李 超， 張凌宇， 路 加， 張沛東

(海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué))， 山東 青島 266003)

海草床作為近岸三大典型海洋生態(tài)系統(tǒng)之一，擁有極強(qiáng)的固碳能力，其固碳速率高達(dá)83 g·m-2·a-1，約為森林的20倍，每年的固碳總量約占海洋總固碳量的三分之一[1-2]。海草床還具有加速顆粒物沉降、吸收和封存重金屬、防風(fēng)固堤等重要的生態(tài)作用，以及為眾多海洋動物提供產(chǎn)卵、育幼和索餌等優(yōu)良棲息地的資源養(yǎng)護(hù)作用[3-4]。然而受自然環(huán)境變化和人類活動影響，自1980年以來全球范圍內(nèi)超過30%的海草床已完全退化，我國海草床的狀況也不容樂觀，海南南部、廣州合浦地區(qū)及山東半島的桑溝灣、芙蓉島等海區(qū)的海草床退化面積超過1 300 ha[5-6]。目前海草床的退化速率達(dá)到7%·a-1，是其自然再生速率的30倍，因此僅靠海草的自然生長已無法達(dá)到海草床自然恢復(fù)的目的[7]。

種子播種法是一種適用于規(guī)?；瘜?shí)踐的海草床修復(fù)方法，主要通過種子撒播、掩埋或經(jīng)人工培養(yǎng)成幼苗后移栽到海區(qū)等措施達(dá)到恢復(fù)或構(gòu)建海草床的目的，具有成本低、受限小，不易對供體海草床造成破壞，能夠增加遺傳多樣性等優(yōu)點(diǎn)[8]。種子播種法主要包括種子采集、保存和播種等環(huán)節(jié)，其中種子保存是種子播種法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。與陸生植物不同，海草屬于高等水生植物，其種子的保存需要浸泡在海水中，極易出現(xiàn)提前萌發(fā)、活力下降等問題。休眠是種子應(yīng)對外界環(huán)境變化的重要方式，有研究表明大部分的海草種子均有休眠期，但其休眠期從幾周到幾年不等[9-10]。因此，可以通過延長種子休眠，在維持種子活力的基礎(chǔ)上抑制種子萌發(fā)，有效解決儲存過程中種子質(zhì)量下降的問題，為規(guī)模化海草床修復(fù)提供理論基礎(chǔ)。

對陸生植物的研究顯示，比較有效的延長種子休眠方法主要有高滲保存法、超低溫保存法和抑制劑保存法。高滲保存法是指通過外部鹽離子的添加使種子處于高滲透壓的環(huán)境中，抑制種子吸收水分，從而延長種子休眠，該方法成本較低但由于離子作用易使種子失活，所以應(yīng)用范圍較窄[11]。超低溫保存法是指將種子保存在-196 ℃的超低溫環(huán)境中，從而達(dá)到延長休眠及種質(zhì)保護(hù)的作用，該方法操作簡單，能實(shí)現(xiàn)種子長期保存，但成本較高，僅適合少量種子的長期保存[12]。抑制劑保存法是指通過添加萌發(fā)抑制劑延長種子休眠，該方法操作簡單、成本低，效果好，適合大批量種子的保存，是目前最常用的延長種子休眠方法，其中脫落酸(Abscisic acid, ABA)是常用的抑制劑之一[13]。

ABA是植株體內(nèi)的重要激素，主要存在于胚及胚乳中，具有調(diào)節(jié)種子休眠的作用[14]。對水稻(Oryzasativa)種子的研究發(fā)現(xiàn)，外源添加ABA能夠在保持種子活力的前提下調(diào)節(jié)種子的休眠時(shí)間，其中低濃度ABA(0～20 mg·L-1)將打破水稻種子休眠，而高濃度ABA(20～90 mg·L-1)能夠延長種子休眠[13-14]。以此為基礎(chǔ)，Hong等[15]對秋茄(Kandeliacandel)的研究發(fā)現(xiàn)，高濃度ABA能夠顯著延長秋茄種子的休眠時(shí)間，其中ABA濃度為120和150 mg·L-1時(shí)延長效果顯著。目前，有關(guān)外源ABA對海草種子休眠時(shí)間調(diào)節(jié)作用的研究尚未見報(bào)道，促使海草種子延長休眠的適宜ABA濃度范圍亦不清楚。因海草與紅樹同屬濱海高等植物，因此推測高濃度ABA可能促進(jìn)海草種子延長休眠。

