成骨細(xì)胞分化[16-17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：陰性對照組、陽性對照組、TGF-β2組細(xì)胞誘導(dǎo)1 d后各組細(xì)胞內(nèi)ALP活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），誘導(dǎo)3、7、10 d后，陽性對照組細(xì)胞內(nèi)ALP活性高于陰性對照組，TGF-β2組細(xì)胞內(nèi)ALP活性高于陽性對照組（P＜0.05）。各組細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)10 d后，陽性對照組細(xì)胞內(nèi)Runx2、BSP和OPN蛋白表達(dá)水平高于陰性對照組，TGF-β2組內(nèi)細(xì)胞3種蛋白表達(dá)水平高于陽性對照組。以上結(jié)果表明：TGF-β2具有促進(jìn)DPSCs向成骨細(xì)胞分化的能力。由此可以看出，TGF-β2可促進(jìn)牙髓干細(xì)胞增殖和向成骨細(xì)胞分化，為臨床上骨缺損疾病的治療提供了新的方法和思路。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。