為驗(yàn)證該假設(shè)，本研究以我國溫帶海域海草優(yōu)勢種——鰻草(Zosteramarina)為對象，分別設(shè)置濃度為0(對照)、3、15、30和300 mg·L-1的ABA處理組，通過綜合分析種子休眠延長期的種子萌發(fā)率和種子活力以及去休眠時(shí)種子的再萌發(fā)率，查明外源ABA對鰻草種子延長休眠的影響，明確促進(jìn)鰻草種子延長休眠的適宜ABA濃度范圍；并通過各時(shí)期種子水分、可溶性糖及淀粉等內(nèi)部貯存物質(zhì)含量的測定與分析，弄清鰻草種子應(yīng)對外源ABA作用的營養(yǎng)物質(zhì)響應(yīng)過程，以期為鰻草種質(zhì)長期保存及其種子修復(fù)理論與技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用鰻草種子于2019年7月采集于山東省榮成市天鵝湖海域(37°20′18″N —37°21′32″N, 122°33′18″E—122°34′45″E，見圖1)。在鰻草分布較多的區(qū)域采集生殖枝，將佛焰苞摘下后放入網(wǎng)目孔徑為1.0 mm的尼龍網(wǎng)袋中，置于自然海域1個(gè)月。待種子成熟脫落后，移入處理箱中加入海水?dāng)嚢?，除去上層有機(jī)碎屑及貝殼等雜質(zhì)，收集至廣口瓶中帶回實(shí)驗(yàn)室，于4 ℃、鹽度30的海水中保存。為減少真菌的生成，保存期間每兩天換水一次。

圖1 種子采集地點(diǎn)Fig.1 Seed collection site

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以陸生植物及紅樹種子延長休眠常用的ABA濃度為基礎(chǔ)[13-15]，設(shè)置5個(gè)不同ABA濃度處理組：0(對照)、3、15、30和300 mg·L-1。將25 mg ABA粉末溶于0.5 mL甲醇，無菌水定容至20 mL配置成濃度為1 250 mg·L-1的ABA母液。通過計(jì)算，取0、2.4、12、24和240 mL ABA母液分別加入1 000、997.6、988、976和760 mL海水中配置成上述5種不同ABA濃度的海水。采用高效液相色譜法(HPLC)測定海水中的ABA濃度，確保海水中ABA的實(shí)際濃度與計(jì)算一致。

1.3 實(shí)驗(yàn)過程

從種子中挑選顆粒飽滿、縱肋清晰、褐色或墨綠色的成熟種子45 000粒，平均分為45組，分別置于500 mL燒杯中，每組為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理組含9個(gè)重復(fù)。向各燒杯中添加300 mL相應(yīng)ABA濃度的海水，然后隨機(jī)置于光照培養(yǎng)箱(GXZ-0288，寧波江南儀器廠)的載物托架上，于15 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)90 d。為了保證海水中ABA濃度恒定，每天以相同ABA濃度的海水對燒杯中的海水進(jìn)行替換。

1.4 樣品采集與測定

各處理組的取樣流程如圖2所示。實(shí)驗(yàn)總周期為90 d，實(shí)驗(yàn)期間每天對萌發(fā)的種子進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算萌發(fā)率。每隔30 d進(jìn)行1次取樣，取樣時(shí)從每個(gè)燒杯中隨機(jī)挑選100粒種子，每個(gè)處理組共計(jì)挑選900粒種子，從中隨機(jī)挑選200粒，平均分成2份，分別用于種子活力及再萌發(fā)率的測定。種子活力的測定采用四唑法[16]。種子再萌發(fā)率測定時(shí)，將種子置于15 ℃、鹽度15的海水中進(jìn)行30 d的去休眠，每天統(tǒng)計(jì)萌發(fā)的種子數(shù)，計(jì)算萌發(fā)率。萌發(fā)率及種子活力的計(jì)算方法如下：

圖2 實(shí)驗(yàn)流程圖Fig.2 Flowchart of experiment

萌發(fā)率=萌發(fā)的種子數(shù)/種子總數(shù)×100%；

種子活力=被染色種胚數(shù)/種子總數(shù)×100%。

樣品中剩余的700粒種子，用于種子內(nèi)部儲藏物質(zhì)的測定。其中水分含量的測定采用烘干法[17]，可溶性糖及淀粉含量的測定采用蒽酮法[18]，可溶性蛋白含量的測定采用凱氏定氮法[19]，α-淀粉酶活力的測定采用碘-淀粉比色法[20]，每組樣品的同一指標(biāo)重復(fù)測定3次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對所有指標(biāo)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，將方差不齊的指標(biāo)進(jìn)行對數(shù)或開根號轉(zhuǎn)換，使其滿足方差齊性。然后對所有指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05作為顯著差異水平，以P<0.01作為極顯著差異水平，利用Duncan多重比較分析組間差異。采用R語言FactoMineR包對萌發(fā)率、種子活力和再萌發(fā)率等生態(tài)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行PCA分析，Corrplot包對種子的可溶性糖、淀粉和水分含量等生理學(xué)指標(biāo)進(jìn)行Speraman相關(guān)性分析。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行，分析結(jié)果使用OriginLab 2020b、R語言進(jìn)行繪圖。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 休眠延長期的種子萌發(fā)率

各處理組鰻草種子的累積萌發(fā)率隨時(shí)間延長呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，至90 d時(shí)達(dá)到最大值 (見圖3)。單因素方差分析表明，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，30和300 mg·L-1處理組的種子累積萌發(fā)率顯著低于其它處理組，分別僅為對照組的41%和51%(P<0.05)，而15 mg·L-1處理組累積萌發(fā)率最高，是對照組的1.1倍。

圖3 不同ABA濃度對鰻草種子萌發(fā)率的影響Fig.3 The effect of different ABA concentrations on the germination rate of eelgrass seed

2.2 休眠延長期的種子活力

各處理組鰻草種子的種子活力隨時(shí)間推移呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(見圖4)。單因素方差分析表明，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，30 mg·L-1處理組種子活力最高，顯著高于其它處理組(P<0.05)，為對照組的1.4倍；3和15 mg·L-1處理組種子活力較低，與對照組無顯著差異(P>0.05)。

圖4 不同ABA濃度對鰻草種子活力的影響Fig.4 The effect of different ABA concentrations on the seed vigor of eelgrass

2.3 去休眠的種子再萌發(fā)率

各處理組鰻草種子的再萌發(fā)率隨時(shí)間延長呈現(xiàn)下降趨勢(見圖5)。單因素方差分析表明，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，30 mg·L-1處理組的再萌發(fā)率最高，顯著高于其它處理組，為對照組的2.8倍。15 mg·L-1處理組的再萌發(fā)率最低，顯著低于其它處理組(P<0.05)，僅為對照組的20%。

圖5 不同ABA濃度對鰻草種子再萌發(fā)率的影響Fig.5 The effect of different ABA concentrations on the seed regermination rate of eelgrass

2.4 種子萌發(fā)和種子活力的PCA分析

對各處理組萌發(fā)率、種子活力和再萌發(fā)率進(jìn)行PCA分析，結(jié)果顯示第一排序軸的特征值大于1，對各指標(biāo)的解釋量高達(dá)93.2%(見圖6)。種子活力、再萌發(fā)率與第一排序軸聚成一簇，呈正相關(guān)關(guān)系，萌發(fā)率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。對各指標(biāo)進(jìn)行排序后發(fā)現(xiàn)30 mg·L-1處理組對種子延長休眠的效果較好，期間種子萌發(fā)率最低，而種子活力和再萌發(fā)率最高。

(Gr為萌發(fā)率；Ga為再萌發(fā)率；Sv為種子活力。Gr is germination rate; Ga is regermination rate; Sv is seed vigor.)圖6 不同ABA濃度與鰻草種子各指標(biāo)的排序圖Fig.6 Sequence diagram of different ABA concentrations and various indexes of eelgrass seeds

2.5 休眠延長期的種子水分含量

各處理組鰻草種子的水分含量隨時(shí)間推移總體呈上升趨勢，至90 d時(shí)達(dá)到最大值，其中30 和300 mg·L-1處理組種子水分含量上升不明顯(見圖7)。單因素方差分析表明，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，30和300 mg·L-1處理組鰻草種子的種子水分含量最低，顯著低于其它處理組(P<0.05)，分別為對照組的88%和91%，而3和15 mg·L-1處理組水分含量最高，與對照組無顯著差異(P>0.05)。

圖7 不同ABA濃度對鰻草種子水分含量的影響Fig.7 The effect of different ABA concentrations on the water content of eelgrass seeds

2.6 休眠延長期的種子可溶性糖含量

0、3和15 mg·L-1處理組鰻草種子的可溶性糖含量隨時(shí)間延長呈上升趨勢，而30和300 mg·L-1處理組鰻草種子的可溶性糖含量隨時(shí)間延長呈現(xiàn)下降趨勢(見圖8)。單因素方差分析表明，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，30 mg·L-1處理組可溶性糖含量最低，顯著低于其它處理組(P<0.05)，為對照組的78%，15 mg·L-1處理組的可溶性糖含量最高，顯著高于其它處理組(P<0.05)，為對照組的1.1倍。

圖8 不同ABA濃度對鰻草種子可溶性糖含量的影響Fig.8 The effect of different ABA concentrations on the soluble sugar content of eelgrass seeds

2.7 休眠延長期的種子淀粉含量

30和300 mg·L-1處理組鰻草種子的淀粉含量隨時(shí)間延長呈上升趨勢，而0、3和15 mg·L-1處理組鰻草種子的淀粉含量隨時(shí)間延長呈下降趨勢(見圖9)。單因素方差分析表明，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，30 mg·L-1處理組淀粉含量最高，顯著高于其它處理組(P<0.05)，為對照組的1.2倍，15 mg·L-1處理組的淀粉含量最低，顯著低于其它處理(P<0.05)，為對照組的90%。

圖9 不同ABA濃度對鰻草種子淀粉含量的影響Fig.9 The effect of different ABA concentrations on the starch content of eelgrass seeds

2.8 休眠延長期的種子α-淀粉酶活性

休眠延長期內(nèi)30和300 mg·L-1處理組鰻草種子的α-淀粉酶活性隨時(shí)間延長呈現(xiàn)下降趨勢，而 0、3和15 mg·L-1處理組鰻草種子的α-淀粉酶活性隨時(shí)間延長呈上升趨勢(見圖10)。單因素方差分析表明，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，30 mg·L-1處理組α-淀粉酶活性最低，顯著低于其它處理組(P<0.05)，為對照組的72%，15 mg·L-1處理組α-淀粉酶活性最高，顯著高于其它處理(P<0.05)，為對照組的1.3倍。

圖10 不同ABA濃度對鰻草種子α-淀粉酶活性的影響Fig.10 The effect of different ABA concentrations on the α-amylase activity of eelgrass seeds

2.9 休眠延長期的種子可溶性蛋白含量

休眠延長期內(nèi)30和300 mg·L-1處理組鰻草種子的可溶性蛋白含量隨時(shí)間延長呈現(xiàn)上升趨勢，而0、3和15 mg·L-1處理組鰻草種子的淀粉含量隨時(shí)間延長呈現(xiàn)下降趨勢(見圖11)。單因素方差分析表明，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，30 mg·L-1處理組可溶性蛋白含量最高，顯著高于其它處理組(P<0.05)，為對照組的1.6倍，15 mg·L-1處理組淀粉含量最低，與對照組無顯著差異(P>0.05)。

圖11 不同ABA濃度對鰻草種子可溶性蛋白含量的影響Fig.11 The effect of different ABA concentrations on the soluble protein content of eelgrass seeds

2.10 相關(guān)性分析

將萌發(fā)率、種子活力等生態(tài)學(xué)指標(biāo)與水分含量、淀粉含量等生理學(xué)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)萌發(fā)率、種子活力及再萌發(fā)率與植株體內(nèi)各類營養(yǎng)物質(zhì)均有顯著相關(guān)性，其中與水分含量的相關(guān)性最強(qiáng)(見圖12)。結(jié)果顯示，水分與萌發(fā)率、種子活力呈極顯著正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)均大于0.9)，與再萌發(fā)率呈極顯著負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)小于-0.9)。綜合顯示，水分含量是延長鰻草種子休眠的關(guān)鍵因素，其對種子的萌發(fā)率與再萌發(fā)率，以及種子活力均有顯著影響。

(Mc代表水分含量(%)，Aa代表α-淀粉酶活性活性(%)，Gr代表萌發(fā)率 (%)，Sc代表可溶性糖含量(%)，Sv代表種子活力(%)，Sp代表可溶性蛋白(%)，Ga代表再萌發(fā)率(%)，St代表淀粉含量(%)。代表差異顯著，代表差異極顯著。Mc represents moisture content(%); Aa represents α-amylase activity(%); Gr represents germination rate(%); Sc represents soluble sugar content(%); Sv represents seed vigor(%); Sp represents soluble protein(%); Ga represents regermination rate(%); St represents starch content(%). represents significant difference,and represents very significant difference.)圖12 鰻草種子萌發(fā)的生態(tài)學(xué)指標(biāo)與生理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性分析Fig.12 Correlation analysis of ecological and physiological indexes of seed germination in eelgrass

3 討論

3.1 外源ABA對海草種子延長休眠的促進(jìn)作用

外源ABA的添加能有效抑制種子萌發(fā)，延長種子休眠時(shí)間，但休眠的延長效果受外源ABA濃度影響顯著。大量研究表明，低濃度ABA將打破種子休眠，而高濃度ABA將延長種子休眠[13-15, 21]。Hong等[15]研究發(fā)現(xiàn)，150 mg·L-1的ABA能顯著延長秋茄種子的休眠時(shí)間，休眠延長期內(nèi)高濃度組(150 mg·L-1)的種子成熟度僅為對照組的60%。黃益洪等[22]研究發(fā)現(xiàn)，白小麥(Triticumaestivum)種子經(jīng)80～100 mg·L-1ABA溶液浸泡后，種子的休眠時(shí)間顯著延長，延長休眠期種子萌發(fā)率僅為對照組的42%。周述波[23]研究發(fā)現(xiàn)，ABA濃度為70～110 mg·L-1時(shí)能顯著延長水稻種子的休眠時(shí)間，休眠延長期內(nèi)，種子萌發(fā)率僅為對照組的40%。本研究也發(fā)現(xiàn)高濃度ABA(30和300 mg·L-1)的添加能夠有效延長鰻草種子的休眠時(shí)間，從而驗(yàn)證了高濃度ABA能夠促進(jìn)鰻草種子延長休眠的假設(shè)。其中ABA濃度為30 mg·L-1的休眠延長效果最好，延長休眠期間種子的累積萌發(fā)率僅為對照組的37%，種子活力和再萌發(fā)率為對照組的1.4和2.8倍。該ABA濃度顯著低于陸生植物和紅樹植物種子延長休眠所需的ABA濃度，這可能是由于種子保存方式的不同。Chen等[24]對秋茄的研究發(fā)現(xiàn)，海水浸泡對種子內(nèi)部的ABA含量具有顯著影響，其與浸泡時(shí)間呈正比。鰻草種子需要浸泡在海水中保存，種子內(nèi)部的ABA含量高于陸生植物和紅樹植物種子的ABA含量，因此對外源ABA的需求濃度可能更低。

3.2 休眠延長期海草種子內(nèi)部貯存物質(zhì)響應(yīng)過程

萌發(fā)是指種子打破休眠，胚芽突破種皮向外伸展的過程。萌發(fā)時(shí)種子需大量吸水，從而活躍細(xì)胞內(nèi)的生理生化過程。此時(shí)種子吸水膨脹，種子內(nèi)部的水分含量增加[25]。同時(shí)淀粉酶將淀粉分解為可溶性糖，為種子萌發(fā)提供能量，種子內(nèi)部淀粉含量下降，可溶性糖含量升高[26]。蛋白質(zhì)能夠維持種子活力，提高種子的萌發(fā)潛力，也是種子萌發(fā)過程中不可缺少的物質(zhì)，萌發(fā)過程中蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下分解為氨基酸，為幼苗建植提供物質(zhì)基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)含量顯著降低。

對陸生植物來講，ABA主要通過抑制α-淀粉酶活性來延長種子休眠。雍太文[13]通過70 mg·L-1的ABA溶液浸泡水稻種子發(fā)現(xiàn)，水稻種子內(nèi)部的α-淀粉酶活性與對照組相比降低了90%以上，可溶性糖含量降低61.3%，可溶性蛋白含量增加37.1%。本研究發(fā)現(xiàn)，ABA對鰻草種子的延長休眠作用，是多種因素共同作用的結(jié)果，其中水分含量是主要因素。外源ABA的添加能夠抑制種子的吸脹作用，降低種子的水分含量，與對照組相比ABA濃度為30 mg·L-1處理組種子含水量在90 d內(nèi)降低12%。造成該差異的主要原因可能是種子內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)的合成方式不同，在萌發(fā)初期，鰻草種子內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)的合成需要溶解在水中，對水分的需求量高于陸地植物，所以抑制種子吸水更能延長種子休眠。ABA的添加還能夠通過降低α-淀粉酶活性，減緩淀粉的分解速率，降低可溶性糖含量，提升可溶性蛋白含量來達(dá)到延長休眠的目的，具體過程如圖13所示。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，30 mg·L-1處理組的α-淀粉酶活性及可溶性糖含量分別降低18%和22%，淀粉含量升高20%，可溶性蛋白含量升高60%。

圖13 ABA處理下鰻草種子內(nèi)部生理響應(yīng)示意圖Fig.13 Schematic diagram of internal physiological response of eelgrass seeds to ABA treatment

4 結(jié)語

本研究通過設(shè)置不同濃度脫落酸(ABA)處理組，探究了外源ABA對延長鰻草種子休眠的作用，分析了鰻草種子應(yīng)對外源ABA的生理響應(yīng)過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15 ℃、黑暗條件下，30 mg·L-1外源ABA的添加能夠顯著延長鰻草種子的休眠時(shí)間。休眠延長期間，鰻草種子吸脹作用減弱，種子內(nèi)部水分含量上升不明顯，α-淀粉酶活性降低，淀粉轉(zhuǎn)化速率減緩，可溶性糖含量降低，淀粉和可溶性蛋白含量上升。由于外源ABA對種子延長休眠的作用不僅受濃度影響，還與光照和溫度等外界環(huán)境因素密切相關(guān)，因此未來的研究還需進(jìn)一步探究光照和溫度等環(huán)境因子對ABA延長休眠的影響。